Articolo metodologico

Imaging molecolare spaziale del Glycome tramite spettrometria di massa

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DOI:

10.3791/69154

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28 novembre 2025

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dettaglia i passaggi chiave per consentire una misurazione rigorosa e riproducibile sia del glicogeno che di quelli N-linked tramite imaging di spettrometria di massa.

Abstract

L'organizzazione spaziale del glycome all'interno dei tessuti è fondamentale per la base molecolare della funzione fisiologica. Il glycome vario e dinamico è fondamentale per i processi cellulari fondamentali, inclusi metabolismo, segnalazione e adesione. Le innovazioni nella biologia spaziale hanno aperto nuove strade per l'imaging molecolare spaziale di diverse classi di glycome. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per l'imaging biomolecolare spaziale del glycome nel fegato di topo fresco congelato. Il flusso di lavoro comprende (1) raccolta e congelamento rapidi, (2) sezionamento criostatico a spessore e posizione ottimali, (3) preparazione del tessuto e digestione enzimatica tramite enzimi attivi da carboidrati, (4) applicazione e acquisizione di dati tramite imaging di massa assistito da desorbizione/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-MSI), e (5) elaborazione e visualizzazione dei dati per collocare i risultati nel contesto biologico. L'uso di questo approccio consente l'acquisizione di mappe spaziali dettagliate di glicani e glicogeni N-linkati, rivelando caratteristiche fisiologiche e cellulari chiave. Questi dati permettono di definire l'eterogeneità glicomica spaziale chiave associata alla funzione e alla disfunzione epatica. Questo flusso di lavoro consente glicomici spaziali altamente riproducibili e sensibili del fegato del topo. Inoltre, è facilmente adattabile ad altri tessuti o specie, facilitando nuove intuizioni spaziali sulla biologia dei glicome in ambito sanitario e malattioso.

Introduzione

Il campo della biologia spaziale si sta espandendo rapidamente, fornendo spunti fondamentali sulla complessità biomolecolare spaziale dinamica degli organismi viventi. Vengono impiegati molteplici approcci per studiare biomolecole distinte in un contesto biologico. Sebbene alcune siano tecniche altamente specializzate, la spettrometria di massa (SM) è emersa come una tecnica generale importante per quantificare un'ampia gamma di biomolecole nel contesto di cellule, tessuti o organismi.

L'imaging con spettrometria di massa a disorbazione laser assistita da matrici (MALDI-MSI) è una delle tecniche generali emergenti per l'imaging multiomico di biomolecole spaziali multiomiche. Inizialmente è stato creato per la visualizzazione di proteine e peptidi nelle fettetissutali 1. Da allora, è stato esteso a molti campioni biologici e molecolediverse 2. La tecnica può essere applicata a campionicellulari 3,organoidi 4, animalimodello 5 e campioni di pazienti 6,7. Alcune classi molecolari possono essere misurate direttamente utilizzando approcci basati su MSI, inclusi molti metaboliti e lipidi, mentre altri tipi di biomolecole più complesse, come proteine e glicani, richiedono trattamenti enzimatici, o chimici per essere adatti alla rilevazione basata suMSI 2,8.

MALDI-MSI è stato applicato anche all'analisi spaziale di glicani N-legati e glicogeno, utilizzando flussi di lavoro che richiedono un trattamento enzimatico per produrre frammenti di glicano adatti al rilevamentoMSI 9,10,11,12,13,14,15. I N-glicani sono spartuti dal residuo di asparagina delle proteine con PNGasi F, e le catene di glicogeno del glucosio vengono spaccate con l'isoamilasi. I principali vantaggi dell'analisi del glicogeno MALDI sono la definizione spaziale della distribuzione del glicogeno nel campione biologico, la quantificazione relativa e informazioni sulla ramificazione delle catene del glucosio. Poiché sia i flussi di lavoro N-glicani che quelli del glicogeno richiedono l'elaborazione enzimattica del campione per l'analisi MSI, sono stati combinati in un flusso di lavoro integrato per l'analisi del glycome (Figura 1A). Questo flusso di lavoro richiede un'attenta preparazione dei campioni biologici e un trattamento specifico per consentire l'analisi MS del glicoma, seguita dall'acquisizione e l'elaborazione dei dati. Sebbene il flusso di lavoro richieda una serie di passaggi specializzati, produce dati glycome spaziali ricchi e di alta qualità, altamente riproducibili e adattabili a molti tipi diversi dicampioni 16. Inoltre, il flusso di lavoro è modulare, in modo che i passaggi di elaborazione del campione possano essere eseguiti da laboratori di ricerca indipendenti prima della sottomissione dei campioni a strutture specializzate che svolgono le fasi finali dell'acquisizione e analisi dei dati MALDI-MSI.

