Un metodo innovativo di isolamento endosomico da tessuti cardiaci di topo e co-coltura con cardiomiociti

Sommario

Gli endosomi sono un insieme di organelli di smistamento intracellulare che fanno parte della via di trasporto della membrana endocitica. Abbiamo stabilito un nuovo metodo per isolare gli endosomi dal tessuto cardiaco utilizzando un'apparecchiatura di nanofiltrazione automatica e abbiamo studiato l'assorbimento cellulare degli endosomi co-coltivandoli con i cardiomiociti primari.

Abstract

Gli endosomi sono organelli legati alla membrana che svolgono un ruolo essenziale nel traffico intracellulare, nella trasduzione del segnale e nel riciclaggio della membrana. Sebbene le loro funzioni nella biologia cardiovascolare stiano guadagnando riconoscimento, l'isolamento efficiente degli endosomi dal tessuto cardiaco rimane una sfida tecnica significativa. Abbiamo sviluppato un protocollo rapido e ad alto rendimento per isolare gli endosomi dal tessuto cardiaco di topo combinando il frazionamento subcellulare con una piattaforma di isolamento di nanofiltrazione ultraveloce. Questo metodo include la centrifugazione sequenziale, la nanofiltrazione e il recupero delle vescicole basato su membrane nanoporose. Gli endosomi isolati sono stati caratterizzati mediante western blotting, diffusione dinamica della luce (DLS) e analisi di citometria a nanoflusso (NanoFCM). Per valutare la bioattività, gli endosomi purificati sono stati co-coltivati con cardiomiociti neonatali primari. I marcatori endosomiali EEA1 e Rab7 erano altamente arricchiti in vescicole isolate. L'analisi DLS ha rivelato un diametro medio delle vescicole di 187,30 ± 23,42 nm e un potenziale zeta di -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). La quantificazione con nanoFCM ha prodotto circa 1,07 ± 0,31 × 10¹² particelle/mL (n = 12) da 100 mg di tessuto cardiaco. L'assorbimento funzionale degli endosomi da parte dei cardiomiociti è stato osservato dopo la co-coltura in vitro , indicando la conservazione dell'integrità e dell'attività delle vescicole. Questa piattaforma di isolamento integrata fornisce un metodo riproducibile ed efficiente per l'estrazione di endosomi ad alta purezza dai tessuti cardiaci. Il protocollo facilita gli studi biochimici e funzionali a valle, offrendo uno strumento prezioso per studiare il ruolo degli endosomi nella fisiologia e nelle malattie cardiovascolari.

Introduzione

Gli endosomi sono organelli intracellulari essenziali che regolano l'endocitosi, lo smistamento del carico e le vie di segnalazione ^1,2. I recettori di segnalazione attivati e altre proteine sottoregolate vengono inizialmente smistate in vescicole intraluminali (ILV) all'interno degli endosomi precoci (EE), che poi maturano in corpi multivescicolari (MVB) o vescicole trasportatrici endosomiali (ECV). Queste vescicole successivamente si fondono con endosomi tardivi (LE), che fungono da hub di smistamento secondario per indirizzare il carico verso la degradazione lisosomiale o percorsi alternativi. Gli ILV possono anche essere secreti come esosomi in seguito alla fusione degli endosomi con la membrana plasmatica ^3,4 . Parallelamente, la via dell'autofagia trasporta materiale citosolico alle LE attraverso gli autofagosomi, che acquisiscono capacità degradativa dopo la fusione con i compartimenti endocitici tardivi⁵. Gli endosomi sono ora riconosciuti come regolatori critici del riciclo del recettore⁶, della localizzazione dei canali ionici⁷, della biogenesi degli esosomi⁸ e della comunicazione intercellulare⁹ che sono particolarmente pertinenti in cellule specializzate come neuroni e cardiomiociti.

Evidenze emergenti hanno evidenziato il ruolo fondamentale delle vie endosomiali nella funzione cardiovascolare. La proteina 3 del dominio di omologia Eps15 (EHD3) regola il riciclo endosomiale dei principali trasportatori ionici cardiaci, tra cui lo scambiatore Na⁺/Ca²⁺ e i canali del Ca²⁺ di tipo L. Il deficit di EHD3 nei topi porta a bradicardia, anomalie di conduzione e alterazione della manipolazione del Ca^{2+ 10}. Il traffico funzionale endosoma-lisosoma nelle cellule muscolari lisce vascolari previene la calcificazione mediale indotta dal fosfato, che è rilevante per la malattia renale cronica e l'aterosclerosi¹¹. Tuttavia, i ruoli funzionali degli endosomi nelle malattie cardiovascolari e il loro potenziale come bersagli terapeutici rimangono incompleti e richiedono ulteriori indagini.

