Articolo metodologico

Metodi di clamp dinamico per studiare l'eccitabilità neuronale compromessa associata all'autismo

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DOI:

10.3791/69155

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17 ottobre 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

In questo articolo

Sommario

L'elettrofisiologia dinamica del clamp può stabilire collegamenti causali tra i deficit di attivazione neuronale e la disfunzione dei canali ionici. Descriviamo i metodi e i protocolli di clamp dinamico nei neuroni cerebellari di Purkinje di topo, rilevando risorse utili e considerazioni tecniche. In uno studio rappresentativo, abbiamo aggiunto la conduttanza del sodio modellata ai neuroni Tsc1-/- di Purkinje per evitare l'attivazione ripetitiva.

Abstract

Il disturbo dello spettro autistico (ASD) deriva da una vasta gamma di fattori genetici e ambientali. Mentre numerose mutazioni legate all'ASD interrompono lo sviluppo o la plasticità delle sinapsi, è stato dimostrato che un numero crescente altera l'espressione e il funzionamento dei canali ionici voltaggio-dipendenti, con conseguente deficit nell'eccitabilità intrinseca neuronale. Le registrazioni di voltage-clamp su cellule intere possono essere utilizzate per caratterizzare il modo in cui le mutazioni correlate all'ASD influenzano la funzione dei canali ionici. Tuttavia, questi esperimenti non riescono a valutare direttamente come una conduttanza ionica alterata influenzi l'attivazione del potenziale d'azione neuronale. L'elettrofisiologia dinamica a morsetto colma questa lacuna consentendo l'iniezione in tempo reale di conduttanze ioniche definite dall'utente nei neuroni viventi. Ciò consente di testare causalmente come i cambiamenti nelle proprietà dei canali ionici influenzano l'attività elettrica di un determinato tipo di cellula. In questo articolo sui metodi, descriviamo come implementare l'elettrofisiologia dinamica del clamp nei neuroni di Purkinje di topo adulto registrati in condizioni fisiologiche in fette di cervello cerebellare preparate acutamente. I neuroni di Purkinje sono un modello particolarmente rilevante per questo lavoro perché hanno una capacità intrinseca di attivare potenziali d'azione ripetitivi ad alta frequenza (20-100 Hz) e sono costantemente implicati nella disfunzione del circuito cerebellare correlata all'ASD. Ci concentriamo su Tsc1, un gene le cui mutazioni con perdita di funzione sono tra le cause monogeniche più comuni di ASD. Nei neuroni di Purkinje di topo, la delezione di Tsc1 è stata anche collegata a una ridotta espressione del canale del sodio voltaggio-dipendente (Nav). Utilizziamo i modelli di stato cinetico di Markov per simulare e riprodurre le proprietà della conduttanza Nav del neurone di Purkinje e continuiamo a utilizzare il morsetto dinamico per valutare direttamente come i cambiamenti nella conduttanza Nav influenzino l'attivazione intrinseca dei neuroni cerebellari di Purkinje intatti. Forniamo istruzioni e risorse per la modifica e la messa a punto dei modelli di conduttanza ionica. Integrando la modellazione della conduttanza ionica, il clamp dinamico e le tecniche convenzionali di patch-clamp, questo approccio fornisce un quadro potente e flessibile per collegare le perturbazioni genetiche agli esiti fisiologici nei neuroni rilevanti per l'ASD.

Introduzione

Precedenti indagini sui driver molecolari e cellulari del disturbo dello spettro autistico (ASD) hanno spesso enfatizzato la disfunzione sinaptica come centrale per la fisiopatologia del disturbo 1,2. Numerosi studi hanno dimostrato un aumento della densità delle sinapsi eccitatorie 2,3,4, una potatura sinaptica compromessa5 e alterazioni delle proteine della densità postsinaptica 6,7 nei modelli ASD. Tuttavia, lavori recenti hanno dimostrato che i cambiamenti nell'eccitabilità neuronale intrinseca sono anche fattori determinanti della patologia ASD. Ad esempio, i modelli murini transgenici ASD e le linee cellulari derivate da pazienti hanno rivelato un'alterata generazione di potenziale d'azione nei neuroni cerebellaridi Purkinje 8,9,10 e corticali piramidali11, nonché un'attenuata eccitabilità dendritica e integrazione sinaptica in sottoclassi di neuroni corticali piramidali12. Le canalopatie che coinvolgono mutazioni con perdita di funzione in SCN2A, che codifica per la subunità α che forma i pori del canale del sodio voltaggio-dipendente (Nav) Nav1.2, è ora una causa monogenica ben nota di ASD13 e ha dimostrato di causare deficit nell'eccitabilità intrinseca di varie classi di neuroni centrali 14,15,16,17. Man mano che questi tipi di indagini progrediscono, è importante stabilire collegamenti causali tra i cambiamenti patogeni nelle conduttanze ioniche e gli effetti di questi cambiamenti sulla funzione dei neuroni e dei circuiti. L'elettrofisiologia dinamica del clamp fornisce un approccio efficace per questo compito. Sharp et al. (1992 e 1993)18,19, insieme a Robinson e Kawai (1993)20 hanno inizialmente descritto metodi di clamp dinamico in cui una conduttanza ionica non lineare simulata, con o senza proprietà voltaggio-dipendenti, viene iniettata/aggiunta nei neuroni viventi, consentendo ai ricercatori di valutare in tempo reale come le proprietà o i presunti cambiamenti in una conduttanza ionica voltaggio-dipendente influenzano l'attivazione neuronale21, 22.

L'implementazione di esperimenti di clamp dinamici è stata facilitata da diversi sistemi software disponibili gratuitamente come RTXI23, QuB 24,25 e StdpC26; Tuttavia, i recenti progressi hanno semplificato l'implementazione del morsetto dinamico con sistemi plug-and-play commerciali che consentono di sviluppare, modificare e applicare le conduttanze del modello su un singolo computer e all'interno di un unico pacchetto software. Qui, forniamo protocolli per eseguire il clamp dinamico utilizzando un sistema Sutter dPatch27 e forniamo un'indagine campione in cui testiamo come la delezione mirata della sclerosi tuberosa 1 (Tsc1)9, che è un locus prevalente di mutazioni per ASD28, influenzi l'attivazione intrinseca dei neuroni cerebellari di Purkinje a seguito di cambiamenti nell'espressione della conduttanza del sodio voltaggio-dipendente8.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dalle linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Miami (Protocollo #1044). Gli esperimenti hanno utilizzato topi C57BL/6J maschi e femmine wild-type e linee transgeniche con un background di ceppo C57BL/6J. Per gli esperimenti elettrofisiologici, gli animali sono stati invecchiati 6-7 settimane. Tutte le registrazioni sono state prese dai neuroni di Purkinje nei lobuli 5, 6 o 7 nel verme cerebellare.