Protocollo

Questa ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della Florida. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Prelievo del fegato

  1. Eutanasia animale e dissezione
    1. Eseguire la lussazione e la decapitazione cervicale per eutanasiare il topo (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
      NOTA: Per questo esempio, è stato utilizzato un topo selvatico C57BL/6J di 6 mesi. A questa età, i topi pesano ~25-33 g. Un'ampia gamma di età, dimensioni e ceppi è ben adatta a questa analisi.
    2. Posiziona immediatamente l'animale su un sottocuscinetto assorbente ed esponi la cavità addominale usando un bisturi sterile.
    3. Usando pinze e forbici sterili, isola il fegato con minima manipolazione e danni ai tessuti.
      NOTA: I cambiamenti metabolici avvengono rapidamente. Evitare perfusione o sedazione se possibile e assicurarsi che i passaggi di dissezione vengano eseguiti il più rapidamentepossibile.
  2. Lava e pulisci rapidamente il fazzoletto.
    1. Immergi delicatamente il fegato in una soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il sangue.
    2. Immergi il tessuto in acqua deionizzata (DI) due volte.
    3. Tampona l'acqua in eccesso toccando delicatamente il fazzoletto su un tergicristallo pulito.
      NOTA: I campioni più grandi di quanto possa entrare su una vetrata standard del microscopio devono essere tagliati a pezzi prima del congelamento.
  3. Congelamento del campione
    1. Metti il fegato pulito direttamente in una pesatrice in polistirene usa e getta pre-raffreddata che galleggia su azoto liquido.
    2. Quando il fazzoletto cambia colore in un opaco lucido, circa 3 minuti, poi si mette il fazzoletto in bustine di alluminio preconfezionate e etichettate su ghiaccio secco.
    3. Metti le bustine di alluminio con i campioni in un congelatore a -80 °C per la conservazione. I campioni possono essere conservati a lungo termine a -80 °C.

2: Preparazione di un campione biologico

  1. Preparazione per la criosezionazione
    1. Assicurarsi che il criostato sia acceso ed equilibrato a una temperatura adatta al tessuto, tra -16 °C e -20 °C. La temperatura esatta dipenderà dal tipo di tessuto. Il fegato dovrebbe essere sezionato a una temperatura leggermente più calda, circa -16 °C a -17 °C, per prevenire lacerazioni nei tessuti, mentre gli altri tessuti devono essere sezionati a -20 °C.
    2. Assicurati che ci siano almeno due mandrini, due pennelli sottili, una pinzetta sottile e un inserto di vetro da 70 mm alla temperatura del criostato. Inoltre, etichetta i vetrini a matita prima di inserirli nel criostato per acclimatarsi.
    3. Trasferire il tessuto dal congelatore a -80 °C al criostato su ghiaccio secco.
    4. Lascia che i tessuti si acclimatino alla temperatura del criostato per almeno 30 minuti.
    5. Assicurati che non ci siano danni al bordo dell'inserto in vetro e che sia liscio dove il tessuto incontrerà la guida anti-roll, facendo scorrere un dito guantato lungo il bordo.
    6. Metti l'inserto in vetro nella guida antirollio.
    7. Prendi una lama a profilo basso e infilala con cura nel portalama aperto, chiudendo il portalama. Posiziona la protezione rossa della lama sopra la lama fino alla sezione.
    8. Monta il tessuto sul mandrino usando un mezzo di montaggio M1, compatibile con MS. Posiziona un mezzo di montaggio M1 a temperatura ambiente sul mandrino all'interno del criostato, coprendo almeno due anelli sul mandrino in modo che il tessuto sia fissato in posizione.
      NOTA: Il composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) viene spesso utilizzato nella criosezionazione; tuttavia, provoca la soppressione degli ioni nelle applicazioni MS e deve essere evitata. Se è necessario utilizzare l'OCT, allora dovrebbe essere utilizzato un protocollo aggiuntivo a più passi per minimizzare o rimuovere l'OCT. Inoltre, alcuni centri risorse MS non analizzeranno i campioni che erano incorporati in OCT.
    9. Prendi una pinzetta fresca e rimuovi il tessuto dalla carta stagnola. Usa la pinzetta per posizionare il tessuto sul mandrino nell'orientamento desiderato.
    10. Metti il mandrino nel criostato per permettere al materiale di montaggio di congelarsi, circa 2 minuti. Una volta congelato, sarà indurito e apparirà opaco.
  2. Criosezionamento del tessuto epatico
    1. Metti il mandrino con il fazzoletto montato nel portamandrini. Posiziona il mandrino in modo che il tessuto tagli a un angolo di 90° rispetto alla lama.
    2. Ritrae il portamandrini finché il tessuto non entra in contatto con la lama. Porta lentamente dentro il mandrino finché il tessuto non è immediatamente adiacente alla lama per iniziare la sezione.
    3. Inizia la sezionazione con una fetta di spessore di 30 μm per rimuovere i tessuti indesiderati.
    4. Assicurati che la profondità della lamina di rotolo crei una sezione liscia e che il tessuto non si stoli sopra la piastra di rotolo. Se è così, allenta leggermente la piastra del rullo. Se il tessuto muove la piastra del rullo e la colpisce una seconda volta durante il reset della rotazione, allora stringi leggermente la piastra del rotolo.
    5. Man mano che si avvicina la sezione desiderata, si riduce lo spessore previsto della fetta a 10 μm, o a un altro spessore desiderato adatto all'applicazione specifica.
    6. Completa 10 rotazioni in modo che il mandrino abbia lo spessore giusto per evitare ristagni e sezioni irregolari.
    7. Usa un pennello raffreddato per liberare il palco in preparazione alla sezione. Chiudi la piastra di rotolo sopra la lama e prende lentamente una sezione del fazzoletto.
    8. Solleva la piastra a rotolo e usa i due pennelli sottili e raffreddati per sfiorare delicatamente la sezione dalla lama. Sposta la sezione di lato del palco per facilitarla il montaggio sulla slitta.
    9. Prendi un vetrino raffreddato da un portavetrino nel criostato e posiziona un indice sul lato opposto del vetrino rispetto a dove il tessuto sarà posizionato per 10 secondi.
    10. Posa delicatamente il carrello sul fazzoletto e sollevalo di nuovo. Non premere forte verso il basso, perché questo strapperà il tessuto. Il tessuto dovrebbe sciogliersi sul vetrino e diventare traslucido.
    11. Trasferisci rapidamente i vetri in un essiccatore per l'asciugatura. Asciuga il carrello nel disidratatore per 1 ora.
    12. Dopo l'asciugatura, i vetrini possono essere lavorati direttamente per la MS oppure sottovuoto e conservati a -80 °C.

