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Articolo metodologico

In vivo Microscopia confocale nella diagnosi e nella gestione dell'occhio secco: un focus sui protocolli di imaging e sull'interpretazione

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DOI:

10.3791/69156

⸱

11 novembre 2025

 ,  , 
1Hankou Aier Eye Hospital, 2Aier Eye Hospital of Wuhan University, 3School of Stomatology and Ophthalmology, Xianning Medical College, Hubei University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

Questo articolo dimostra il funzionamento e l'effetto della microscopia confocale in vivo nella diagnosi e nel trattamento dell'occhio secco e indaga l'applicazione e i risultati della microscopia confocale in vivo per fornire una base per la ricerca futura.

Abstract

La microscopia confocale in vivo (IVCM) ha guadagnato un'attenzione significativa per la sua natura non invasiva e l'alta risoluzione. Consente l'osservazione in vivo e la quantificazione oggettiva di numerose strutture della superficie oculare correlate alla malattia dell'occhio secco (DED), tra cui la cornea, la congiuntiva, il margine palpebrale, le ghiandole di Meibomio e parassiti come il Demodex, a livello cellulare. Questa capacità aiuta gli oftalmologi a identificare eziologie e sottotipi specifici di DED, facilitando così la diagnosi precisa, il trattamento mirato e la valutazione prognostica. Tuttavia, rimangono carenti protocolli standardizzati per il funzionamento e la segnalazione dell'IVCM. La competenza sia nelle conoscenze oftalmiche che nel funzionamento tecnico è essenziale per utilizzare efficacemente questo dispositivo e generare report di alta qualità. Questo articolo descrive in dettaglio le fasi procedurali e le sfumature dell'esame IVCM per i pazienti con DED. Questo è il primo protocollo IVCM passo-passo JoVE per DED. Ha lo scopo di fungere da punto di riferimento per i medici, aiutandoli a evitare inefficienze operative e a ottenere costantemente immagini della superficie corneale e oculare di alta qualità per guidare la gestione clinica.

Introduzione

A causa dei limiti delle risorse mediche locali o degli oneri finanziari dei pazienti, la diagnosi clinica di DED spesso si concentra solo su un aspetto di base (ad esempio, l'osservazione al microscopio con lampada a fessura, lamentare secchezza e prurito agli occhi) o anche su un singolo indicatore (ad esempio, il tempo di rottura del film lacrimale invasivo, il test di secrezione lacrimale o l'infestazione da Demodex). L'applicazione IVCM non è ampiamente disponibile, per non parlare della standardizzazione dei protocolli per essa. Tuttavia, per le istituzioni oftalmiche dotate di IVCM, l'autore raccomanda che i pazienti per la prima volta si sottopongano a un esame microscopico completo per evitare omissioni, tra cui la cornea, la congiuntiva e il margine palpebrale. Per i casi di DED equivoci o per il rilevamento di Demodex, IVCM è particolarmente adatto per una risposta esplicita.

La malattia dell'occhio secco (DED) è definita come una condizione cronica della superficie oculare causata da anomalie nella qualità o nella quantità di liquido lacrimale e da una ridotta stabilità del film lacrimale. Nel Dry Eye Workshop II (DEWS II), DED è classificato in cinque tipi: occhio secco acquoso (ADE), occhio secco evaporativo (EDE), occhio secco misto (MDE), predisposizione all'occhio secco e stato di secchezza oculare preclinico1. Ralene et al. hanno riassunto l'importante pratica clinica dell'IVCM in diversi tipi di occhio secco, compresa la letteratura pubblicata dal 2017 al 20222. Recenti ricerche hanno dimostrato che l'infiammazione gioca un ruolo chiave nella patogenesi della DED 3,4. In particolare, la densità delle cellule dendritiche (DC) può essere un buon indicatore della DED associata a un processo sistemico immuno-mediato5.