1. Impostazione e preparazione dei tessuti per esperimenti di patch-clamp dei neuroni di Purkinje

  1. Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente: 125 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 25 mM di NaHCO3, 2 mM di CaCl2, 1 mM di MgCl2 e 25 mM di destrosio a pH 7,4 (~300 mOsM/L). Preparare anche 250 mL di "soluzione di taglio" contenente: 240 mM di saccarosio, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 0,5 mM di CaCl2 e 7 mM di MgCl2. Sparge (bolle) ACSF e soluzioni di taglio con gas carbogeno (95 % O2/ 5% CO2) per almeno 20 minuti prima dell'uso e continuamente durante tutti gli esperimenti.
  2. Preparare una camera di contenimento della fetta di cervello riempita con ACSF per un uso successivo. Assicurarsi che le fette cerebellari (una volta aggiunte alla camera delle fette) siano immerse con entrambi i lati delle fette cerebellari esposte all'ACSF. A tale scopo, posiziona le fette sommerse su una rete di nylon ben tesa anch'essa sommersa.
  3. Preparare la postazione operatoria. Pronti quattro pezzi di nastro adesivo che serviranno per appuntare l'animale anestetizzato. In un secchio o in una vaschetta piena di ghiaccio, posiziona la metà inferiore di una capsula di Petri nel ghiaccio con le pareti rivolte verso il basso e il fondo della capsula di Petri rivolto verso l'alto. Posizionare una carta da filtro (≥ 3 cm2) sul fondo della piastra di Petri e saturare con 2-3 ml di soluzione di taglio.
    NOTA: Per gli esperimenti descritti, viene utilizzato un vibratomo compresso per affettare fette cerebellari parasagittali da 350 μM. Con l'imprecato, il tessuto per l'affettatura viene incollato a un tubo di plastica che si inserisce attraverso un sottile tubo metallico circostante. Durante l'affettatura, il tubo del campione viene spinto attraverso il tubo metallico, che rimane fisso. Dopo che il tessuto è stato incollato alla provetta del campione, il tessuto viene incorporato in agarosio riscaldato al 2%. La lama dell'impacco è incollata su un supporto fisso, che è fissato al braccio del vibratomo. Altri tipi di vibratomi non richiedono l'inclusione di tessuto nell'agarosio riscaldato, ma dovrebbero funzionare altrettanto bene per gli esperimenti descritti.
  4. Inoltre, nel ghiaccio, posizionare una lama di rasoio a taglio singolo e un piccolo bicchiere (10 ml) riempito con soluzione da taglio. Tenere un blocco refrigerante, che viene utilizzato per raffreddare rapidamente l'agarosio riscaldato una volta aggiunto alla provetta, nonché una siringa da 30 ml riempita con soluzione di taglio raffreddata sul ghiaccio. Assicurarsi che la siringa da 30 ml sia collegata a una sezione di 30-60 cm di tubo endovenoso (IV) (tramite cono maschio Luer lock) collegata (all'estremità terminale) a un ago (≥ 26 G) con base femmina Luer lock.
  5. Mettere la soluzione di taglio rimanente in un congelatore a -80 °C. Una volta che questa soluzione di taglio diventa una granita di ghiaccio (20-25 min), toglietela dal congelatore a -80 °C e mettetela sul ghiaccio.
  6. Anestetizzare un topo adulto di 5-8 settimane con un'iniezione intraperitoneale di 1 mL/kg di peso animale di ketamina (10 mg/mL)/xilazina (0,25 mg/mL).
  7. Preparare una soluzione di agarosio al 2% sciogliendo 0,5 g di agarosio in 25 mL di soluzione di taglio. Dopo che l'animale è stato anestetizzato (non risponde al pizzicamento delle dita), riscaldare la soluzione di agarosio al 2% (~30 s in microonde) e trasferire la soluzione di agarosio riscaldata in un bagno d'acqua a 40 °C.
    NOTA: I passaggi numerati da 1.8 a 1.18 devono essere completati con urgenza e prima che l'agarosio riscaldato si solidifichi.
  8. Appuntare gli arti dell'animale al tavolo operatorio con del nastro adesivo. Usando le forbici, apri la cavità toracica dell'animale, assicurandoti che i polmoni e gli organi addominali non vengano tagliati. Usa una pinza di bloccaggio o un emostatico per tenere aperta la gabbia toracica, esponendo il cuore. Per fare ciò, bloccare la pinza sullo sterno e appoggiarla con cura verso la parte anteriore dell'animale (con i fori per le dita dell'utensile vicino alla testa dell'animale).
  9. Inserire l'ago collegato alla siringa da 30 ml nel ventricolo sinistro e utilizzare una pinza per comprimere il tessuto attorno all'ago, tenendo l'ago all'interno della camera intraventricolare sinistra. Utilizzando le forbici chirurgiche, praticare un piccolo taglio nell'atrio destro e perfondere rapidamente l'animale con i 25 ml di soluzione di taglio refrigerata.
    NOTA: Assicurarsi che il perfusato entri nel ventricolo sinistro ed esca dall'atrio destro, eliminando il sangue dal sistema circolatorio dell'animale.
  10. Quando la perfusione è completa, decapitare rapidamente l'animale e tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana della testa verso il bregma per esporre la superficie del cranio.
  11. Usando le forbici, rimuovere il tessuto connettivo dalla parte posteriore del cranio e rimuovere il tessuto del midollo spinale in eccesso, assicurandosi che il midollo spinale non sporga dal forame magno.
  12. Posizionare una lama a forbice nel forame magno e tagliare lungo la circonferenza del cranio su entrambi gli aspetti temporali verso il bregma, lasciando un po' di tessuto cranico in posizione al bregma.
  13. Posiziona una lama a forbice o metà di una pinza sottile nel forame magno e solleva superiormente, separando il cranio dal cervello. Fai attenzione a non spingere la lama della forbice o la pinza nel cervello mentre sollevi il cranio.
  14. Utilizzare uno strumento chirurgico a spatola per scavare sotto il cervello (dalla parte anteriore) e rimuovere con cautela il cervello nel becher da 10 ml contenente soluzione di taglio raffreddata, facendo attenzione a proteggere il cervelletto durante il trasferimento del cervello. A questo punto indossare guanti puliti.
  15. Rimuovi con cautela il cervello dal becher (usando lo strumento a spatola) e posizionalo sulla carta da filtro (su una capsula di Petri). Utilizzare la lama a un taglio per tagliare lungo l'asse parasagittale a pochi millimetri dalla linea mediana. Scartare il tessuto sezionato parasagittale più piccolo. Fai un secondo taglio coronale a metà del proencefalo (anteriore al cervelletto). Scartare il tessuto tagliato coronalmente che si trova anteriormente al cervelletto.
  16. Infilare la lama a taglio singolo sotto la porzione anteriore del proencefalo e sollevarla per ruotare il tessuto rimanente in modo che il lato del taglio parasagittale iniziale sia rivolto verso il basso (sulla carta da filtro) e l'emisfero cerebellare non tagliato sia rivolto verso l'alto.
  17. Posizionare la provetta in posizione verticale nel ghiaccio e aggiungere un sottile strato di supercolla (adesivo cianoacrilato) sulla superficie della provetta. Utilizzando uno strumento a spatola con una curva di 90°, trasferire con cura il tessuto cerebrale dalla carta da filtro alla superficie del tubo del campione, mantenendo l'orientamento del tessuto. Assicurarsi che l'emisfero cerebellare non tagliato continui ad essere rivolto verso l'alto. Una volta che il tessuto è stato posizionato/incollato sul tubo del campione, far scorrere il tubo di metallo verso l'alto in modo che circondi il tessuto cerebrale.
  18. Utilizzando una pipetta motorizzata da 10 mL, riempire la provetta con l'agarosio riscaldato (che incorpora il tessuto cerebrale). Raffreddare rapidamente il tessuto (ora incorporato nell'agarosio riscaldato) bloccando il blocco di raffreddamento attorno al tubo metallico per ~30 s.
  19. Posizionare il tubo del campione nella camera del bagno del vibratomo e riempire il bagno con la soluzione di taglio granita. Spargere continuamente la soluzione di taglio durante l'affettatura del tessuto cerebrale, ma non esporre direttamente le fette cerebellari alle bolle di gas.
  20. Tagliare fette parasagittali da 300-350 μm, trasferendo immediatamente ogni fetta nella camera di contenimento delle fette, riempita con ACSF sparso a temperatura ambiente. Una volta che tutte le fette sono nella camera delle fette, incubare la camera delle fette in un bagno d'acqua a 33 °C per 25 minuti.
  21. Dopo 25 minuti a bagnomaria, posizionare la camera delle fette (di nuovo) a temperatura ambiente, aspettando almeno altri 35 minuti prima di tentare le registrazioni dei patch da una qualsiasi delle fette cerebellari.