3. Preparazione delle vetrine per l'MSI dei glicomici

  1. Preparazione degli enzimi
    NOTA: La PNGasi Liofilizzata a basso contenuto di sale pronta per MS può essere acquistata e utilizzata direttamente.
    1. L'isoamilasi richiede dialisi per rimuovere l'eccesso di sale per applicazioni nella SM. Prepara una o più coppette per la dialisi mettendole nell'acqua HPLC per 15 minuti.
    2. Dialisi 200 μL di isoamilasi di stocco utilizzando una coppa da 500 μL in 14,3 mL di acqua HPLC per 2 ore a 4 °C, senza mescolare. Sostituire i 14,3 mL di acqua HPLC con acqua HPLC fresca e dialisi per ulteriori 16 ore (durante la notte) a 4 °C. Sostituire i 14,3 mL di acqua HPLC con acqua HPLC fresca e dialisi per ulteriori 8 ore a 4 °C.
    3. Rimuovi delicatamente l'isoamilasi dalla coppetta con una pipetta e mettila in un tubo microcentrifuga da 1,5. Misurare il volume totale della soluzione di isoamilasi dopo la dialisi (in μL). Dall'attività iniziale dello stock, tipicamente 200 unità/mL, e dal volume finale, si calcola il volume totale necessario per 3 unità di isoamilasi.
    4. Pipete aliquote di 3 unità di isoamilasi in tubi PCR a parete sottile. Scatta i tubi di congelamento in azoto liquido. Conserva a -80 °C. Per ogni protocollo di spruzzatura può essere utilizzato un tubo di soluzione di isoamilasi dialitica, sufficiente per quattro vetrini. Evita i cicli di congelamento/disgelo per mantenere l'attività enzimatica.
  2. Fissazione e lavaggio dei tessuti
    1. Metti i vetrini in un portavetri e immergi in un contenitore di vetro riempito con formalina tamponata neutra al 10% (NBF) per 1 ora.
    2. Rimuovi le slide dal NBF. Immergi i vetri nel 70% di etanolo per 2 ore.
    3. Prepara quattro barattoli di Coplin contenenti etanolo per il 70%, l'80%, il 90% e il 100%. Etichetta chiaramente ogni barattolo per evitare confusione durante i lavaggi sequenziali.
    4. Trasferire successivemente i vetri come segue: 70% etanolo per 5 minuti, 80% etanolo per 5 minuti, 90% etanolo per 5 minuti, 100% etanolo per 5 minuti.
    5. Trasferisci le vetrine in una piastra di vetro di Petri riempita con xilene fresco al 100%. Assicurati che i carrelli siano completamente sommersi. Incubare i vetrini su uno shaker a 70 giri al minuto per 1 ora, a seconda del contenuto lipidico del tessuto. Ripeti questo passaggio altre due volte usando xilene fresco per ogni lavaggio.
      NOTA: Questo protocollo è progettato per consentire la massima delipidazione, poiché i lipidi sono noti per portare alla soppressione degli ioni e quindi alla massima riproducibilità. Tuttavia, ciò comporta la delocalizzazione dei segnali, diminuendo così la risoluzione ottenuta. Passaggi di lavaggio ridotti, limiti dei tempi di elaborazione e un controllo attento dell'umidità possono diminuire la delocalizzazione e quindi portare a una migliore risoluzione dei dati.
    6. Metti i vetri in un essiccatore durante la notte per asciugarli.
    7. Metti i vetrini in etanolo al 70% per 1 minuto per reidratarli. Metti gli scivoli nell'acqua DI per 3 minuti. Ripeti il lavaggio con acqua DI con acqua DI fresca.
    8. Asciuga i vetri in un essiccatore per 10 minuti, o finché non sono completamente asciutti.
  3. Preparazione delle vetrine per l'applicazione di enzimi
    1. Prepara una camera di umidità HTX per l'incubazione posizionando un asciugamano di carta imbevuto di acqua DI sotto il portaoggetti metallico. Posiziona la camera in un incubatore a 37 °C.
    2. Prepara un vaporizzatore riempiendo il serbatoio d'acqua fino in cima con acqua del rubinetto. Imposta il timer a 60 minuti per accendere l'unità.
    3. Prepara il tampone citraconico aggiungendo 50 mL di acqua HPLC, 25 μL di anidride citraconica e 2 μL di 12 M HCl in un tubo Falcon da 50 mL. Vortice la soluzione per 10 secondi per mescolarla a fondo. Ogni tubo centrifugo da 50 mL di tampone citraconico è sufficiente per quattro vetrine. Verifica che il pH della soluzione sia 3,0 (intervallo accettabile: 2,5-3,5).
    4. Riempi ogni spaccio con il tampone citraconico preparato. Posizionare il vetrino con il tessuto rivolto verso l'interno per impedire che il tessuto tocchi i lati e permettere un efficace prelievo di antigeni. Si possono usare due slide per ogni mailling, utilizzando le due posizioni dei bordi con entrambe le slide con tessuti rivolti verso l'interno.