Diversi metodi hanno permesso l'isolamento biochimico di endosomi funzionalmente intatti. Marsh e colleghi hanno prima combinato la centrifugazione a gradiente di densità con l'elettroforesi a flusso libero per recuperare gli endosomi precoci e tardivi, preservandone l'acidificazione e l'integrità strutturale¹². Metodologie recenti, come l'approccio del gradiente di saccarosio, offrono un percorso standardizzato per separare le popolazioni endosomiali precoci e tardive, essenziale per gli studi proteomici e lipidomici a valle¹³. I kit commerciali basati su colonne rotanti sono stati sviluppati per applicazioni ad alta produttività.

L'isolamento degli esosomi tramite il sistema di isolamento automatico ultraveloce utilizza l'innovativa tecnologia di nanofiltrazione a ultrasuoni, che dispone di un sistema di nanofiltrazione a doppia membrana integrato con oscillazione periodica a pressione negativa e oscillazioni armoniche a doppio accoppiamento per consentire l'isolamento di esosomi ad alta purezza dai biofluidi¹⁴. Qui, abbiamo combinato il frazionamento subcellulare con l'isolamento degli endosomi utilizzando il sistema di isolamento automatico ultraveloce per ottenere un nuovo metodo per l'isolamento rapido degli endosomi con alta resa e alta purezza dal tessuto cardiaco di topo.

Inoltre, abbiamo co-coltivato gli endosomi estratti con cardiomiociti primari (CM) in vitro e abbiamo scoperto che gli endosomi esogeni sono entrati con successo nel CM. Utilizzando un reporter endosoma, in cui la proteina localizzata nell'endosoma Numb è stata fusa con la proteina fluorescente rosso mCherry^15,16, abbiamo osservato la fluorescenza di mCherry localizzata all'interno di CM con un pattern di puncta.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida del National Institutes of Health sull'uso degli animali da laboratorio e con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Houston.

NOTA: Prima di iniziare la procedura di isolamento, è essenziale assicurarsi che tutti i tamponi necessari siano stati preparati di fresco e raffreddati a 4 °C. Gli strumenti sterilizzati, le piastre per coltura tissutale e le provette appropriate devono essere sistemati nelle postazioni di lavoro designate, mantenendo tutti i materiali su ghiaccio o a 4 °C, se non diversamente specificato. Le centrifughe e i rotori devono essere pre-equilibrati a 4 °C per un minimo di 2-3 ore prima dell'uso. Il tampone di frazionamento deve essere preparato prima del giorno dell'esperimento e conservato a 4 °C e mantenuto in ghiaccio durante l'esperimento fino al momento del bisogno. Salvo diversa indicazione, tutte le fasi di incubazione e centrifugazione devono essere condotte a 4 °C.

1. Preparazione del lisato di cuore

1. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando etanolo al 70%, quindi posizionare un tampone assorbente sterile sulla superficie di lavoro, su cui sono disposti gli strumenti chirurgici sterilizzati.
2. Eutanasia dei topi (C57BL/6 maschi, 8-12 settimane, 20-25 g, e mCherry: maschi NumbKI, 8-12 settimane, 20-25 g) tramite inalazione di CO₂ (10-30% CO₂ per 3-5 minuti) o con un metodo alternativo approvato dal comitato istituzionale competente per la cura e l'uso degli animali.
   ATTENZIONE: Operare in uno spazio aperto e assicurarsi che la bombola di CO₂ si chiuda in tempo per evitare perdite. I topi devono essere monitorati durante l'eutanasia per confermare la perdita di coscienza e la procedura corretta. Una volta incosciente, usa un metodo secondario, come la lussazione cervicale, la toracotomia o il dissanguamento, per garantire la morte.
3. Posizionare il mouse in posizione supina e pulire la zona toracica con etanolo al 70%.
   1. Apri rapidamente la cavità toracica per prelevare il cuore e trasferisci il cuore nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) ghiacciata in un piatto da 60 mm posto su ghiaccio.
   2. Rimuovere delicatamente il sangue residuo dalle camere cardiache utilizzando una pinzetta e lavare molto bene il cuore fino a quando non rimane più sangue nelle camere. Mantieni il cuore sul ghiaccio durante la lavorazione.
      NOTA: Conservare 50-100 mg di tessuto cardiaco per l'analisi del western blot (WB) come controllo positivo. Il cuore può essere congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
4. Aggiungere 8 mL di tampone di frazionamento (Tabella 1) a una provetta da 50 mL su ghiaccio. Trasferire 100-120 mg di tessuto cardiaco di topo fresco o congelato in una provetta contenente il tampone di frazionamento.
   NOTA: Qualsiasi parte del tessuto cardiaco del topo può essere utilizzata per estrarre gli endosomi. Sono necessari almeno 100 mg di tessuto cardiaco per produrre endosomi sufficienti per le analisi successive. Per garantire la coerenza tra i gruppi sperimentali, il tessuto deve essere pesato accuratamente prima dell'aggiunta al tampone di frazionamento.
   ATTENZIONE: Indossare DPI adeguati quando si utilizza il tampone di frazionamento per evitare qualsiasi contatto diretto con il corpo.
5. Tritare il tessuto in circa 1 mm³ pezzi usando le forbici per microchirurgia in tampone di frazionamento su ghiaccio per tutto il tempo.
6. Omogeneizzare con un omogeneizzatore elettrico a media velocità, in un ciclo di lavoro di 40 s 30 s stop. Omogeneizzare per 5-7 cicli (Figura 1A).
   NOTA: Un accurato processo di omogeneizzazione è essenziale e aiuterà ad aumentare la concentrazione finale di endosomi.
7. Sonicare il lisato cardiaco omogeneizzato per 10 minuti nel bagno di acqua ghiacciata con un bagno a ultrasuoni (Figura 1A).