2. Configurazione di un modello di conduttanza basato su Markov in morsetto dinamico

NOTA: Il morsetto dinamico è l'applicazione in tempo reale di una conduttanza modellata a una cellula vivente. La tensione della membrana viene registrata/campionata tramite un elettrodo sharp o patch e il segnale digitalizzato viene inviato al software di pinza dinamica, che calcola, utilizzando i modelli di conduttanza ionica applicati, l'iniezione di corrente di pinza dinamica appropriata per la tensione campionata. Il segnale di iniezione della corrente di pinzatura dinamica calcolato viene inviato all'amplificatore e allo stadio di testa per essere iniettato (tramite elettrodo) nella cella. Affinché una conduttanza modellata possa essere aggiunta in modo appropriato a una cella che spara potenziali d'azione, che guidano cambiamenti transitori rapidi nella tensione di membrana, la frequenza di campionamento della tensione deve essere sufficientemente alta e il ritardo tra il campione di tensione e l'iniezione di corrente di clamp dinamica (a volte chiamato latenza) dovrebbe essere minimo e invariante29.

  1. Prima di qualsiasi esperimento di clamp dinamico, sviluppare o ottenere il modello matematico per la conduttanza ionica o le conduttanze ioniche da utilizzare nell'esperimento di clamp dinamico. Questi modelli possono essere sotto forma di un modello di stato cinetico di Markov, di un modello di Hodgkin-Huxley (HH) o di conduttanza passiva (lineare). Assicurarsi che il modello di conduttanza scelto riproduca accuratamente le proprietà cinetiche e dipendenti dalla tensione della conduttanza ionica prevista.
    NOTA: Gli sperimentatori possono confermare le proprietà di una conduttanza ionica modellata, prima dell'uso in esperimenti di clamp dinamico, testando la conduttanza modellata (in silico) in studi di simulazione del voltage-clamp. Le proprietà e le considerazioni importanti dello stato cinetico di Markov e dei modelli di conduttanza HH sono descritte nella sezione Discussione. I passaggi seguenti descrivono l'impostazione di un modello di conduttanza Markov nel software di bloccaggio dinamico.
  2. Creare o ottenere un diagramma di transizione di stato di Markov per il modello di conduttanza da utilizzare negli esperimenti di clamp dinamico. Utilizzare questo diagramma per assemblare con precisione il modello di conduttanza di Markov all'interno del software di bloccaggio dinamico (descritto di seguito).
    NOTA: SutterPatch è il software di acquisizione dati dell'amplificatore dPatch. Gli esperimenti di clamp dinamico possono essere eseguiti all'interno del software, il che consente l'assemblaggio e l'applicazione di conduttanze modellate tramite iniezione di corrente durante i protocolli di current-clamp. Nella Figura 1A è mostrato un diagramma di transizione di stato di Markov per una conduttanza di sodio voltaggio-dipendente modellata, basata sulle misurazioni della corrente Nav dai neuroni di Purkinje del topo. Questo modello è stato sviluppato da Ransdell et al., 202230 ed è stato utilizzato per studiare il ruolo dei componenti persistenti e risorgenti della corrente di sodio nell'attivazione dei neuroni di Purkinje31. Gli stati di gating (C, IC, IF, IS e O) sono interconnessi da costanti di velocità di transizione, indicate da variabili (ad esempio, S0, S3, S1, S4). Questo modello viene utilizzato negli esperimenti di morsetto dinamico rappresentativo ed è disponibile per il download su GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. Nel software di acquisizione dati, aprire la finestra Dynamic Clamp Editor dalla scheda SutterPatch > Dynamic Clamp Editor o facendo clic sull'icona corrispondente nella finestra Dashboard . Parti della finestra dell'editor di morsetti dinamici sono mostrate nella Figura 1B.
    NOTA: La finestra Dynamic Clamp Editor contiene tutte le impostazioni necessarie per applicare la conduttanza modellata durante un protocollo di registrazione current-clamp. L'interfaccia del pool di conduttanze (Figura 1B, in alto a sinistra) consente agli utenti di organizzare e caricare contemporaneamente gruppi di conduttanze del modello.
  4. Nell'interfaccia del pool di conduttanza (Figura 1B, in alto a sinistra), creare un pool facendo clic su Nuovo e denominandolo come desiderato. Una volta selezionato un pool di conduttanza, a destra della finestra nell'interfaccia di selezione Headstage (Figura 1B, in basso a sinistra), selezionare il tipo di modello per il rispettivo pool di conduttanza (Modello- Markov, Hodgkin-Huxley, conduttanza variabile, ecc.) e quando applicare la conduttanza o le conduttanze del modello, ad esempio durante una routine/protocollo (Modalità attiva). L'interfaccia di selezione dell'headstage consente inoltre di selezionare la frequenza di aggiornamento del morsetto dinamico (in kHz) e la sorgente del segnale di tensione (vedere la Figura 1B, a destra). Per Voltage Signal Source, selezionare l'headstage che sta registrando il voltage segnale.
  5. Nel pannello di selezione Headstage , per l'esempio di modello Markov di conduttanza Nav (Figura 1A), selezionare Modello Markov per Modello, Durante gli sweep per la modalità attiva, 200 kHz per la frequenza di aggiornamento e Headstage 1 per la sorgente del segnale di tensione. Controllare il segnale di applicazione e comando a AuxOUT1 per avviare i calcoli del modello in risposta al segnale di tensione e aggiungere l'iniezione dinamica di corrente di pinza a qualsiasi protocollo di pinza amperometrica, rispettivamente (Figura 1B, in basso a sinistra).
  6. Sotto i pannelli principali dell'editor Dynamic Clamp c'è la matrice di stato (Figura 1C, in basso). Per modificare la matrice di stato, fare clic su Modifica parametri modello nell'interfaccia del selettore Headstage (Figura 1B, in basso a sinistra). Apparirà una nuova finestra accanto all'editor chiamata Parametri del modello Markov Dynamic Clamp. In questo pannello, inserisci le equazioni della matrice di stato che rappresentano la conduttanza del modello di Markov.
  7. Nel pannello Impostazioni canale (Figura 1B, in alto a destra), selezionare quali modelli di conduttanza salvati devono essere applicati (in morsetto dinamico). In alternativa, selezionare un canale vuoto e iniziare a creare un nuovo modello di conduttanza. A destra di questo pannello, inserisci l'inversione V (potenziale di inversione degli ioni di conduttanza modellata). Per il nostro studio che utilizza una conduttanza di sodio, inserire 55,0 mV per riflettere il potenziale di inversione del sodio basato sull'ACSF e sulla soluzione interna dell'elettrodo patch.