    5. Verifica che il vapore venga emesso dal vaporizzatore per cibo. Metti i spostini nel vaporizzatore e incuba per 30 minuti.
    6. Trasferire i corrieri in un bagno d'acqua DI per 5 minuti. Sostituisci metà del tampone citraconico nel volantino con acqua DI e lascia riposare per altri 5 minuti. Ripeti questa diluizione altre due volte.
    7. Rimuovi tutti i solventi e lava le vetrine aggiungendo acqua DI al 100% alla cotta per vetri, poi rimuovendo l'acqua DI. Usando una salvietta da laboratorio, asciuga in zone in cui non si trova tessuto.
    8. Disegna un cerchio e un triangolo sul retro di ogni diapositiva per segnare le posizioni standard interne. Applicare 1 μL di 1 mg/mL di perossidasi di rabaco picante (HRP; cerchio) e 1 μL di glicogeno epatico da coniglio da 10 mg/mL (triangolo) sulla parte anteriore del vetrino.
    9. Metti i vetri nel disidratatore per 15 minuti per farli asciugare completamente.
  4. Spruzzatura enzimatica e digestione
    1. Rimuovere un tubo di 100 μg di PNGasi liofilizzato F (500 unità/μg) e un tubo di 3 unità di isoamilasi e lasciare scongelare per 10 minuti. Tubi di centrifuga a ~2000 x g per 5 secondi in un tubo a microcentrifuga. Questo è un enzima sufficiente per spruzzare 4 vetrine.
    2. Pipetta 50 μL di acqua per ogni tubo F della PNGasi liofilizzato, vortice delicatamente per 10 secondi e gira in un microfugo a ~2000 x g per 5 secondi. Pipetta la soluzione di 50 μL PNGase F direttamente nel tubo di isoamilasi. Aggiungi l'acqua HPLC a un volume finale di 1 mL.
    3. Vortice il tubo microcentrifuga a doppio enzima per 10 secondi e centrifuga a ~2000 x g per 5 secondi.
    4. Accendi lo spruzzatore HTX M5 e apri il software HTX M5. Assicurati che il tipo di vassoio sia impostato su Ambient nella scheda Sistema .
    5. Spegni la pompa Knauer premendo il pulsante stop sul lato anteriore destro. Accendi la pompa esterna della siringa tramite l'interruttore sul pannello posteriore.
    6. Nel software HTX, nella scheda Metodi , seleziona il metodo appropriato per la spruzzatura a doppio enzima. I parametri devono essere impostati a una temperatura dell'ugello di 45 °C, 15 passaggi, portata di 0,025 mL/min, velocità di 1200 mm/min, distanza tra i binari di 3 mm, schema CC, pressione impostata a 10 psi, portata di gas di 3 L/min e altezza dell'ugello di 40 mm.
    7. Vai alla scheda Temperatura e imposta la temperatura dell'ugello a 45 °C. Usa una chiave inglese per spostare la linea dello spruzzatore verso il connettore superiore.
    8. Apri la valvola di azoto ad altissima purezza e assicurati che la pressione dello spruzzatore sia di 10 psi. Sulla pompa della siringa, imposta la portata a 95 μL/min.
    9. Usando una siringa e un ago nuovi, riempi con 4 mL di acqua HPLC. Rimuovi tutte le bolle. Fai scorrere 2 mL d'acqua attraverso una sezione di ~6 pollici della linea dello spruzzatore fino a un becher di scarico.
    10. Collega la siringa alla linea dello spruzzatore e fai passare l'acqua attraverso la pompa della siringa avviando e facendo funzionare a 95 μL/min per 5 minuti.
    11. Durante lo sciacquaggio della pompa della siringa, fissa con nastro adesivo i letti nell'angolo in basso a sinistra del vassoio riscaldato usando una guida metallica per l'allineamento per assicurarsi che il tessuto si trovi all'interno dell'area dello spruzzo. Nella scheda Campione , definisci i parametri X e Y per la regione di spruzzo permettendo un leggero sovraspruzzo per garantire una copertura completa del vetri.
    12. Dopo 5 minuti, metti in pausa la pompa, scollega la siringa, aspira aria dentro di essa e poi spingi aria attraverso la linea dello spruzzatore per eliminare eventuali residui d'acqua. Ripeti se necessario.
    13. Carica la soluzione a doppio enzima in una nuova siringa e collegala alla pompa, assicurandoti che non rimangano bolle.
    14. Attacca la siringa alla linea dello spruzzatore. Sulla pompa a siringa, regola la portata a 25 μL/min.
    15. Quando l'ugello spruzzatore raggiunge i 45 °C, premi Start sotto la scheda Ciclo . Clicca su No quando ti viene chiesto di accendere la pompa di Knauer. Premi Start sulla pompa della siringa per iniziare lo spray.