2. Frazionamento subcellulare

1. Posizionare un colino cellulare da 40 μm su una provetta da centrifugazione da 50 ml e filtrare il lisato cardiaco omogeneizzato attraverso il filtro (Figura 1A).
2. Per il pellet nucleare: centrifugare il lisato cardiaco a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante e metterlo in un tubo fresco etichettato.
   NOTA: Raccogliere il pellet, che è la frazione nucleare, e risospendere il pellet nucleare in 200 μL di tampone di lisi WB se la frazione nucleare è necessaria per WB. Pipettare delicatamente il pellet nucleare con il tampone del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) su e giù 20 volte e sonicare per 10 minuti. Centrifugare il lisato nucleare a 14.000 × g per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e conservarlo a -80 °C per un ulteriore utilizzo. Il passaggio 2.2 è facoltativo; Può essere saltato se sono necessarie solo vescicole.
3. Per la frazione mitocondriale: centrifugare nuovamente il surnatante a 10.000 × g per 10 min a 4 °C. Il pellet contiene la frazione mitocondriale. Trasferire il surnatante e metterlo in una provetta ultracentrifugata fresca.
   NOTA: Se si desidera una frazione mitocondriale per WB, conservare il pellet come passaggio 2.2 come descritto nella NOTA precedente.
4. Bilanciare attentamente i tubi. Pesare ogni provetta e aggiungere un ulteriore tampone di frazionamento a freddo al provetta più leggera per garantire lo stesso peso. Preraffreddare il rotore e gli adattatori dell'ultracentrifuga per 2-3 ore a 4 °C. Ultracentrifugare il surnatante a 160.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
   NOTA: Durante la fase di ultracentrifugazione, è fondamentale assicurarsi che tutte le provette per ultracentrifuga siano correttamente bilanciate e riempite con tampone a circa 0,5-1 cm sotto il bordo. Un riempimento inadeguato può causare la deformazione o il collasso del tubo a causa delle elevate forze centrifughe applicate.
5. Rimuovere il surnatante in un tubo nuovo. Il surnatante contiene endosomi. Posizionare una siringa da 10 ml collegata a un filtro per siringa da 0,45 μm sopra una provetta da centrifugazione da 50 ml e filtrare il surnatante nella provetta. Aggiungere 5 ml di tampone PBS sterilizzato per diluire la soluzione ed evitare di intasare il filtro.
   NOTA: La fase di filtraggio assicura che tutti gli endosomi nel surnatante siano <450 nm quando si iniziano le fasi di isolamento.
6. Risospendere il pellet con 5 mL di tampone PBS sterilizzato dal passaggio 2.4 e pipettare su e giù almeno 20 volte per miscelare bene il pellet. Il pellet contiene altre vescicole intracellulari. Posizionare una siringa da 10 ml collegata a un filtro per siringa da 0,45 μm sopra una provetta da centrifugazione da 50 ml e filtrare la soluzione di pellet nella provetta. Aggiungere altri 5 ml di tampone PBS sterilizzato per diluire la soluzione ed evitare di intasare il filtro.
   NOTA: La fase di filtraggio assicura che tutte le vescicole del pellet siano <450 nm quando si iniziano le fasi di isolamento.