  8. Sempre nel pannello Impostazioni canale , fornire il numero di stati cinetici della conduttanza selezionata (vedere la Figura 1B, in alto a destra, riquadro rosso). Qui, inserisci 9 per riflettere i 9 stati cinetici della conduttanza modellata (vedi Figura 1A).
  9. Sotto il pannello Impostazioni canale si trova il pannello Equazioni di stato . Posizionare le equazioni della costante di velocità di transizione dello stato in modo appropriato nella matrice dello stato di gating per riflettere la disposizione topologica del modello di Markov. Inserire le equazioni nel pannello Equazioni di stato e fornire un ID, a partire da "S0" (Figura 1B, al centro).
    NOTA: L'ordine con cui vengono inserite queste equazioni non è importante, purché queste variabili siano popolate in modo appropriato nella matrice dello stato di gating per riflettere la topologia del modello di Markov.
  10. Per popolare la matrice dello stato di gating con le variabili costanti di velocità ora definite, fare clic su Modifica matrice di stato sul lato destro del pannello Equazioni di stato (Figura 1B, al centro). Ad ogni stato cinetico viene assegnato un numero, a partire da 0. Ad esempio, per un modello a due stati cinetici, contenente gli stati X e Y, questi stati saranno chiamati "0" e "1" e includeranno due costanti di velocità di transizione a1 e b1, dove a1 passa da 0 a 1 e b1 passa da 1 a 0.
  11. Per collegare in modo appropriato queste equazioni utilizzando l'editor della matrice di stato (Figura 1B, in basso), inserire le costanti di velocità in una tabella contenente righe e colonne numerate, entrambe a partire da 0 (vedere l'esempio nella Figura 1C).
    NOTA: Il movimento da uno stato all'altro è determinato dalla loro posizione in questa tabella nella forma "da riga a colonna". Ad esempio, nell'esempio del modello a due stati nel passaggio 2.1, la transizione dallo stato 0 allo stato 1 si basa sulla costante di velocità "a1" che viene quindi inserita nella riga 0, colonna 1. La costante di velocità di transizione "b1" guida le transizioni dallo stato 1 allo stato 0, quindi la costante di velocità deve essere posizionata nella riga 1, colonna 0. Nella Figura 1C, la matrice di stato di gating di esempio ha costanti di velocità che riflettono la topologia del modello di conduttanza Nav mostrato nella Figura 1A. Ad esempio, "S0" è la costante di velocità che definisce le transizioni dallo stato cinetico IC1 a quello IC2; quindi, "S0" è posizionato nella riga 0, colonna 1 della matrice dello stato di gating (Figura 1C). Le equazioni della costante di velocità di transizione che definiscono la variabile di ciascuna costante di velocità popolano quindi una matrice di stato riempita (Figura 1C, in basso).
  12. Poiché le equazioni della costante di velocità sono collegate tramite il pannello dell'editor della matrice di stato, le connessioni (la riga e la colonna corrispondenti) popoleranno il pannello Connessioni accanto all'equazione (Figura 1B, al centro a destra). Prendere nota dello stato Aperto/Conduttivo nel modello rappresentativo di conduttanza del sodio (Figura 1A), aggiunto alla riga e alla colonna 7 della Figura 1C (in alto, caselle rosse), che è importante per il passaggio successivo.
  13. Nella Figura 1B (in basso a destra), utilizzare il pannello Equazioni di conduttanza (nS) per definire l'ampiezza della conduttanza del modello che verrà applicata durante il clamp dinamico. Selezionare gli stati aperto/conduttore nel modello di Markov e fornire un valore di conduttanza (Figura 1B, in basso, riquadro rosso).
  14. Per questo esperimento, inserire "400 nS" nella casella "G7", che aggiunge valori di corrente di picco di Nav simili alle correnti di picco di Nav misurate negli studi di voltage-clamp su neuroni di Purkinje di topo.
  15. Una volta completati i passaggi precedenti, fare clic su Carica per preparare il modello per l'applicazione della pinza dinamica una volta avviata una routine di pinza di corrente.
  16. Utilizzare un processo simile per organizzare i modelli HH; tuttavia, aggiungi le equazioni per definire gli stati di gating indipendenti (nelle equazioni di gate) e la conduttanza sotto il massimo G.
  17. Per applicare la conduttanza dinamica del clamp, creare prima una routine di current-clamp utilizzando l'editor di routine (fare clic sulla scheda SutterPatch >editor di routine) (Figura 1D). Per creare una routine di pinza di corrente, selezionare il canale di uscita principale (che in questo esempio è StimOut1). Si aprirà un pannello che consente all'utente di definire l'output del comando corrente durante la routine. Assicurarsi che la modalità di registrazione sia impostata su CC_Mode nell'editor routine.
    NOTA: Negli esperimenti rappresentativi, poiché questo protocollo funziona con celle che si attivano spontaneamente, viene utilizzata una routine/protocollo di current-clamp senza interruzioni che ha un'iniezione di corrente pari a zero.
  18. Nei canali di input dell'editor di routine (Figura 1D, in alto a destra), definire i segnali di input che, durante gli esperimenti, popoleranno le finestre dell'oscilloscopio registrate. Questi ingressi devono includere un segnale di tensione e includere anche l'iniezione di corrente di comando della routine, nonché l'iniezione di corrente di pinzatura dinamica, denominate rispettivamente Current1 e AuxIN1 (Figura 1D, in basso a sinistra).
  19. Per le routine di pinza di corrente che prevedono comandi di iniezione di corrente positiva e/o negativa, il segnale di iniezione di corrente di comando verrà automaticamente combinato con il segnale dinamico di corrente di pinza. Creare una finestra di oscilloscopio virtuale per sottrarre il segnale di corrente del comando in modo che vi sia una registrazione dell'iniezione di corrente di morsetto dinamico isolata. Per creare la nuova finestra dell'ambito virtuale, selezionare innanzitutto un canale di ingresso aggiuntivo selezionando la casella di controllo Virtual1.
  20. All'interno dell'editor di routine, in Tipo matematico, selezionare Equazione e selezionare (in Canale di origine) il segnale di input del comando della routine di bloccaggio della corrente, che in questo esempio è Corrente1. Inserire un'equazione in campo aperto per sottrarre il segnale di comando della pinza di corrente dal segnale di iniezione della corrente di pinza dinamica.
    NOTA: Per questo esperimento di esempio, questo viene fatto con l'equazione t[3]-t[2]. La finestra dell'oscilloscopio Virtual1 ora mostra l'iniezione dinamica di corrente di pinza (isolata dal segnale del comando di corrente). Gli utenti hanno la possibilità di personalizzare le etichette dei canali di input o output facendo doppio clic su Label.