    16. Posiziona un vetrino vuoto sotto l'ugello dello spruzzo per confermare la deposizione visibile dello spray enzimatico. Una volta osservato, clicca su Continua sul software, posiziona il coperchio di vetro sullo spruzzatore e monitora lo spray per un'applicazione uniforme, come indicato dall'umidimento uniforme.
    17. Quando il ciclo di spruzzatura è terminato, premi stop sulla pompa, spegni il gas azotato e clicca su Conferma carico valvole. Pulisci la linea e lo stadio dello spruzzatore e spegni lo spruzzatore, assicurandoti che la pompa Knauer sia di nuovo accesa.
    18. Incubare i vetri nella camera di umidità HTX a 37 °C per 2 ore, posizionando i vetrini rivolti verso l'alto. Una volta completato, posiziona i vetri nel disidratatore per 15 minuti. Le vetri possono rimanere nel disidratatore per tutta la notte, oppure il protocollo può essere proseguito.
  5. Preparazione e applicazione della matrice MALDI
    1. Prima dell'applicazione della matrice, cattura un'immagine ottica della diapositiva utilizzando uno scanner.
    2. Peso 40 mg di CHCA solido in un tubo conico da 15 mL. Sciogliere la polvere di CHCA in una soluzione di acido trifluoroacetico allo 0,1% e acetonitrile al 50% (ACN) a una concentrazione di 7 mg/mL.
    3. Sonica la soluzione della matrice per 10 minuti usando cicli di 90 secondi accesi e 30 secondi di spenzione. Ripeti questi passaggi 5 volte per garantire la completa dissoluzione e omogeneità.
    4. Accendi lo spruzzatore HTX M5 e apri il software HTX M5. Apri la valvola del gas azotato e imposta la pressione del sistema a 10 psi.
    5. Nel software HTX, nella scheda Metodi , seleziona il metodo appropriato per la spruzzatura della matrice CHCA. Parametri impostati a una temperatura dell'ugello di 79 °C, 10 passaggi, portata di 0,1 mL/min, velocità di 1300 mm/min, distanza di 3 mm, schema CC, pressione impostata a 10 psi, portata di gas di 3 L/min e altezza dell'ugello di 40 mm.
    6. Vai alla scheda Temperatura , imposta la temperatura dell'ugello a 79 °C. Sotto la scheda Pompa , imposta la portata a 100 μL/min.
    7. Fissa i bracci con il nastro nell'angolo in basso a sinistra della vassoia riscaldata usando una guida metallica per garantire un corretto allineamento nell'area di spruzzo. Nella scheda Campione , definisci i parametri X e Y per la regione di spruzzo permettendo un leggero sovraspruzzo per garantire una copertura completa del vetri.
    8. Usa una siringa usa e getta e un ago per prelevare 5,5 mL di ACN al 50% (rimuovere le bolle).
    9. Imposta lo spruzzatore in modalità CARICA . Inserisci la siringa ACN e inietta l'ACN. Rimuovi la siringa ACN e sostituisci immediatamente con una nuova che contiene 5,5 mL di soluzione filtrata di CHCA, iniettando attenzione a evitare bolle. Imposta lo spruzzatore in modalità SPRAY .
    10. Quando l'ugello spruzzatore raggiunge i 79 °C, premi Start sotto la scheda Ciclo . Clicca su Sì quando ti viene chiesto.
    11. Usa una lamina di prova a vuoto e posizionala sotto l'ugello dello spruzzatore. Per confermare la deposizione di spray a matrice visibile, sul vetrino si troverà una deposizione a matrice gialla. Una volta osservato, clicca su Continua, posiziona il coperchio di vetro sullo strumento e monitora lo spruzzo per la coerenza. Una spruzzazione costante produrrà una vetrata con opacità uniforme.
    12. Quando il ciclo di spruzzatura è terminato, imposta lo spruzzatore in modalità CARICA e clicca su Conferma carico valvole.
    13. Pulisci lo spruzzatore impostando la pompa a 300 psi e abbassando la temperatura a 30 °C. Aspirare e spingere attraverso la linea 5 mL di acetonitrile al 50% due volte e 5 mL di metanolo al 50% due volte. Pulisci il palco con metanolo al 100%. Quando la temperatura raggiunge i 30 °C, passa a LOAD, spegni il gas, spegni lo spruzzatore e assicurati che la pompa Knauer sia riaccesa.
    14. Metti le lame nel disidratatore per 15 minuti finché la matrice non è completamente asciutta. Le diapositive devono essere eseguite il prima possibile dopo la spruzzatura, entro un massimo di 14 giorni, per garantire una raccolta affidabile dei dati con un adeguato rapporto segnale-rumore.