3. Processo di isolamento di endosomi e altre vescicole intracellulari

1. Diluire il surnatante filtrato della fase 2.5 e la soluzione di pellet filtrata della fase 2.6 con tampone PBS sterilizzato fino a un volume finale di 30 mL in provette da 50 mL, rispettivamente. Conservare i campioni a 4 °C (Figura 1A).
   NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C per 24 ore. Se non c'è abbastanza tempo per eseguire i passaggi successivi lo stesso giorno, possono essere conservati in frigorifero a 4 °C e poi attendere il giorno successivo per continuare l'esperimento.
2. Accendere lo strumento e avviare il programma di pulizia giornaliero, che di solito dura 20 minuti.
3. Scegliere il dispositivo di isolamento EODUS MEDIUM (M EID) per l'isolamento. Installare un adattatore per provette da 50 mL e inserire la provetta da 50 mL con il campione nella posizione del campione. Tocca EID sullo schermo e carica M EID.
   NOTA: L'EID medio è per un campione da 20-50 mL, che raccomanda 30 mL.
4. Programma di configurazione:
   1. Immettere il nome e il volume del campione.
   2. Seleziona il tipo di campione: Plasma.
   3. Seleziona il programma: Plasma. Forte-MA. A03.
   4. Selezionare una provetta da centrifuga: 50 mL.
   5. Attiva la modalità di purezza elevata.
   6. Selezionare l'opzione del programma 3000.
   7. Tocca OK per iniziare.
      NOTA: Il completamento dell'intero processo di isolamento richiede 1-2 ore. Una maggiore concentrazione di campioni richiederà più tempo.
5. Recuperare endosomi e altre vescicole intracellulari:
   1. Recupera l'EID e portalo sul cofano per i passaggi successivi.
   2. Trasferire 200 μl di tampone PBS sterilizzato nell'EID con una pipetta da 200 μl. Sciacquare entrambi i lati della membrana nanoporosa 20 volte, rispettivamente.
   3. Raccogliere gli endosomi o altre vescicole intracellulari, risospendere in 200 μL in una provetta da 1,5 mL. Conservarlo a 4 °C se utilizzato in 24-48 ore, o a -80 °C per una conservazione a lungo termine.
      NOTA: L'eluato contiene gli endosomi o altre vescicole intracellulari e viene utilizzato per ulteriori analisi e co-colture con cardiomiociti. Il campione di endosomi è stabile quando viene conservato a -80 °C per 5 mesi, sulla base dei dati ottenuti.
6. Eluire gli endosomi e altre vescicole intracellulari per WB:
   1. Recupera l'EID. Trasferire 80 μL di tampone di lisi WB nell'EID. Sciacquare entrambi i lati della membrana nanoporosa 20 volte, rispettivamente.
   2. Incubare l'EID su ghiaccio per 30 minuti per garantire la completa solubilizzazione, pipettare il tampone all'interno dell'EID ogni 10 minuti. Raccogliere gli endosomi o altre vescicole intracellulari lisato in provette da 1,5 mL. Centrifugare per 10 min a 14.000 × g a 4°C. Raccogliere e conservare il surnatante a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Scartare il pellet se ne rimane del nel tubo.