3. Acquisizione di registrazioni di current-clamp da neuroni di Purkinje di topo in fette cerebellari parasagittali

  1. Equipaggiare l'impianto di elettrofisiologia con una camera di fetta di tessuto che sia (gravità) perfusa con ACSF riscaldata a una temperatura prossima a quella fisiologica (34-36 °C). Posizionare con cura una fetta cerebellare parasagittale nella camera della fetta e utilizzare un'arpa a fette per mantenere la fetta cerebellare in una posizione sommersa e fissa. Assicurarsi che anche un elettrodo di terra clorato e una sonda di temperatura siano immersi e stabili all'interno della camera a fette cerebellare.
  2. Individua lo strato di neuroni di Purkinje utilizzando un obiettivo a immersione 40x. I neuroni di Purkinje sono grandi e a forma di lacrima. La membrana plasmatica delle cellule sane di Purkinje appare tipicamente liscia e il nucleo non è visibile.
  3. Una volta identificato un neurone di Purkinje sano e mirato per la registrazione del patch-clamp, regolare la lente dell'obiettivo del microscopio verso l'alto. Posizionare e mettere a fuoco la punta di un microelettrodo di vetro collegato a un portaelettrodo e all'headstage. Controllo dell'headstage/microelettrodo con un micromanipolatore robotico a 3 assi.
    NOTA: Per questi esperimenti, assicurarsi che i microelettrodi abbiano valori di resistenza di 2-4 MΩ e siano riempiti con una soluzione interna di pinza amperometrica appropriata. La soluzione interna utilizzata negli esperimenti rappresentativi contiene: 144 mM di K-gluconato, 0,2 mM di EGTA, 3 mM di MgCl2, 10 mM di HEPES, 8 mM di NaCl, 4 mM di Mg-ATP e 0,5 mM di Na-GTP.
  4. Prima di avvicinarsi al neurone di Purkinje target, aggiungere 2-3 mL di pressione positiva dell'aria nella porta di pressione del portaelettrodo.
  5. Passa alla modalità VC sul pannello di controllo dell'amplificatore e applica le funzioni di compensazione dell'elettrodo e offset della tensione dell'elettrodo. Nell'esempio qui, fare clic su Auto accanto alle opzioni di compensazione dell'elettrodo e offset di tensione.
  6. Iniziare un protocollo di test continuo della tenuta della membrana (fare clic su Test della membrana). Impostare i parametri del test della membrana su (o quasi) scansioni di 5 ms con un passo di 5 mV o 10 mV. Impostare il potenziale di mantenimento (mantenimento V) su 0 mV.
  7. Spostare il microelettrodo verso la cella target, regolando il piano focale per mantenere la messa a fuoco in corrispondenza o leggermente al di sotto della punta dell'elettrodo. Posizionare l'elettrodo leggermente sopra la membrana plasmatica della cellula bersaglio. Utilizzare il micromanipolatore e la pressione positiva della punta dell'elettrodo per spingere via i detriti extracellulari dal soma della cellula bersaglio, "pulendo" la membrana superficiale.
  8. Dopo che la cellula bersaglio è libera dai detriti extracellulari, posizionare lentamente l'elettrodo vicino alla superficie della membrana all'estremità larga del soma del neurone di Purkinje, da cui l'assone si estende dal corpo cellulare. Quando la punta dell'elettrodo viene abbassata sulla membrana, è probabile che diventi visibile una fossetta sulla superficie della membrana (a causa della pressione positiva dell'elettrodo). A questo punto, rilasciare la pressione positiva e utilizzare l'aspirazione a bocca per applicare una piccola quantità di pressione negativa.
  9. Nel pannello di controllo dell'amplificatore , modificare il potenziale di mantenimento della V a -80 mV (da 0 mV). Monitoraggio del test di tenuta della membrana, quando la resistenza della pipetta raggiunge ≥ 1 GΩ, aumentare la pressione negativa e fare clic sulla funzione Zap sul pannello del test di tenuta della membrana per rompere la membrana e ottenere una configurazione di patch-clamp a cella intera.
  10. Utilizzare un breve protocollo di voltage-clamp per misurare le proprietà passive della membrana (valori di capacità e resistenza di ingresso) prima di passare, tramite il pannello di controllo dell'amplificatore, alla modalità current-clamp.
  11. Dopo essere passati alla modalità pinza amperometrica, applicare una compensazione del bilanciamento del ponte a ≥ 70%.
  12. Prima di applicare una conduttanza di clamp dinamica con un elettrodo patch, correggere l'errore di potenziale di giunzione (che viene calcolato in base alla composizione dell'interno dell'elettrodo e delle soluzioni ACSF). Per le soluzioni negli esperimenti rappresentativi, applicare una correzione del potenziale di giunzione di 17,5 mV. Negli studi di clamp dinamico, un'accurata correzione del potenziale di giunzione è fondamentale in modo che un segnale di tensione accurato venga utilizzato dai modelli di conduttanza per calcolare le iniezioni di corrente di clamp dinamica.

4. Applicazione della conduttanza di bloccaggio dinamico

  1. Poiché i neuroni di Purkinje attivano spontaneamente potenziali d'azione ripetitivi, registrare le proprietà di attivazione prima di aggiungere (o sottrarre) una conduttanza ionica modellata per testare la salute delle cellule e misurare le proprietà di base dell'eccitabilità della membrana. Applicare la conduttanza modellata facendo clic su Carica nella finestra delle impostazioni Morsetto dinamico . Una piccola etichetta DynC sarà ora visibile sul controller dPatch, sovrapposta a CC (vedere la Figura 1D, caselle rosse).
  2. Dopo l'accensione/il caricamento del morsetto dinamico, la conduttanza del morsetto dinamico viene applicata automaticamente mentre è attiva una routine/protocollo di morsetto di corrente. Visualizzare l'iniezione dinamica di corrente di bloccaggio sulla finestra dell'oscilloscopio corrispondente al segnale di ingresso selezionato da AuxIN1 .
    NOTA: L'alternanza di registrazioni di attivazione spontanea con e senza applicazione di conduttanze dinamiche mediate da morsetto è importante per determinare in che modo la conduttanza del modello applicato influisce sull'eccitabilità e per determinare se i livelli basali di eccitabilità sono stabili/coerenti durante l'esperimento.

Risultati

Negli esperimenti presentati, applichiamo, utilizzando il morsetto dinamico, una conduttanza di sodio voltaggio-dipendente (Nav) modellata a neuroni cerebellari di topo Purkinje adulti (6-7 settimane) che sono acutamente isolati in una preparazione di fetta cerebellare parasagittale. Gli studi sono condotti su topi wild-type (di controllo) e topi transgenici, in cui la ricombinazione Cre-loxP viene utilizzata per eliminare selettivamente la sclerosi tuberosa 1 (Tsc1) dai neuroni cerebellari di Purkinje. Il complesso della sclerosi tuberosa (TSC) è una malattia multisistemica causata da mutazioni con perdita di funzione in TSC1 o TSC2 32,28,33. Agli individui con TSC vengono comunemente diagnosticati disturbi dell'epilessia, deterioramento cognitivo e disturbo dello spettro autistico34,35. I topi con delezione Tsc1 neurone-specifica di Purkinje, qui indicati come Tsc1mut/mut, mostrano diversi fenotipi comportamentali correlati all'ASD, tra cui menomazioni della funzione motoria, del comportamento di interazione sociale e delle vocalizzazioni, nonché comportamenti ripetitivi esagerati 9,36. Tsc1mut/mut È stato anche dimostrato che i neuroni di Purkinje hanno un'attenuazione dell'attivazione del potenziale d'azione (Figura 2A, B), che è legata alle ampiezze della corrente Nav significativamente ridotte (Figura 2C) e all'espressione del canale Nav nei segmenti iniziali dell'assone dei neuroni di Purkinje 8 mut/mut di Tsc1. Le correnti Nav nei neuroni di Purkinjemut/mut di Tsc1 hanno proprietà cinetiche e voltaggio-dipendenti simili a quelle dei neuroni di Purkinje8 wild-type. In questo modello murino transgenico Tsc1 mut/mut, abbiamo utilizzato il morsetto dinamico per verificare se l'aggiunta della conduttanza Nav ai neuroni Tsc1 mut/mut di Purkinje può salvare l'attivazione ripetitiva. Proseguiamo verificando se la sottrazione della conduttanza Nav nei neuroni di Purkinje wild-type provoca un'attenuazione simile nell'attivazione dei neuroni di Purkinje misurata nei neuroni di Purkinje mut/mut di Tsc1 (Figura 2B). Per sottrarre la conduttanza Nav espressa nativamente, abbiamo applicato la conduttanza Nav utilizzando il morsetto dinamico; Tuttavia, la polarità della conduttanza è invertita.