4. Raccolta dati dei glicomici MALDI-MSI

  1. Preparazione alla raccolta dei dati
    1. Fissa il carrello nel portacampioni dello strumento MALDI con l'adattatore per carrella. Inserire il portacampioni nel microscopo e assicurarsi che sia correttamente posizionato per l'imaging (imaging).
    2. Apri il software flexImaging e importa l'immagine ottica della diapositiva precedentemente registrata, vedi il passo 3.4.1. Se necessario, calibrare l'allineamento dell'immagine con lo stadio dello strumento in modo che le sezioni di tessuto e i punti standard siano posizionati correttamente per la selezione della regione.
    3. Definire le regioni di imaging per le sezioni tissutali, lo standard HRP, lo standard del glicogeno e il quadrato della matrice di controllo nel software. Definisci ciascuna come una regione separata.
    4. Imposta la dimensione del passo raster a 50 μm, ottenendo una risoluzione in pixel di 50 × 50 μm.
    5. Nel software di controllo strumentale, seleziona la modalità MS a ioni positivi e imposta il raggio di scansione su m/z 500 - 4000 con un cutoff di bassa massa di 700,00 m/z.
    6. Carica il parametro di sintonia MALDI pre-ottimizzato nel software di controllo dello strumento (oppure inserisci manualmente i valori se necessario). Verifica che le tensioni sorgente e ottica ionica siano impostate ai valori specificati: MALDI Plate Offset 50,0 V; Deflessione 1 Delta 70.0 V; Funnel 1 RF 500.0 Vpp; Funnel 2 RF 500.0 Vpp; Multipolo RF 500.0 Vpp; Energia ionica 5.0 eV. Conferma la cella di collisione e le impostazioni di temporizzazione del TOF: Energia di collisione 10.0 eV; Collision RF 4000.0 Vpp; Tempo di trasferimento 180,0 μs; Memoria pre-impulsi 25,0 μs.
    7. Conferma le impostazioni del laser nella scheda Laser. Seleziona Imaging 50 μm come impostazione predefinita dell'applicazione.
    8. Calibrare lo spettrometro di massa utilizzando una miscela di calibrazione esterna come la miscela di accordatura. Introdurre il calibrante e eseguire la routine di calibrazione dello strumento. Regola la calibrazione in modo che l'errore di accuratezza di massa sia entro lo 0,001% e il punteggio di accuratezza sia del 100%.
    9. Imposta l'acquisizione per eseguire una raffica di 320 colpi laser a frequenza di 10.000 Hz. L'attenuazione laser dovrebbe essere regolata al 37% per mantenere l'intensità del segnale all'interno dell'intervallo dinamico ottimale. Regola i colpi laser e l'attenuazione secondo necessità.
    10. Utilizzare la funzione automatica di allineamento del fascio, la regolazione del profilo del bersaglio e la regolazione della messa a fuoco dello strumento per garantire che il laser sia correttamente focalizzato sul campione. In una regione fuori dal tessuto, esegui l'Auto Beam Adjust sotto la scheda Laser nel software di controllo per allineare il laser con l'ottica ionica. Questo garantirà che il laser e lo stadio vengano regolati per una raccolta ottimale dei dati. Infine, esegui la generazione del profilo target e le regolazioni della messa a fuoco nella scheda del portatore del campione.
    11. Confermare che gli spot standard interni producano i picchi ionici attesi, indicando la prontezza per la raccolta dei dati. L'HRP dovrebbe avere un picco di glicano prominente a 1211,42. Il glicogeno dovrebbe avere picchi di picco regolarmente distanziati, con i picchi di massima intensità a 1013,32, 1175,37 e 1337,43.
      NOTA: Se vengono identificati problemi di intensità, rivedere la configurazione del laser. Se vengono identificati problemi di accuratezza di massa, ripassa la calibrazione.
  2. Raccolta dati MALDI-MSI
    1. Inizia l'acquisizione di immagini MALDI-MS per le regioni definite cliccando sul pulsante Start nel software di imaging. Lo strumento rasterizzerà automaticamente il laser su ciascuna regione definita a intervalli di 50 μm, acquisendo uno spettro MS1 a ioni positivi (m/z 500-4000) a ogni pixel. Il tempo tipico di raccolta dati per una sezione epatica a questa risoluzione è di 135 minuti.
      NOTA: Dopo l'esecuzione, lo strumento salverà automaticamente gli spettri per ogni pixel acquisito, creando una cartella .d con i dati grezzi.

5. Analisi dei dati MALDI-MSI

  1. Importazione ed esportazione dati
    1. Importa il dataset in SCiLS Lab, o in un software equivalente di analisi MSI, per visualizzare le mappe di intensità ionica del glycome nelle sezioni tissute.
    2. Apri il laboratorio SCiLS. Seleziona Nuovo. Seleziona il file .mis dalla run MALDI.
    3. Una volta che il file .mis si apre in SCiLS, clicca su Avanti. Seleziona gamma automatica per m/z Range. Seleziona l'asse automatico per i parametri dell'asse. Seleziona la dimensione assoluta del contenitore. Clicca su Avanti e poi su Importa. Seleziona la cartella dove il file verrà salvato.
    4. Dopo che l'importazione è terminata, apri il nuovo file .slx.
    5. Clicca su file, Importa e seleziona la lista delle funzionalità dall'opzione file. Importa annotazioni di glycome e crea immagini ioniche andando nel pannello della lista delle caratteristiche, selezionando la lista corretta e cliccando sul pulsante crea immagini ioniche.
      NOTA: Sono disponibili liste di funzionalità robuste per N-glicani16, 18, 19 e glicogeno13.
    6. Normalizzare i dati, se appropriato. Il Conteggio Totale degli Ioni (TIC) è la normalizzazione più comunemente utilizzata.
    7. Una volta caricate le immagini ioniche, si esamina la lista delle funzionalità e si verifica la corretta integrazione dei picchi, regolando manualmente per quelle caratteristiche in cui il picco non è completamente integrato. Per regolare, clicca con il tasto sinistro sul picco tenendo premuto shift. Una volta integrato il picco, premi controllo e barra spaziatrice sulla tastiera. Questo genererà una nuova immagine ionica per il picco regolato.
    8. Dopo aver ripetuto per il resto della lista delle caratteristiche, nel pannello dell'immagine ionica, seleziona la lista Salva elenco delle caratteristiche, nomina la lista e clicca su Salva.
    9. Vai su file, tabella delle caratteristiche e apri la tabella delle feature che è stata appena salvata. Ordina per m/z. Le caratteristiche modificate appariranno con una cella vuota nella colonna del nome. Rinomina i picchi regolati copiando e incollando il nome e rimuovendo il picco originale selezionando il pulsante per rimuovere la riga selezionata dalla lista delle caratteristiche situato verso la parte centrale della tabella delle funzionalità.
    10. Dopo aver modificato tutti i nomi, si ottiene una lista finale annotata dei picchi. Clicca sul pulsante aggiungi intensità situato vicino al pulsante di eliminazione. Da qui, seleziona i campioni di interesse per esportare l'intensità media delle caratteristiche annotate per ogni regione immaginata.
    11. Assicurati di selezionare la modalità di elaborazione dell'intervallo di area di picco e il Conteggio Totale degli Ioni per la normalizzazione. Clicca su OK. Appariranno nuove colonne con i dati corrispondenti. Per esportare i dati, seleziona la freccia che punta verso l'esterno e salva come .csv.