L'IVCM utilizza la tecnologia della tomografia laser confocale. Offre risoluzioni orizzontali e verticali di 1 μm. Le specifiche tecniche dettagliate del dispositivo sono documentate nel rapporto di Jeremy et al6. Durante l'esame della superficie oculare, l'IVCM viene prima applicata alla cornea7, seguita dalla congiuntiva e dalle ghiandole di Meibomio8. La blefarite da Demodex ha attirato una crescente attenzione clinica negli ultimi anni 9,10. L'IVCM fornisce immagini chiare della cornea, della congiuntiva e del margine palpebrale. Queste immagini consentono ai medici di valutare lo stato della malattia e facilitano l'imaging e la quantificazione delle cellule infiammatorie e immunitarie.

Nella valutazione DED, il nostro focus include: cellule epiteliali corneali (CEC); fibre nervose subepiteliali (SNF); cellule infiammatorie/immunitarie interepiteliali e subepiteliali; cellule caliciformi congiuntivali (CGC); cellule infiammatorie/immunitarie congiuntivali; ghiandola di Meibomio, acini e orifizi; Demodex folliculorum e Demodex brevis; e cellule infiammatorie all'interno dei tessuti circostanti. Questa enfasi deriva dalla fisiopatologia: la disfunzione della ghiandola di Meibomio porta a una ridotta secrezione o a un'alterata composizione dello strato lipidico del film lacrimale, con conseguente accelerazione dell'evaporazione lacrimale e danni alla superficie oculare. L'infestazione da Demodex contribuisce al prurito e al disagio oculare. I CGC secernono mucina, un componente critico del film lacrimale; il loro esaurimento può causare DED. Al contrario, la DED stessa danneggia le strutture della superficie oculare, tra cui CEC e SNF, e successivamente eleva la densità delle cellule infiammatorie/immunitarie nei tessuti corneali e congiuntivali. Dopo aver ottenuto le immagini ideali, possiamo utilizzare efficacemente gli strumenti quantitativi integrati nel software per contare le molteplici cellule menzionate (Figura 1). Ma per la diversità morfologica della SNF, dobbiamo fare affidamento su software analitici per aiutare con la quantificazione11,12.

L'IVCM è indispensabile per la valutazione in tempo reale degli strati corneali, delle fibre nervose e delle cellule infiammatorie/immunitarie nei tessuti della superficie oculare. Per la valutazione dei CGC, la citologia da impronta funge da metodo alternativo. Questa tecnica si rivolge alla congiuntiva del fornice colice, dove la densità delle cellule caliciformi raggiunge il picco, producendo valori tipicamente superiori alle misure IVCM13,14. Tuttavia, i risultati sono soggetti alla variabilità delle colorazioni e all'esperienza dell'operatore, mentre il protocollo, che richiede molto tempo, limita l'implementazione clinica di routine. L'ostruzione dell'orifizio della ghiandola di Meibomio è direttamente osservabile tramite microscopia con lampada a fessura, ma questo metodo non è in grado di rilevare i blocchi indotti da Demodex brevis, che IVCM identifica con precisione. Per diagnosticare l'infestazione da Demodex, l'epilazione delle ciglia con esame al microscopio ottico fornisce un metodo a basso costo. Sebbene tecnicamente semplice, questo approccio comporta limitazioni significative: il disagio del paziente limita il campionamento multiplo, gli acari che risiedono in profondità nei follicoli delle ciglia o negli orifizi della ghiandola di Meibomio rimangono non rilevabili15. Al contrario, l'IVCM consente l'esame completo di più siti dei margini palpebrali, compresi i follicoli delle ciglia e gli orifizi della ghiandola di Meibomio, con il minimo disagio per il paziente. Questo approccio raggiunge tassi di positività diagnostica sostanzialmente più elevati attraverso la visualizzazione in vivo in tempo reale dei parassiti all'interno dei loro microhabitat16,17.

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Protocollo

La procedura di esame è stata approvata dal Comitato Etico dell'Ospedale Oculistico Hankou Aier ed è stato ottenuto il consenso informato di tutti i pazienti.