Il modello dello stato cinetico di Markov (Figura 1A) utilizzato per simulare la conduttanza Nav del neurone di Purkinje contiene nove stati cinetici, otto dei quali non conduttivi, che sono etichettati come chiusi (C1, C2 e C3), inattivati-chiusi (IC1 e IC2), inattivati rapidamente (IF1 e IF2) e inattivati lentamente (IS). C'è uno stato cinetico aperto/conduttore (O) 30,31. Le costanti di velocità di transizione, mostrate tra gli stati cinetici etichettati (Figura 1A) determinano la proporzione di canali/conduttanza simulati che occupano ciascuno stato cinetico. La tensione della membrana influisce su ciascuna delle costanti di velocità del modello. Le correnti di navigazione simulate prodotte da questo modello (in silico) in esperimenti di voltage-clamp simulati sono mostrate (in rosso) a destra delle correnti di navigazione misurate dai neuroni di Purkinje acutamente isolati, che sono mostrati in nero (Figura 1A, in basso). Il comando di tensione che evoca queste correnti di navigazione simulate (rosso) e neurone di Purkinje (nero) è presentato sopra le tracce di corrente in nero. Si noti che, nel comando di tensione, un passaggio di depolarizzazione iniziale (a 0 mV) si traduce in una corrente di sodio veloce transitoria verso l'interno, che, nella traccia simulata, riflette i canali che transitano dagli stati chiusi non conduttori allo stato cinetico aperto, consentendo una breve corrente verso l'interno prima che i canali a stato aperto si accumulino negli stati cinetici veloci inattivati (IF1 e IF2). Questo passo di tensione depolarizzante è breve (5 ms) e il potenziale di membrana viene successivamente portato a una tensione ripolarizzata intermedia di -45 mV, alla quale il potenziale viene mantenuto per 80 ms (Figura 1A, inferiore). Durante questa fase di tensione di ripolarizzazione, è notevole che vi sia una rinascita della corrente di sodio verso l'interno, una componente di corrente indicata come corrente di sodio risorgente (INaR). Durante questo passo di 80 ms a -45 mV, INaR mostra un lento (rispetto a INaT) decadimento in ampiezza, raggiungendo infine uno stato stazionario di corrente verso l'interno, che è la componente persistente della corrente di Nav (INaP). L'attivazione di INaR modellato (Figura 1A, in basso, rosso) durante la ripolarizzazione della membrana riflette i canali simulati che si riprendono dagli stati cinetici rapidamente inattivati (IF1 + IF2) allo stato aperto/conduttore. Nel corso del tempo (mantenendo una velocità di -45 mV), una porzione dei canali simulati che occupano lo stato aperto si accumula in uno stato cinetico assorbente lento inattivato (IS), che viene riflesso al decadimento di INaR, e una parte di questi canali rimane nello stato aperto/conduttivo, riflesso come componente di corrente INaP allo stato stazionario30,31.

Negli esperimenti/risultati rappresentativi, il modello di conduttanza Nav Markov (Figura 1A) è stato aggiunto ai neuroni di Purkinje adulti in fette cerebellari acutamente isolate. Una rappresentazione a fumetti di questa configurazione sperimentale è presentata nella Figura 3A. Per applicare la conduttanza Nav modellata tramite iniezione dinamica di corrente di pinza, abbiamo utilizzato il sistema di amplificazione dPatch (mostrato nella Figura 3B), che ha una conversione analogico-digitale (A/D) e digitale-analogica (D/A) completamente integrata. Questo sistema gestisce anche le trasformazioni del segnale tramite processori core ARM integrati (esterni al PC) e dispone di un circuito FPGA (field-programmable array) integrato che consente l'elaborazione quasi istantanea dei segnali di ingresso e il feedback (invio di segnali di uscita) all'elettrodo27 che inietta corrente. Gli esperimenti qui hanno comportato l'applicazione (in morsetto dinamico) di un complesso modello di conduttanza di Markov, che siamo stati in grado di applicare con frequenze di aggiornamento dell'iniezione di corrente fino a 500 kHz.

L'aggiunta della conduttanza Nav simulata (400 nS) ai neuroni di Purkinje mut/mut di Tsc1 durante le registrazioni di current-clamp prive di gap ha portato a chiari aumenti delle frequenze di attivazione ripetitive delle cellule (Figura 3C1, D1), indicando che l'aggiunta di conduttanza Nav in queste cellule può essere sufficiente per recuperare i deficit nell'eccitabilità dei neuroni di Purkinje mut/mut di Tsc1, sebbene non abbiamo esaminato l'intero repertorio di deficit riportati in mut/mut Tsc1 Eccitabilità del neurone di Purkinje8. Come è evidente dalle tracce rappresentative mostrate nella Figura 3C2 (in alto), i neuroni di Purkinje wild-type hanno una capacità intrinseca di attivare potenziali d'azione ripetitivi ad alte frequenze. Utilizzando il morsetto dinamico, abbiamo sottratto la conduttanza Nav modellata dai neuroni di Purkinje wild-type applicando la conduttanza Nav modellata con una polarità invertita (negativa) (-400 nS). La sottrazione della conduttanza Nav modellata ha portato a un'immediata ed evidente riduzione dell'attivazione ripetitiva (Figura 3C2, in basso), che è anche coerente con l'ipotesi che le ridotte correnti Nav misurate nei neuroni Tsc1 mut/mut di Purkinje contribuiscano alle proprietà di attivazione attenuate misurate in queste cellule8. Attraverso diversi neuroni di PurkinjeTsc1 mut/mut o wild-type, questi esperimenti di clamp dinamico, in cui la conduttanza Nav è stata aggiunta o sottratta, rispettivamente, hanno prodotto effetti coerenti sulla frequenza di attivazione. L'aggiunta della conduttanza Nav in modo significativo (P = 0,029) ha aumentato la frequenza di attivazione dei neuroni di Purkinje mut/mut Tsc1 (Figura 3D1) e, nei neuroni di Purkinje wild-type, la sottrazione della conduttanza Nav ha ridotto significativamente (P = 0,031) la frequenza di attivazione (Figura 3D2) (test t accoppiato di Student).