4. Quantificazione delle proteine endosomiche e caratterizzazione delle vescicole

1. Analisi del western blot
   1. Conservare 5 μl da ciascun campione per quantificare la concentrazione proteica utilizzando un test dell'acido bicinchoninico (BCA).
   2. Diluire i campioni in tampone per campioni Laemmli 4× e mescolare accuratamente mediante vortex. Riscaldare i campioni a 95 °C per 10 minuti per denaturare le proteine.
   3. Centrifugare i campioni denaturati a 14.000 × g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante risultante per l'analisi.
   4. Assemblare i gel di poliacrilammide nell'apparecchio per elettroforesi e riempire la camera con tampone di corsa di sodio dodecil solfato (SDS).
   5. Caricare un marcatore di peso molecolare e i campioni proteici preparati sul gel, selezionando una percentuale di acrilammide appropriata in base al peso molecolare delle proteine bersaglio.
      NOTA: Tipicamente, vengono caricati 20 μg di proteine per pozzetto sia per i lisati del tessuto cardiaco che per i lisati endosomiali.
   6. Far scorrere il gel a 6 V per circa 120 minuti o fino a quando la parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel.
   7. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando un sistema di trasferimento del western blotting.
      NOTA: Anche il metodo di trasferimento a umido funziona bene.
   8. Sciacquare brevemente la membrana in PVDF con soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,05% di Tween-20 (TBST).
   9. Bloccare la membrana con TBST integrato con albumina sierica bovina (BSA) all'1% per 1 ora a temperatura ambiente.
   10. Incubare la membrana per una notte a 4 °C con anticorpo primario (Tabella dei materiali) specifico per il marcatore endosomiale selezionato, utilizzando un leggero oscillamento.
   11. Il giorno seguente, lavare la membrana tre volte con TBST, ogni lavaggio della durata di 10 minuti a temperatura ambiente su un bilanciere.
       NOTA: Un corretto lavaggio è fondamentale per ridurre lo sfondo aspecifico; Assicurarsi che la membrana rimanga completamente idratata durante tutto il processo.
   12. Incubare la membrana con l'anticorpo secondario appropriato (Tabella dei materiali) per 1 ora a temperatura ambiente.
   13. Lavare la membrana tre volte con TBST, ogni lavaggio della durata di 10 minuti su un bilanciere a temperatura ambiente.
   14. Applicare il substrato chemiluminescente sulla membrana per la rilevazione delle proteine legate agli anticorpi.
   15. Utilizzo di un sistema di imaging su gel per esporre la membrana e scattare immagini delle proteine.
2. Analisi della diffusione dinamica della luce (DLS)
   1. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta degli endosomi sono misurati utilizzando la tecnica di diffusione dinamica della luce (DLS)¹⁷. utilizzando un Litesizer 500 (Anton Paar) equipaggiato con il software Kalliope versione 2.10.4. Le misure DLS vengono eseguite in triplice copia utilizzando un laser a 658 nm con un angolo di rilevamento di 90° a 25 °C.
   2. Effettuare una diluizione di "nanosfere di dimensioni standard" in acqua ultrapura, aggiungere 1 mL di volume nella cuvetta monouso e posizionarla nella camera.
      NOTA: Utilizzare nanosfere standard (piccole o grandi) in base alla dimensione prevista del campione sconosciuto.
   3. Aprire il software DLS e fare clic sulla nuova scheda di misurazione . Selezionare la dimensione delle particelle dalla modalità di misurazione. Assegna un nome al file nel campo Senza titolo e inserisci i parametri di input (solvente, temperatura, ecc.), quindi fai clic su start. Dopo aver determinato la dimensione delle particelle standard, estrarre la cuvetta dalla camera.
   4. Effettuare una diluizione del "materiale di riferimento del potenziale zeta" in acqua ultrapura, posizionarlo nella cuvetta omega del potenziale zeta e posizionarlo nella camera della cuvetta. Fare clic sulla nuova scheda di misurazione nel software. Selezionare il potenziale zeta dalla modalità di misurazione. Assegna un nome al file nel campo Senza titolo e inserisci i parametri di input (solvente, temperatura, ecc.) e fai clic su Avvia.
   5. Per la determinazione della dimensione delle particelle e del potenziale zeta degli endosomi, diluire il campione di endosoma in acqua ultrapura, metterlo nelle rispettive cuvette e posizionarle nella camera della cuvetta. Effettuare le misurazioni nello stesso modo descritto per gli standard.
      NOTA: Effettuare una diluizione dei campioni sconosciuti in base alla concentrazione dei campioni in acqua ultrapura.
3. Analisi NanoFCM
   NOTA: Le concentrazioni di particelle endosomiche vengono determinate utilizzando il software NanoFCM Flow NanoAnalyzer con Professional Suite V2.3¹⁸. L'acquisizione del segnale delle particelle viene eseguita per 2 minuti utilizzando un laser blu a 488 nm impostato su 20 mW con decadimento SS dello 0,2% e/o un laser rosso a 638 nm impostato su 8 mW con decadimento SS del 10%, a una pressione di campionamento di 1,0 kPa modulata e mantenuta da un modulo di pressione ad aria. Il campione viene focalizzato a 1,4 μm utilizzando acqua ultrapur come fluido della guaina tramite un'alimentazione per gravità. L'allineamento ottimale del laser viene testato e calibrato utilizzando perle QC cocktail di nanosfere di silice (S16M-Exo). Le misure di calibrazione delle dimensioni vengono eseguite prima dell'analisi utilizzando perle standard di dimensioni S16M-Exo (cocktail di nanoparticelle di silice contenente particelle di diametro 68, 91, 113 e 155 nm con concentrazione nota di 2,17 × 10¹⁰/mL).