NOTA: I criteri di inclusione per la selezione dei pazienti includono i pazienti che presentano lamentele di secchezza e prurito agli occhi e gli individui che richiedono esami oculistici di routine. I criteri di esclusione per la selezione dei pazienti includono i pazienti con perforazione corneale o perforazione corneale imminente, quelli allergici agli anestetici oculari topici, gli individui troppo giovani (ad esempio, sotto i 3 anni) o troppo vecchi per collaborare, i pazienti con ragadi palpebrali strette incapaci di ospitare uno speculum palpebrale, le donne in gravidanza e gli individui incapaci di collaborare per altri motivi. Un breve diagramma del flusso di lavoro è disponibile nella Figura 2. E i passaggi operativi dettagliati sono i seguenti.

1. Esame preliminare

  1. Preparazione dei materiali: dispositivo IVCM, cuffia di contatto corneale, anestetico topico oftalmico, agente di accoppiamento, tamponi di cotone medicali, speculum palpebrale, palline imbevute di alcol, serbatoio di alcol, collirio antinfiammatorio (Figura 3).
  2. Comprendere i componenti chiave dell'apparecchiatura IVCM (Heidelberg Retinal Tomography Rostock Cornea Module (HRT-RCM)), la manopola di messa a fuoco, la telecamera di monitoraggio, la luce di guida dello sguardo, il mentoniera, il poggiafronte, il pulsante per passare dall'occhio sinistro a quello destro, le manopole rotanti per il movimento triassiale HRT-RCM, il pulsante di acquisizione delle immagini e il pedale, il computer con software IVCM dedicato) e preparare il dispositivo IVCM con il gel di accoppiamento.
  3. Preparazione dell'esaminatore: indossare una maschera e disinfettare le mani con gel a base di alcol o indossare guanti monouso.
  4. Disinfezione del dispositivo: pulire la fronte e le mentoniere dell'apparecchiatura con tamponi imbevuti di alcol.
  5. Spiegazione della procedura: Spiegare brevemente al paziente che l'esame è indolore per alleviare l'ansia.