figure-results-1
Figura 1: Impostazione di un modello di Markov nel software di bloccaggio dinamico. (A) Viene mostrato un diagramma di transizione di stato di Markov per un modello che riproduce le proprietà di conduttanza Nav misurate nei neuroni cerebellari di Purkinje di topo30. Questo modello include nove stati cinetici. Di questi, 8 sono stati non conduttori: tre chiusi (C), due inattivati-chiusi (IC), due inattivati rapidamente (IF) e uno inattivato lentamente (IS). Il modello include uno stato cinetico aperto (O), che è conduttore. Tra stati cinetici adiacenti, le connessioni/la transizione di occupazione dello stato nel tempo è definita dalle costanti di velocità di transizione, mostrate come S0-S15. Si noti che a ogni stato cinetico viene assegnato anche un valore numerico (rosso), che consente agli utenti di definire il modello di Markov e la sua topologia dello stato cinetico in una matrice dello stato di gating (mostrata nel pannello C, descritta di seguito). (B) Vengono presentati i pannelli/interfacce grafiche con cui gli utenti lavorano nell'editor di bloccaggio dinamico SutterPatch. Si noti che la disposizione di questi pannelli dell'Editor Morsetto Dinamico non è coerente con la disposizione come appare all'interno del software di bloccaggio dinamico. Inoltre, non vengono visualizzati tutti i pannelli associati all'Editor morsetto dinamico. (C) (pannello superiore) Viene mostrato un esempio di matrice dello stato di gating con le variabili inserite che corrispondono alla topologia del diagramma di transizione di stato mostrato nel pannello A. Le caselle rosse sulla matrice dello stato di gating evidenziano la riga e la colonna 7, che corrispondono allo stato cinetico aperto (O) del modello. All'interno della colonna 7 sono elencate tutte le costanti di velocità che definiscono le transizioni nello stato cinetico aperto (O) e all'interno della riga 7 sono elencate tutte le costanti di velocità che definiscono le transizioni che escono dallo stato cinetico aperto (O). Con questa organizzazione, la matrice dello stato di gating descrive il numero di stati cinetici, le variabili costanti di velocità e la topologia (interconnessioni tra stati cinetici) del modello. In (D) sono mostrati i pannelli/interfacce utente SutterPatch associati al caricamento di modelli di conduttanza dinamica del clamp, insieme alle interfacce coinvolte nella creazione di routine di current clamp. Le interazioni dell'utente con questi modelli sono descritte nei passaggi del protocollo 2.17-2.20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: I neuroni di Purkinje mut/mut di Tsc1 hanno un'eccitabilità di membrana attenuata rispetto ai controlli wild-type. (A) Le registrazioni di current-clamp su cellule intere dai neuroni di Purkinje wild type (superiore, nero) e mut/mut Tsc1 (inferiore, blu) rivelano un'attivazione attenuata nella cellula mutante Tsc1. (B) Le frequenze di attivazione ridotte nei neuroni di Purkinje Tsc1 mut/mut, rispetto ai controlli di tipo selvatico, sono coerenti tra le cellule. La frequenza media (±± SEM) di attivazione spontanea dei neuroni di Purkinjemut/mutTsc1 è significativamente (P < 0,0001) inferiore rispetto alle cellule wild type (test t spaiato di Welch; controllo N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Le misurazioni del voltage-clamp delle correnti Nav nei neuroni adulti di Purkinje rivelano che il picco medio (±± SEM) della corrente Nav transitoria veloce (INaT) è significativamente ridotto nelle cellule mut/mut Tsc1, rispetto ai controlli wild-type. (P = 0,007, AOVA bidirezionale RM; controllo wild type: N = 6, n = 22, nero; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, quadrati blu). I recordNaT di esempio, evocati da un passo di depolarizzazione di -35 mV, sono mostrati come un pannello interno a destra del pannello C. Dati precedentemente pubblicati in Brown et al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Utilizzo del morsetto dinamico per determinare gli effetti di una conduttanza ionica sull'eccitabilità del neurone di Purkinje. Il clamp dinamico prevede il campionamento della tensione di membrana (tramite un elettrodo di registrazione) e il calcolo, in base alla tensione campionata, dell'uscita di corrente di una conduttanza del modello. La corrente calcolata viene quindi applicata a una cella biologica utilizzando un elettrodo a iniezione di corrente. Il pannello (A) raffigura questa disposizione sperimentale. Se il campionamento della tensione viene eseguito a una frequenza sufficiente e il ritardo (latenza) tra il campionamento della tensione e l'applicazione della corrente calcolata, questa tecnica può essere utilizzata per valutare in che modo l'aggiunta o la sottrazione di una conduttanza modellata influisce sull'attivazione neuronale e sull'eccitabilità della membrana. (B) In esperimenti rappresentativi, le registrazioni dinamiche con clamp sono state acquisite utilizzando il software SutterPatch e il sistema di amplificazione dPatch. dPatch è un amplificatore patch-clamp che ha processori di segnale esterni e un digitalizzatore completamente integrato, il che lo rende adatto per le registrazioni dinamiche con clamp (vedi Discussione). (C) Registrazioni rappresentative del morsetto di corrente dell'attivazione spontanea del neurone di Purkinje, prima e dopo l'utilizzo del morsetto dinamico per aggiungere o sottrarre 400 nS della conduttanza Nav modellata (presentata nella Figura 1A). In C1 (a sinistra), le registrazioni provengono da un neurone di Purkinje mut/mut Tsc1 con attivazione attenuata. L'aggiunta di una conduttanza Nav di 400 nS si traduce in un chiaro aumento della frequenza di attivazione di questa cella. In alternativa, in C2, le registrazioni provengono da un neurone di Purkinje wild-type. In questo esperimento, la conduttanza Nav modellata viene applicata con una polarità invertita (-400 nS), con conseguente sottrazione della conduttanza Nav e una chiara riduzione della frequenza di attivazione ripetitiva. I record di iniezione dinamica della corrente di pinza, mostrati in grigio, sono presentati sotto i record di attivazione del potenziale d'azione (tensione), mostrati in nero. (D) I risultati di questi esperimenti di clamp dinamico, presentati come i cambiamenti nella frequenza di attivazione spontanea dopo l'aggiunta della conduttanza Nav ai neuroni di Purkinje mut/mut di Tsc1 (D1, n = 3) o la sottrazione della conduttanza Nav dai neuroni di Purkinje wild type (D2, n = 3), rivelano effetti coerenti e significativi dell'aggiunta o della sottrazione di questa conduttanza attraversoTsc1 mut/mut (P = 0,029) e wild type (P = 0,031) celle (t-test di Student accoppiato). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

I circuiti cerebellari funzionano nella propriocezione e nel controllo motorio37,38 ma sono anche fondamentali per comportamenti complessi come le interazioni sociali e l'elaborazione emotiva 39,40,41. La patologia nella struttura e nella funzione cerebellare è spesso legata all'ASD 42,43,44,45,46. La semplice architettura dei circuiti cerebellari47 e il chiaro ruolo del cervelletto nella patologia dell'ASD lo rendono una regione del cervello attraente per studiare i driver molecolari e cellulari dei deficit comportamentali dell'ASD, nonché le potenziali terapie. L'elettrofisiologia del morsetto dinamico offre uno strumento importante per queste indagini, consentendo ai ricercatori di testare direttamente le relazioni causali tra i cambiamenti correlati all'ASD nelle proprietà dei canali ionici/conduttanze ioniche e l'attivazione dei neuroni cerebellari. Mentre i metodi di clamp dinamico sono particolarmente adatti per lo studio dei cambiamenti correlati all'ASD nell'eccitabilità neuronale, questa tecnica è rilevante per studiare una serie di meccanismi patologici che influenzano le cellule con membrane eccitabili. Inoltre, il morsetto dinamico rimane uno strumento eccellente per sezionare i complessi processi mediante i quali i neuroni e le cellule muscolari regolano e mantengono l'attivazione del potenziale d'azione appropriato.

L'esecuzione accurata di esperimenti di morsetti dinamici richiede un attento controllo dei parametri tecnici. In particolare, gli sperimentatori dovrebbero conoscere e comprendere le conseguenze della potenziale variabilità nel ritardo tra il campionamento della tensione e l'iniezione di corrente, spesso indicato come jitter29, nonché le proprietà passive dell'elettrodo, le limitazioni dello space-clamp e la fedeltà fisiologica della preparazione sperimentale in esame. Bettencourt et al. (2008)48 e Butera et al. (2001)29 hanno precedentemente dimostrato che il raggiungimento di alte frequenze di campionamento di almeno 50 kHz è fondamentale per catturare con precisione le conduttanze ioniche veloci, con latenze di feedback idealmente mantenute al di sotto del 25% (≤ 5 μs) dell'intervallo di campionamento. Le frequenze di campionamento nominali riportate dai sistemi commerciali, in particolare dalle piattaforme basate su Windows, possono essere fuorvianti; pertanto, è spesso necessaria una verifica indipendente delle prestazioni, che è discussa più dettagliatamente da Milescu et al. (2008)25 e Clausen et al. (2012)49. Devono essere considerati anche i vincoli di space-clamp, in particolare quando si lavora con neuroni intatti che hanno morfologie complesse e proprietà di membrana non isopotenziali. Ad esempio, il tentativo di applicare (o sottrarre) una conduttanza con un elettrodo distale al sito di integrazione, come l'AIS, risulterà in una rappresentazione imprecisa degli effetti della conduttanza applicata. Una scarsa (alta) resistenza dell'elettrodo, una compensazione della capacità inadeguata e/o la mancata correzione dell'errore di potenziale di giunzione possono anche causare una rappresentazione errata delle misurazioni della tensione (segnale di ingresso) e, di conseguenza, un'applicazione errata delle conduttanze ioniche modellate50,51.