Risultati

Un'attenta elaborazione di un fegato da un topo di tipo selvatico, incluso il taglio di una sezione trasversale completa (Figura 1A), ha permesso la definizione del glycome tramite MALDI-MSI, con diversi oligosaccaridi derivati dal glicogeno e glicani N-linked su un intervallo di m/z (Figura 1B). Il glicogeno era ampiamente localizzato in tutti gli epatociti epatici e privo di vasi e tessuto connettivo nei tratti portali, come previsto (Figura 1C,D). È importante sottolineare che i dati MALDI-MSI hanno permesso di misurare sia la distribuzione spaziale del glicogeno sia la distribuzione della lunghezza della catena, una caratteristica chiave del glicogeno nel metabolismo normale e negli stati patologici (Figura 1D). Inoltre, diversi glicani legati al N presentano organizzazioni diverse. La distribuzione spaziale osservata varia da ampiamente distribuiti negli epatociti (Figura 1E) a fochi regionali, coerenti con l'organizzazione sinusoidale del fegato (Figura 1F), fino all'etichettatura specifica degli elementi del tratto porta (Figura 1G-I).

figure-results-1
Figura 1: Analisi GLYCOME MALDI-MSI del fegato del topo. (A) Schema per metodi critici nella preparazione del campione, acquisizione dati e analisi. (B) Campionare spettri di massa derivati dall'approccio. Le frecce in rosso mostrano gli oligosaccaridi regolarmente distanziati derivati dal glicogeno, che differiscono per un monosaccharide di glucosio. Le frecce in blu indicano N-glicani, che si trovano distribuiti lungo gli spettri. Nel fegato, i picchi di glicogeno sono generalmente più evidenti, specialmente a valori m/z più alti. (C) Distribuzione spaziale del maltoesaosio (DP6) derivato dal glicogeno nel fegato. (D) Distribuzione delle lunghezze della catena di glicogeno nel fegato. (E-G) Distribuzione spaziale delle diverse specie di glicani N-linked nel fegato. (H) Colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) per una regione centrale focalizzata, insieme ad annotazioni anatomiche. (I) Inset focalizzato corrispondente che mostra la localizzazione spaziale di ulteriori glicani N-linked (Hex5dHex1HexNAc5) negli elementi del tratto porta. Barre in scala: 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

MALDI-MSI è uno strumento emergente per la biologia spaziale dei glycome. È importante sottolineare che, sebbene questo protocollo si concentri sulla raccolta dati utilizzando hardware specifico, può essere facilmente adattato alle piattaforme MALDI-MSI di piùfornitori 13. L'elaborazione dei campioni è identica fino al metodo 4, anche se alcuni fornitori possono richiedere l'uso di diapositive specializzate. Le modifiche alla raccolta dati, utilizzando parametri specifici per la piattaforma MALDI-MSI, consentono un rapido adattamento di questo protocollo. Software specifico per il fornitore per l'elaborazione dei dati può essere utilizzato, come dettagliato nel passo 5, oppure, in alternativa, piattaforme per un elaborazione dati MALDI-MSI rigorosa e riproducibilepossono essere impiegate 19.

MALDI-MSI è uno strumento particolarmente utile per comprendere la biologia, poiché organi, tessuti e cellule diversi hanno modelli differenti per il loro glicoma. Il fegato è particolarmente adatto all'analisi del glicome in quanto contiene alti livelli di glicogeno e diversi glicaniN-linked 13. Altri organi presentano livelli più elevati e una diversità di glicani N-linked e livelli più bassi diglicogeno 13. È importante sottolineare che il glycome varia tra i diversi organi a seconda dello stato metabolico e patologico dell'organismo, e quindi il glycome fornisce una ricca fonte di informazionibiologiche 5,14,15,20. Lo sviluppo continuo di enzimi unici attivi nei carboidrati per l'analisi MALDI-MSI promette di estendere l'analisi del glycome ad ulteriori biomolecole ortogonali nel glicoma.

Pur avendo molti vantaggi, MALDI-MSI è attualmente limitato in risoluzione rispetto ad altri strumenti utilizzati in biologia spaziale. Questo protocollo utilizzava la raccolta dati con risoluzione di 50 μm. Sebbene eccellenti per l'analisi fisiologica, i dati a risoluzione a singola cellula avanzerebbero significativamente il campo21. In particolare, la delocalizzazione può rappresentare un ostacolo significativo a una maggiore risoluzione in metodologie che utilizzano la spruzzatura enzimatica e la successiva incubazione in condizioni umide. I recenti progressi nell'hardware per l'elaborazione dei campioni, nelle metodologie di gestione dei campioni, nell'hardware di acquisizione dati, nell'uso dell'etichettatura selettiva e nell'elaborazione dati stanno permettendo alla raccolta dati MALDI-MSI di avvicinarsi alla risoluzionecellulare 22,23. Tuttavia, esistono compromessi tra risoluzione e rapporto segnale/rumore e limitazioni intrinseche basate sui metodi attuali di preparazione del campione per MALDI che devono essere considerati. Applicazioni molto specifiche stanno già raggiungendo l'obiettivo del MALDI-MSI risolto da singola cella utilizzando innovazioni sia nell'elaborazione delcampione 24 sia in algoritmi innovativi, suggerendo che soluzioni generali a questi problemi sianoraggiungibili 25,26,27.