2. Durante l'esame

  1. Verificare e creare una nuova cartella clinica con il software di accompagnamento sul computer.
  2. Somministrare anestetico topico: somministrarne due gocce nel fornice inferiore a un intervallo di 3 minuti prima della procedura.
  3. Preparare il modulo corneale rostock (RCM) del dispositivo IVCM: rivestire l'area di emissione laser dell'RCM con gel di accoppiamento (assicurarsi che non vi siano bolle d'aria) (Figura 4 e Figura 5) e solo una quantità sufficiente di agente di accoppiamento (di solito una o due gocce, non troppe) può garantire il pieno contatto con il cappuccio di contatto corneale e, infine, ottenere l'interfaccia di azzeramento ideale. Applicare un cappuccio di contatto corneale monouso.
  4. Posizionamento dell'apparecchio: ritrarre completamente l'RCM. Fissare il poggiafronte orizzontalmente. Regolare la telecamera di monitoraggio sul lato temporale del soggetto. Trova la posizione del punto di arresto della fotocamera, che è perpendicolare all'asse ottico dell'RCM.
  5. Calibra la messa a fuoco: Ruotare la manopola di messa a fuoco finché il software non visualizza una facula bianca ingrandita con il valore della qualità dell'immagine esattamente a 100. Reimpostare il valore della profondità su zero (azzeramento).
  6. Seleziona modalità di scansione: impostazione predefinita su Modalità sezione , se non diversamente specificato. Per osservare l'attività degli acari Demodex, è possibile utilizzare la modalità sequenza per la registrazione continua di immagini dinamiche.
  7. Posizionare i pazienti: Appoggiare saldamente il mento sulla mentoniera. Premere la fronte contro il poggiafronte. Regolare il lettino da visita e la mentoniera in base all'altezza del paziente.
  8. Inserire lo speculum palpebrale: chiedere al paziente di guardare in basso mentre si utilizza un batuffolo di cotone per sollevare la palpebra superiore per il posizionamento e chiedere al paziente di guardare in alto mentre si tira delicatamente verso il basso la palpebra inferiore con un batuffolo di cotone per il posizionamento.
  9. Istruzioni finali: Riconfermare il corretto posizionamento della testa. Ricorda al paziente di rimanere rilassato ed evitare movimenti. Segnala immediatamente qualsiasi disagio.
  10. Protocollo di esame della cornea
    1. Iniziare con l'allineamento macroscopico: regolare visivamente l'RCM per approssimare l'apice corneale (Figura 6). Passa alla telecamera di monitoraggio del dispositivo per la messa a punto quando l'RCM si avvicina alla cornea. Guidare il paziente a ruotare lo sguardo per le cornee lesionate, centrando la lesione sotto l'RCM. Mantenere un contatto delicato per evitare danni alla cornea.
    2. Tecnica chiave: la calotta di contatto corneale ha una grande dimensione fisica ma una zona ottica estremamente piccola (limitata all'area centrale che emette il laser). Requisito critico: ottenere un contatto di alta precisione tra il cappuccio e il tessuto bersaglio, poiché una scarsa adesione causa artefatti di imaging (ad esempio, bolle, interferenza dell'olio o perdita completa del segnale).
      NOTA: Per l'imaging continuo, premere il pedale per una scansione prolungata per acquisire immagini di profondità sequenziali ed evitare di perdere dati critici.
  11. Valutazione corneale stratificata: Scansiona dagli strati superficiali a quelli profondi in questo ordine: CEC, SNF, cellule infiammatorie subepiteliali.
    1. Concentrati sulla spirale inferiore, che è il punto di riferimento consigliato, e sulle regioni superiori/inferiori adiacenti18.
  12. Esame congiuntivale nasale
    1. Reimposta il piano focale sul valore di profondità pari a zero. Applicare il gel di accoppiamento sul tappo. Istruire il paziente a guardare temporalmente o inferotemporalmente. Far avanzare delicatamente l'RCM sulla superficie congiuntivale. Manovre simultanee: Regola la posizione RCM per un campo visivo ottimale con la mano destra. Ruotare la manopola di messa a fuoco per identificare le cellule caliciformi nello strato congiuntivale più esterno con la mano sinistra.
  13. Rimozione dello speculum palpebrale: Istruire il paziente a guardare in basso e utilizzare un batuffolo di cotone per sollevare la palpebra superiore per la rimozione. E istruire il paziente a guardare in alto e premere delicatamente la palpebra inferiore con un tampone per la rimozione.
  14. Ripristino del dispositivo: rilasciare e sollevare il poggiafronte. Azzerare la manopola di messa a fuoco. Riapplicare il gel di accoppiamento sulla superficie RCM.
  15. Valutazione della ghiandola di Meibomio e dei follicoli delle ciglia
    1. Posizionamento del paziente: istruire lo sguardo verso il basso. Manovra dell'esaminatore: sollevare delicatamente e premere la pelle della palpebra superiore verso l'interno per allineare il margine della palpebra parallelamente al piano del cappuccio corneale. Spostare RCM orizzontalmente per visualizzare più immagini della stessa struttura tipo; spostare l'RCM verticalmente (dal basso verso l'alto) per passare dall'esame degli orifizi della ghiandola di Meibomio agli acini ghiandolari e quindi alle radici delle ciglia.
      NOTA: I principianti possono estroflesse la palpebra per una migliore esposizione quando esaminano gli orifizi della ghiandola di Meibomio. Suggeriamo la posizione dell'ispezione nel 1/3 centrale della palpebra superiore per questa parte.
    2. Standard quantitativi (protocollo istituzionale): valutare 8 follicoli consecutivi con acini15 adiacenti ed esaminare 4-8 orifizi ghiandolari sequenziali. Calibrazione della profondità: per acquisire immagini nitide dei follicoli, mettere a fuoco fino a quando gli acari Demodex non mostrano bordi netti (se presenti). Per acquisire immagini nitide degli acini, il valore consigliato è di circa 30-50 μm di profondità. E per gli orifizi, è di circa 30 μm (regolare per la visibilità del Demodex brevis se infestato)19.