   1. Acquisizione standard di concentrazione:
      1. Avviare e inizializzare la fluidica di nanoFCM. Diluire le perle QC (1:100) in acqua ultrapura filtrata con membrana da 0,22 μm, aggiungerle a una provetta da 0,5 ml e posizionarle nella baia di carico. Selezionare QC FL SiNPs dal menu a discesa Sample Inf e inserire il fattore di diluizione del campione di microsfere QC.
      2. Dal menu a discesa Flusso di campioni , selezionare boosting per introdurre il campione QC ad alta velocità e rimuovere la soluzione detergente dal sistema per 45 s. Durante il boosting, impostare la potenza del laser su 20/50 mV per il laser blu a 488 nm e 20/100 mW per il laser rosso a 638 nm, con decadimento SS dello 0,2%.
      3. Selezionare il campionamento dal menu a discesa Flusso di campionamento ed eseguire la regolazione della soglia per il segnale di grandi dimensioni. Durante il campionamento, regolare manualmente l'allineamento della lente di condensazione del segnale e l'allineamento della lente di messa a fuoco laser dal software, se necessario. La regolazione automatica della soglia per un segnale di grandi dimensioni deve rimanere compresa tra 50 e 120 per il canale di diffusione laterale e inferiore a 75 per entrambi i canali di fluorescenza.
      4. Fare clic su Tempo di registrazione per acquisire i dati per 120 s. Assicurarsi che l'area di interesse (ROI) sia compresa tra 1500 e 15000 durante l'acquisizione dei dati. Salvare il file dei risultati nella cartella pop-up con estensione "nfa" e scaricare la provetta del campione.
         NOTA: Dopo ogni campionamento, utilizzare una soluzione detergente (1x) per rimuovere il campione trattato dal tubo potenziandolo per 45 s. Quindi, immergere la punta del capillare in acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dall'esterno del capillare prima di caricare il campione successivo.
   2. Formato standard di acquisizione:
      1. Diluire le "perle di dimensioni standard" (1:100) in acqua di filtrazione filtrata con membrana da 0,22 μm e posizionarle nella baia di carico. Selezionare 68-155 S16M-Exo dal menu a discesa Inf campione e inserire il fattore di diluizione del campione di perle di dimensioni standard.
      2. Dal menu a discesa Flusso campione , selezionare il boosting per introdurre le microsfere di dimensioni standard e rimuovere la soluzione detergente dal sistema per una durata di 45 s. Durante il boosting, impostare la potenza del laser su 8/50 mV per il laser blu a 488 nm e 20/100 mW per il laser rosso a 638 nm, con decadimento SS del 10%.
      3. Selezionare Campionamento dal menu a discesa Flusso di campionamento ed eseguire la regolazione della soglia per un segnale di piccole dimensioni. Nella finestra dovrebbero essere visibili quattro picchi distinti (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm). Fare clic su Tempo di registrazione per acquisire i dati per 120 s. Salvare il file dei risultati nella cartella pop-up con estensione "nfa" e scaricare la provetta del campione.
   3. Acquisizione standard in bianco:
      1. Utilizzare acqua ultrapura o (tampone/diluente del campione) per eseguire la misurazione con lo stesso processo descritto sopra, salvare il file con il nome "vuoto" nella cartella con estensione "nfa" e scaricare la provetta del campione.
   4. Determinazione della concentrazione di particelle degli endosomi
      1. Diluire il campione di endosoma in acqua ultrapura e posizionarlo nella baia di carico.
      2. Dopo aver potenziato e campionato il campione, fare clic su Tempo di registrazione per avviare le misurazioni. Se la soglia non rientra nell'intervallo 50-120 per il canale di dispersione laterale, o se il ROI è superiore a 15.000, prendere in considerazione la possibilità di diluire il campione.
   5. Analisi dei dati:
      1. Passa dalla scheda Acquisizione alla scheda Analisi nel software e apri i file "nfa" salvati. Imposta lo standard di concentrazione aprendo il file salvato dei risultati QC date__QC FL SnNPs.nfa, imposta la soglia su un segnale di grandi dimensioni facendo clic sullo strumento di impostazione della soglia.
      2. Selezionare la concentrazione di particelle utilizzando lo strumento di controllo del cerchio. Fare clic su Conta STD e controllare la concentrazione delle microsfere QC (2,17 × 10¹⁰/mL) prima di chiudere la finestra.
      3. Per impostare lo standard di dimensione, aprire il file date_68-155 S16M-Exo.nfa. Fare clic sullo strumento Dimensione per aprire la finestra di generazione della curva standard e impostare la soglia per il segnale piccolo facendo clic sullo strumento di impostazione della soglia.
      4. Seleziona S16 exo 68-155 nm dal menu a discesa Definito dall'utente . Fare clic su Trova picchi per identificare le intensità di picco SS delle popolazioni di quattro dimensioni.
      5. Selezionare il file vuoto e fare clic su Imposta vuoto per identificare il numero di falsi positivi per la rimozione del campione. Per analizzare la concentrazione di endosomi, selezionare prima il campione e impostare la soglia su un piccolo segnale facendo clic sullo strumento di impostazione della soglia. Presentare i dati quantificati come rapporto sulle dimensioni (nm) e sulla concentrazione (particelle/mL).