Migliaia di modelli Markov e HH sono disponibili gratuitamente per i ricercatori in database online come ModelDB52 e Channelpedia53, supportati rispettivamente dallo Human Brain Project e dal Laboratory of Neural Microcircuitry. Questi database includono modelli per conduttanze sinaptiche, conduttanze dei canali ionici e modelli di neuroni basati sulla conduttanza, che sono scritti principalmente in NEURON, MATLAB o Python. I file di database in genere forniscono le equazioni del modello necessarie, nonché tutte le informazioni varie sui tipi di cellule e sugli esperimenti che hanno informato il modello.

Entrambi i modelli di conduttanza di Markov e HH contengono stati/variabili di gating conduttivi (che simulano canali aperti/attivati) e non conduttori (canali simulati chiusi). Tuttavia, questi tipi di modello differiscono nel modo in cui il valore di conduttanza viene calcolato a ciascuna tensione campionata, con i modelli di Markov che richiedono una maggiore potenza di calcolo ma forniscono maggiori dettagli nelle proprietà di gating dei canali simulati. Ad esempio, nei modelli HH, gli stati conduttivi e non conduttori sono variabili indipendenti, ciascuna determinata dalla cinetica di ingresso e di gating del rispettivo stato54,55. A differenza dei modelli di Markov, i modelli HH non simulano o vincolano le transizioni tra gli stati di gating, come il transito di canali simulati dallo stato cinetico attivato/aperto direttamente allo stato cinetico rapidamente inattivato in un modello di conduttanza del sodio voltaggio-dipendente25. Ciò rende i modelli HH meno complessi dal punto di vista computazionale54,55 e consente ai ricercatori di aggiungere contemporaneamente più modelli HH a conduttanza rapida, mantenendo al contempo elevate frequenze di campionamento e aggiornamento.

I modelli di stati cinetici di Markov sono composti da stati cinetici discreti, che possono essere conduttori o non conduttori, e questi stati sono interconnessi in una topologia fissa. Nelle simulazioni del modello di Markov, la conduttanza è calcolata ad ogni tensione campionata in base alla proporzione di canali simulati che occupano lo stato o gli stati cinetici conduttori. La proporzione di canali simulati che occupano ogni stato cinetico (nel tempo) è determinata dalle costanti di velocità, che sono parametri che governano la velocità con cui l'occupazione dello stato passa da uno stato cinetico all'altro. Le costanti di velocità hanno unità di secondi inversi (s-1), che rappresentano una probabilità di transizione per unità di tempo. A seconda del modello, i valori della costante di velocità possono dipendere da fattori dinamici come la tensione o la temperatura.

Nei modelli di Markov, le equazioni differenziali ordinarie vengono utilizzate per descrivere l'occupazione dipendente dal tempo di ogni stato cinetico. Queste equazioni governano il modo in cui la probabilità di trovarsi in ogni stato si evolve nel tempo, in base alle costanti del tasso di transizione. Questo è rappresentato da una matrice di velocità Q: figure-discussion-156. Come discusso in precedenza, le costanti di velocità di transizione (r), che determinano il movimento tra gli stati, possono essere influenzate dalla tensione di ingresso (V) e dai parametri α e β, che riflettono la cinetica della conduttanza attraverso le tensioni. Queste equazioni possono essere descritte come: figure-discussion-2, e possono essere rappresentate visivamente sotto forma di grafici che includono connessioni (costanti di velocità di transizione) dentro e fuori ogni stato cinetico del modello 56,57,58. Un'utile discussione sullo sviluppo dei modelli di Markov e della loro topologia può essere trovata in Schoening e Silva (2024)56.

Dall'inizio del morsetto dinamico nella sua forma attuale, in cui le conduttanze ioniche non lineari vengono modellate e applicate (tramite elettrodo che inietta corrente) alle cellule viventi in tempo reale19,59, i metodi e le risorse per questa tecnica si sono evoluti e sono sempre più accessibili ed economici grazie a innovazioni come i sistemi a basso costo basati su microcontrollori60 e il software gratuito e open source23, 25,26. I sistemi commerciali, come il dPatch di Sutter Instrument o il Cybercyte di Cytocybernetics, facilitano ulteriormente la rapida implementazione di esperimenti di clamp dinamico attraverso soluzioni hardware e software integrate27,61.

La versatilità del morsetto dinamico consente diverse applicazioni, tra cui la creazione di sinapsi chimiche ed elettriche virtuali, l'incorporazione di neuroni reali all'interno di reti artificiali (o viceversa) e l'aggiunta di canali ionici virtuali62. È importante sottolineare che la dipendenza dalla tensione, le proprietà cinetiche e le ampiezze di una conduttanza applicata possono essere regolate rapidamente, consentendo ai ricercatori di testare direttamente come la scala di uno o più parametri influisce sull'attivazione del potenziale d'azione e sull'eccitabilità della membrana31. I sistemi odierni offrono elevate frequenze di campionamento, consentendo l'applicazione accurata di conduttanze transitorie veloci e possono essere facilmente integrati con apparecchiature elettrofisiologiche convenzionali60,63, solidificando il morsetto dinamico come metodo ideale per far progredire la nostra comprensione della funzione e della disfunzione neuronale.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Telly Galiatsatos e Josh Stanford di Sutter Instrument per la loro assistenza nelle indagini tecniche. Riconosciamo e ringraziamo anche Jan Dolzer per l'aiuto nell'avvio degli studi sui morsetti dinamici dPatch.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Reagente
Tubi di vetro capillare boroscillati parete standard diametro diametro diametro diametro 1,5 mm diametro diametrale 0,86 mm lunghezza 10 cmWarner Instruments64-0793Attrezzatura
CleanBenchTMC63-9090EAttrezzatura
Compresstome VF-500-Z vibratome Strumenti Prescisionarihttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Attrezzatura
Dell OptiPlex 7080Vallettahttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusAttrezzatura
DestrosioFisher ChemicalD16-500 Reagente
Sistema amplificatore dPatchStrumento SutterFG-DPATCHAttrezzatura
EGTAEMD Millipore324626-25GMReagente
HEPESFisher Chemical7365-45-9Reagente
Riscaldatore in lineaWarner Instruments64-0102Attrezzatura
KclFisher ChemicalP330-500 Reagente
KetaminaDechra Veterinary Products193.40620.3 Reagente
K-gluconatoTCI ChemicalsG0040Reagente
Software LinLabScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Attrezzatura
LSE 6L Bagno d'AcquaCorning6783Attrezzatura
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Reagente
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Reagente
Modello P-1000 Tiratore di pipetteStrumento SutterFG-P1000Attrezzatura
NaClFisher ChemicalS271-500 Reagente
Na-GTPMP Biomedici56001-37-7Reagente
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 Reagente
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Reagente
Software oculareOttica Digitale Limitatahttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareAttrezzatura
LamettaPersonna60-0139-CTNAttrezzatura
Arpa a fettaWarner Instruments64-0255Attrezzatura
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Attrezzatura
SupercollaLoctite8040-00-142-9193Attrezzatura
Software SutterPatchStrumento Sutterhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchAttrezzatura
Regolatore di temperaturaWarner Instruments64-2400Attrezzatura
XilazinaMP Biomedici158307Reagente

Riferimenti

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