Dopo la raccolta dei dati, il vetrino può essere colorato tramite H&E ai fini dell'annotazione istologica. Tuttavia, danni cellulari e tissutali sono associati alla raccolta dei dati MALDI-MSI, quindi questa strategia limita l'estensione dell'annotazione cellulare. In alternativa, per H&E si possono utilizzare fette di tessuto sequenziali. Questa strategia fornisce dati di alta qualità, ma richiede allineamento e integrazione di tagli di campioni discreti.

Da notare che i tessuti con paraffina fissata in formalina (FFPE) sono molto adatti all'analisi glycome da MALDI-MSI con piccole modifiche nel protocollo per la preparazione delcampione 13. Tuttavia, il tessuto FFPE non può essere utilizzato efficacemente per metabolomica e altre analisi simili, quindi i campioni fresco-congelati, come descritto qui, sono preferiti per gli approcci multiomici28. La preparazione del campione è un componente critico di qualsiasi pipeline MSI per biomolecole labili, che richiede approcci speciali per la raccolta e la gestione deicampioni 17,29,30.

Le metodologie per espandere la generalità e l'uso diffuso degli approcci basati su MALDI-MSI stanno progrediendo rapidamente con miglioramenti drammatici nell'hardware enel software 19. Inoltre, i recenti approcci all'avanguardia multiomic28 e multimodal21 , combinati con machine learning e intelligenza artificiale, sono particolarmente promettenti per gestire questi dataset altamentecomplessi 31.

Dichiarazioni

R.C.S., M.S.G. e C.W.V.K. sono co-direttori del Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR) presso l'Università della Florida e cofondatori di Sugar3 LLC. R.C.S. ha ricevuto supporto per la ricerca e/o compensi di consulenza da Maze Therapeutics. M.S.G. ha ricevuto supporto per la ricerca, composti per la ricerca o spese di consulenza da Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics e Aro Biotherapeutics. M.S.G. è membro del comitato scientifico consultivo di Chelsea's Hope, Glut1-Deficiency Syndrome Foundation e Adult Polyglucosan Body Disease Foundation.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri dei laboratori Vander Kooi, Sun e Gentry per le discussioni fruttuose. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dei National Institutes of Health (NIH) al Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility del Markey Cancer Center dell'Università del Kentucky, P30CA177558 al D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 al R.C.S., R35NS116824 al M.S.G., R01DC019054 al C.W.V.K. e al College of Medicine dell'Università della Florida.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sottopad assorbenteDenville ScientificB1623
Acetonitrile (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
Carta stagnolaFisher Scientific 15078292
Anidride citraconicaSigma-Aldrich125318
Tubo conico (15mL)Alkali ScientificCW5600
Vasi CoplinDWK Scienze della Vita900570
Criostato LeicaCM1860
Schermo criostaticoLeica14041926491
EssiccatoreBel ArtF424004131
Coppa per dialisiThermo Fisher88400
EtanoloFisher Scientific 22032601
Vaporizzatore per ciboRival CKRVSTLM21   
Inserto in vetro (70 mm)Gel CompanyLGI50
GlicogenoSigma-AldrichG8876Standard
Perossidasi di rafano (HRP)Sigma-AldrichP8125Standard
Acqua HPLCSigma-Aldrich270733-4X4L
Spruzzatore HTXTecnologie HTXM5
Acido cloridricoFisher Scientific A144-500
IsoamilasiMegazimaE-ISAMY
Pompa KnauerKnauerP 4.1 S
Lama a profilo bassoScienze della microscopia elettronica63059-01
Supporto di montaggio M1Epredia1310
Spettrometro di massaBruker DaltonicstimsTOF fleX
Tubo Microfuge (1,5mL)Alkali ScientificCN3016
AgoBD305109
NBF con formalina neutrale bufferedMillipore sigmaHT501128-4L
Gas azotoAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific SH30256. FS
Tubi PCRPartner MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA & nbsp;Biografia del BulldogNZPULT10LY
SCiLS LabBruker Daltonics1889000
ShakerThermo Scientific88882007
Diapositiva   Scienze del microscopio elettronico71873-02
Spostatore a diapositiveProdotti RPI212620A
Sonicater (Bioruptor Pico)DiagenodeB01080010
Pinza SterileDR InstrumentsS08098
Bisturi sterileWPIWPI-500240
Forbici SterilesStrumenti scientifici di qualità14084-08
Siringa   Grainger19G342
Pompa a siringaNuova EraNE-300
NastroFisher Scientific 15-901-R
Pennello sottileAnezus#00
Acido trifluoroaceticoSigma-AldrichT6508-1L
Tune Mix, ESI a bassa concentrazioneAgilentG1969-85000
Barche a pesoSigma-AldrichHS120882
XyleneSigma-Aldrich534056
&alfa;-ciano-4-acido idrossicinnamico (CHCA)Azienda Chimica delle Cayman15254

Riferimenti

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

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