5. Coltura primaria dei cardiomiociti

NOTA: Isolare i cardiomiociti utilizzando un kit di isolamento primario dei cardiomiociti, che fornisce reagenti sufficienti per l'isolamento dei cardiomiociti da un massimo di 50 cuori neonatali di topo o ratto. Il kit include anche componenti adatti a supportare la coltura primaria dei cardiomiociti. Tutti i supporti e i tamponi devono essere rimossi con cautela per evitare di disturbare le celle. Si consiglia il pipettaggio manuale utilizzando un puntale per pipetta da 1000 μl, evitando l'aspirazione a vuoto. La soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) deve essere pre-raffreddata a 4 °C prima di iniziare la procedura.

1. Ricostituire l'enzima di isolamento dei cardiomiociti 1 (contenente papaina), disponibile nel kit, aggiungendone 2. mL di HBSS refrigerato in una fiala. Mescolare delicatamente per circa 5 minuti o fino a quando l'enzima non è completamente sciolto. Mantenere la soluzione enzimatica in ghiaccio durante la procedura.
   NOTA: Una singola fiala di Enzima 1 ricostituito è sufficiente per l'isolamento di cardiomiociti da 10 cuori neonatali. Può essere conservato a -20 °C per un massimo di 6 mesi ed è stabile per due cicli di gelo-scongelamento. Se conservata a 4 °C, la soluzione deve essere utilizzata entro 1 settimana per garantire l'attività enzimatica.
2. Posizionare i cuori neonatali appena sezionati in singoli sterili 1. mL di provette per microcentrifuga e aggiungere immediatamente 500 μL di HBSS ghiacciato a ciascuna provetta.
   NOTA: Si consiglia di processare un cuore per provetta per massimizzare la resa e la riproducibilità.
3. Tritare il tessuto cardiaco in frammenti di 1 mm³ utilizzando le forbici sterili per dissezione. Lavare ogni campione due volte con 500 μL di HBSS ghiacciato per rimuovere il sangue residuo.
4. A ciascuna provetta, aggiungere 200 μL di enzima di isolamento dei cardiomiociti 1 ricostituito (papaina) e 10 μL di enzima di isolamento dei cardiomiociti 2 (contenente termolisina), disponibili nel kit. Mescolare delicatamente e incubare le provette a 37 °C per 30-35 minuti.
   NOTA: L'enzima di isolamento dei cardiomiociti 2 viene fornito come sospensione in HBSS e deve essere scongelato con ghiaccio prima dell'uso. Omogeneizzare l'enzima pipettandolo su e giù per garantire una sospensione uniforme prima di essere aggiunto ai campioni.
5. Dopo la digestione enzimatica, aspirare accuratamente la soluzione enzimatica e lavare ogni campione due volte con 500 μl di HBSS ghiacciato.
6. Aggiungere mL di DMEM completo per l'isolamento delle cellule primarie a ciascuna provetta. Triturare delicatamente il tessuto pipettandolo su e giù 25-30 volte utilizzando un puntale per pipetta sterile da 1,0 ml. Ridurre al minimo la formazione di bolle d'aria durante questa fase.
   NOTA: La disgregazione dei tessuti mediante pipettaggio migliora la resa cellulare. Tuttavia, un pipettaggio eccessivo può causare danni alle cellule.
7. Centrifugare il surnatante a 300 × g per 5 min.
8. Rimuovere con cura il DMEM completo con una pipetta. Aggiungere 1 mL di DMEM Complete fresco alla provetta e pipettare su e giù 25-30 volte utilizzando un puntale per pipetta sterile da 1,0 mL. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio.
9. Dopo che il tessuto è principalmente una sospensione di una singola cellula, aggiungere 0,5 mL di DMEM completo per l'isolamento delle cellule primarie a ciascuna provetta per portare il volume totale a 1,5 mL. Combinare singole sospensioni cellulari per determinare la concentrazione e la vitalità cellulare.

6. Co-coltura di endosomi con cardiomiociti

1. Seminare i cardiomiociti in una piastra da 60 mm e aggiungere il DMEM completo al volume totale.
   NOTA: Ogni cuore di topo neonatale dovrebbe essere seminato in una piastra e il volume totale di ciascun pozzetto dovrebbe essere di 5 ml (Figura 1B).
2. Incubare la piastra da 60 mm a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 24 ore. Dopo 24 ore, sostituire il terreno con un volume equivalente di DMEM completo fresco per l'isolamento di cellule primarie contenente un integratore per la crescita dei cardiomiociti diluito 1000x.
3. Trasferire l'eluato dell'endosoma prodotto dalla fase 3 da -80 °C a -20 °C per 1 ora. Quindi, metti gli endosomi sul ghiaccio e scongelali gradualmente.
   NOTA: Lo scongelamento graduale sul ghiaccio può rendere più intatta la membrana degli endosomi e ridurre la degradazione.
4. Dopo 48 ore, miscelare ogni 100 μL di eluato endosomico con 5 mL di DMEM Complete fresco e sostituire il vecchio terreno in ogni piatto. Co-coltura di endosomi con cardiomiociti per 24 ore.
5. Lavare i cardiomiociti con 2 mL di PBS sterile freddo. Aggiungere un tampone di lisi ghiacciato a ciascun piatto con 80-100 μL di tampone di lisi. Raschiare le cellule utilizzando un raschietto di plastica freddo e raccogliere le cellule in provette da 1,5 mL.
6. Eseguire il protocollo WB descritto nel passaggio 4.1.
7. Per l'immunocolorazione (IF) seguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Seminare i cardiomiociti in un vetrino da camera a 8 pozzetti. Diluire la sospensione a cellula singola con DMEM completato da 1,5 mL a 3 mL.
   2. Versare 300 μl di sospensione in ciascuna camera. Ripetere i passaggi 6.2-6.4.
   3. Fissare i cardiomiociti con 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare con 200 μL di PBS sterile tre volte. Il vetrino della camera a 8 pozzetti è pronto per IF.
      ATTENZIONE: Quando si maneggia il 4% di PFA, indossare DPI adeguati. Si prega di gettare il 4% di PFA in un contenitore adeguato dopo l'uso.