3. Post-esame

  1. Cura post-procedura: eseguire l'igiene delle mani e disinfettare accuratamente le mani. Rimuovere delicatamente il gel di accoppiamento residuo, le lacrime o i detriti dalla superficie oculare utilizzando un batuffolo di cotone. Somministrare colliri antibiotici per prevenire l'infezione.
  2. Istruzioni per il paziente: Consigliare al paziente di evitare di strofinarsi gli occhi il giorno dell'esame.
  3. Reportistica: analizza tutte le immagini acquisite in modo completo e genera un rapporto diagnostico. Requisiti di refertazione: includere almeno un'immagine per struttura tissutale, aggiungendone altre per i risultati anomali secondo necessità. Tutte le immagini selezionate devono essere ordinate in base alla sequenza di esame e al valore di profondità, seguite da descrizioni e misurazioni precise.
  4. Istruzioni per lo smaltimento dei rifiuti: Per i materiali monouso (tappi a contatto, tamponi, contenitori per anestesia), gettarli nel cestino dei rifiuti sanitari per un ulteriore smaltimento professionale.

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Risultati

Tutte le immagini microscopiche IVCM sono state acquisite con una risoluzione di 384 pixel × 384 pixel, un campo di osservazione di 400 μm × 400 μm. Se correttamente "azzerato", questo esame mostrerà solo tre possibili risultati nel fotogramma dell'immagine: i) Nessuna immagine (esperimento fallito): la zona ottica centrale non ha avuto alcun contatto con il tessuto bersaglio. ii) Solo un'immagine parziale (Figura 7) o altre situazioni anomale (

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Discussione

Una ricerca bibliografica su PubMed utilizzando le parole chiave "microscopia confocale in vivo " e "malattia dell'occhio secco" (consultata nel giugno 2025) ha prodotto > 300 pubblicazioni. In particolare, i tassi di pubblicazione annuali si sono stabilizzati a circa 40 articoli all'anno dal 2021. Applicazioni più ampie dell'IVCM nei disturbi della superficie oculare hanno generato > 2.000 studi negli ultimi due decenni (2004-2024). Dal punto di vista clinico, l'IVCM ha rivoluz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Lina Jin dell'Hankou Aier Eye Hospital e Min Chen del Dipartimento di Oftalmologia del Wuhan Asia Heart Hospital per aver assistito con alcune immagini, e tutti i partecipanti e i membri dello staff che lavorano per la procedura operativa. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione di Scientific Research Projects della Wuhan Municipal Health Commission (WX23A20).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Palline di cotone assorbentiJIAN QI, Cinahttp://www.hnjianqi.comPer fare le palline di alcol, piccole
Gel a base di alcolLi Kang, Shanghai, Cina31107904Gel senza risciacquo antisettico per le mani, 500ml
Gocce per gli occhi CarbomerVidisic, Germania8187195Gel oftalmico sterile per agente di accoppiamento, 10g
Cappuccio a contatto corneale (TomoCap)Heidelberg, Germania18829Mezzo ottico e cornea a contatto asetticamente
Speculo palpebraleAsicon, Cina6102APer aver aperto gli occhi
Software Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg, GermaniaVersione 1.5.2.0Il software fornito con il dispositivo IVCM
Dispositivo IVCMHeidelberg, GermaniaHRT-?,08398L'attrezzatura principale dell'esame
Cotton cotton cotton bags mediciEsound Med, Cinawww.e-soundmed.comPer pulire gli occhi dei pazienti e assistere all'apertura degli occhi, 10cm
Alcol medicinale al 75%HUICHANG, Cinawww.huichang888.cnPer fare le palline di alcol, 75% e plusmn; 5% 500ml
Gocce oculari di ossibuprocaina cloridrato allo 0,4%Santen, Giapponehttp://www.santen.co.jpAnestetico topico oftalmico, 0,4% (0,5ml: 2mg)
Gocce per gli occhi con tobramicinaTOBREX, Belgio8453824Colli antinfiammatori, 0,3% (5ml: 15mg)

Riferimenti

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