Risultati

Sono stati esaminati i livelli di espressione dei marcatori per gli endosomi precoci, gli endosomi tardivi, i lisosomi e gli autofagosomi in cinque gruppi: lisato del tessuto cardiaco, frazione nucleare, frazione mitocondriale, altre vescicole intracellulari dal passaggio 2.6 e dal passaggio 3.6 ed endosomi dal passaggio 2.5 e dal passaggio 3.6. Il risultato del western blot ha mostrato che EEA1 (Early Endosome Antigen 1) aveva il più alto livello di espressione negli endosomi ed era quasi inespresso in altri gruppi (

Discussione

In questo studio, presentiamo un metodo rapido e riproducibile per isolare endosomi ad alta purezza da tessuti cardiaci di topo combinando il frazionamento subcellulare con una piattaforma di isolamento ultraveloce¹⁴. Gli approcci tradizionali per l'isolamento degli endosomi, come la centrifugazione con gradiente di densit๲ o l'isolamento immunitario, sono spesso dispendiosi in termini di tempo e lavoro e richiedono grandi quantità di tes...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
µ-Scivolo 8 Pozzetto alto	ibidi	80806-90
Provetta per microcentrifuga graduata da 1,5 mL	Stati Uniti d'America Scientific	1615-5500
10x tampone Tris/glicina	Rabbia bio	1610734
4x tampone per campioni Laemmli	Rabbia bio	1610747
Centrifuga da banco	Eppendorf	Eppendorf Centrifuga 5810R
Albumina sierica bovina	Sigma	Codice: A9418
filtro cellulare	Corning	CLS431750	Dimensione dei pori 40  μ M, sterile
Piastre per colture tissutali CELLSTAR	VWR	82050-546	Polistirolo, sterile, 60 mm & acuto; 15 millimetri
Sistema di imaging ChemiDoc	Rabbia bio	ChemiDoc XRS+
Soluzione detergente	NanoFCM	17159
DMEM per kit di isolamento delle cellule primarie Pierce	Fisher Scientifico	PI88287
DTT	Fisher Scientifico	BP172
Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Termo Scientifico	10010023
Reagente per la rilevazione di western blotting ECL	Rabbia bio	1705061
EDTA	Sigma	E4884
SEE1	Segnalazione cellulare	3288S	WB (1:1000)
EGTA	Sigma	E-4378-25
EID	ESODO	MA03 EID
ERp72	Segnalazione cellulare	5033S	WB (1:1000)
Etanolo	Negozio di ricerca UH		200 Proof, 5 galloni
EXODUS H-600	ESODO	H-600
GAPDH	Proteintech	10494-1-AP	WB (1:5000)
Hank' s soluzione salina bilanciata (HBSS)	Termo Scientifico	14175095
HEPES	Sigma	H3375
Omogeneizzatore	Fisher Scientifico	15340167
Kcl	Sigma	P3911
Lampada1	Abcam	ab320851	WB (1:2000)
LC3	Segnalazione cellulare	2775S	WB (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	Altre apparecchiature come Zetasizer (Malvern) o DLS  (Wyatt) può essere utilizzato
mCiliegia	Biorbyt	Orb66657	WB (1:500)
MgCl2	Fisher Scientifico	BP214-500
NaCl	Sigma	S7653
NanoFCM	NanoFCM	NanoAnalizzatore di flusso
Standard dimensionali delle nanosfere	Termo Scientifico	3020A
Microscopio confocale Nikon AXR	Nikon	AXR
Soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS	Santa Cruz Biotecnologia	SC-281692
Sonde per marcatura di falloidine	Invitrogen	Codice A22284	IF (1:500)
Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce	Termo Scientifico	23227
Kit di isolamento dei cardiomiociti primari Pierce	Termo Scientifico	88028
Filtro per siringa in polietersulfone	Millipore	SLHPR33RS	Dimensione dei pori 0,45  μ M, sterile
Gel proteici prefabbricati	Rabbia bio	4561093
Perline QC	NanoFCM	QS2503
Rab7	Segnalazione cellulare	9367S	WB (1:1000)
tampone di lisi ed estrazione RIPA	Termo Scientifico	89900
Roche PhosSTOP (Cocktail PI)	Roche	4906837001
Nanosfere di silice	NanoFCM	S16M-EXO
Saccarosio	Sigma	84097
Rotore a benna oscillante	Beckman Coulter	SW55Ti
Kit di trasferimento RTA per sistema di trasferimento turbo Trans-Blot	Rabbia bio	1704270
Interpolazione 20	Rabbia bio	1662404
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima XE-90
Provette per ultracentrifuga	Beckman Coulter	326819
Bagno di pulizia ad ultrasuoni	Ultrasuoni Branson	CPX952238R
VWR Provetta Cent 50 mL	VWR	89039-656
VWR Centrifuga per provette 15 mL	VWR	89039-666
Materiale di riferimento per il potenziale Zeta	Anton Paar	175108