Articolo metodologico

Preparazione e elaborazione delle arterie calcificate con morfologia e RNA preservati per la profilazione spaziale digitale

DOI:

10.3791/69159

⸱

23 gennaio 2026

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo include un flusso di lavoro passo dopo passo per campioni vascolari calcificati: gestione dei tessuti, decalcificazione, validazione dell'RNA, rilevamento dei livelli di calcificazione e strategie di selezione della regione di interesse sul Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). L'obiettivo è presentare un metodo completo per preservare la morfologia del tessuto vascolare e l'RNA per un'analisi trascriromica spaziale affidabile.

Abstract

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La trasscrittomica spaziale mappa i profili dell'intero trascrittoma direttamente sulle sezioni tissutali, correlando tra vicini cellulari ed espressione genica e come queste attività influenzino salute e malattia. Sebbene l'approccio abbia trasformato l'oncologia, le neuroscienze, l'immunologia, le scienze dello sviluppo e molti campi, è stato meno ampiamente utilizzato nella biologia vascolare, anche se la malattia vascolare rimane una delle principali cause di morte a livello mondiale. Due ostacoli spiccano: arterie e vene offrono poca superficie piatta per la sezionazione, e i campioni malati, spesso aterosclerotici, trombosati, ricchi di placche o calcificati, richiedono trattamenti severi come la decalcificazione che mettono a rischio morfologia e integrità dell'RNA. Eppure questi stessi vasi, con le loro strutture concentriche di intima, media e adventizia, sono ideali per l'analisi spaziale perché ogni strato ospita tipi cellulari distinti e programmi genici che interagiscono attraverso la parete.

Pochi protocolli dettagliati trattano come preparare i tessuti vascolari per la trascrittomica spaziale. Questa carenza limita la capacità dei ricercatori di sfruttare appieno il potenziale della tecnica. Per colmare il divario, presentiamo un flusso di lavoro passo dopo passo ottimizzato per le arterie tibiali umane con lesioni avanzate. Il protocollo copre la gestione dei tessuti, la fissazione e la corretta decalcificazione che preservano la struttura e la qualità dell'RNA, seguite da una colorazione istologica fino alla gravità della calcificazione. Descriviamo inoltre la costruzione di microarray tissutali (TMA) per frenare gli effetti dei lotti e le strategie di selezione delle regioni di interesse (ROI) sul NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

Riducendo le barriere tecniche, questo protocollo consente ai ricercatori vascolari di generare dati trascritomici spaziali affidabili e di studiare le attività trascrizionali specifiche per strato in vasi sani e malati. Prevediamo che accelererà la scoperta dei meccanismi alla base della calcificazione, dell'infiammazione, dell'aterosclerosi intima e di altre patologie vascolari, favorendo un'adozione più ampia della trasscrittomica spaziale nella biologia vascolare.

Introduzione

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Nell'ultimo decennio, il sequenziamento di nuova generazione e l'imaging ad alta risoluzione si sono convergenti per far progredire la trascritomica spaziale, un metodo di quantificazione dell'intero trascrittoma preservando la posizione precisa di ogni trascrizione nelle sezionitessuti 1,2. Quando abbinati al campo di sequenziamento dell'RNA a cellule singole (scRNA-seq) a maturazione rapida, gli approcci spaziali offrono una via efficiente per collegare le firme geniche con specifici tipi cellulari, stati e nicchie all'interno di un tessuto o organo, arricchendo notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi delle malattie 3,4,5,6,7 . Sono in fase di sviluppo molteplici piattaforme commerciali, come 10X Visium, NanoString GeoMx e CosMx, Slide-seq e DBiT-seq, ciascuna supportata da protocolli ottimizzati per tessuti molli e altamente cellulari come tumori e tessuto cerebrale. Il settore sta vivendo una crescita esplosiva, con PubMed che indicizza circa 150 pubblicazioni nel 2023, quasi 300 nel 2024 e in corsa di superarne 500 nel 2025. Nonostante questo aumento, la biologia vascolare rimane sottorappresentata rispetto al cancro, alle neuroscienze e all'immunologia.

I tessuti duri o mineralizzati, come ossa, cartilagine, denti e arterie o vene calcificate e ricche di placca, si sono dimostrati molto meno pratici. Gli ostacoli tecnici sono multifaccettati. Innanzitutto, i tessuti con matrici minerali dense richiedono chelazione o rimozione a base di acidi, trattamenti aggressivi che possono frammentare l'RNA e distorcere la morfologia tissutale. In secondo luogo, i tessuti malati, sia feriti che fibrotici, spesso contengono poche cellule viventi incorporate in una ricca matrice extracellulare (ECM), riducendo la resa dei trascrizioni e complicando la normalizzazione dei dati. Inoltre, i tessuti vascolari possiedono un'architettura sottile e concentrica (intima, media, adventitia) avvolta attorno a un lumen cavo. Lo spessore limitato della parete, specialmente l'intima a strato unicellulare, significa che le aree di cattura possono contenere tessuti scarsi, e le sezioni possono strapparsi o staccarsi durante fasi di colorazione e ibridazione di più ore. Di conseguenza, gli studi trascritomici spaziali sul tessuto vascolare rimangono rari, anche se le malattie cardiovascolari sono costantemente tra le principali cause di morte e morbilità grave a livello mondiale. Gli articoli sui protocolli esistenti enfatizzano in modo schiacciante l'elaborazione dei dati, la visualizzazione o piattaforme diverse da NanoStringGeoMx 8,9,10,11,12,13. Tra questi articoli, pochi descrivono metodi a livello di laboratorio per l'elaborazione delle arterie tibiali malate, un vaso clinicamente rilevante nella malattia delle arterie periferiche (PAD), specialmente per i pazienti diabetici che rappresentano una quota crescente della popolazione colpita.

Per colmare questa lacuna, presentiamo un flusso di lavoro completo per arterie tibiali umane calcificate ottenute da pazienti con PAD che hanno subito amputazione. Il protocollo comprende: (1) ritaglio e dissezione dei tessuti immediatamente dopo il prelievo in sala operatoria; (2) corretta fissazione e decalcificazione dei tessuti che mantengano l'integrità della morfologia tissutale e dell'RNA; (3) costruzione di microarray tissutali (TMA) a risparmio costi per minimizzare gli effetti dei lotti; (4 ) ibridazione in situ di RNAscope e colorazione istologica del calcio per il controllo della qualità; e (5) strategia di selezione della regione di interesse (ROI) specificamente progettata per arterie tibiali calcificate sulla piattaforma GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Questi passaggi includono tutte le procedure precedenti alla raccolta dei campioni sullo strumento DSP, la preparazione della libreria, il sequenziamento e l'analisi dei dati.

Sebbene dimostrati sulla piattaforma DSP di riferimento, i principi possono guidare la preparazione dei tessuti per il 10X Visium o altre piattaforme, e la metodologia è facilmente adattabile a ulteriori letti vascolari o modelli animali. Questo protocollo può essere adattato per tessuti di biobanca e post-mortem, ma il suo successo dipende in modo critico dalle condizioni di conservazione, fissazione e conservazione dei tessuti. I tessuti dovrebbero essere sistemati immediatamente dopo il raccolto per minimizzare il tempo ischemico (idealmente entro 1 ora). Si raccomanda la formalina standard al 10% di neutro tamponata (NBF) per almeno 16 ore a temperatura ambiente (RT). I tessuti devono essere incorporati immediatamente dopo la fissazione e non devono essere conservati nell'etanolo per più di 3 giorni. I blocchi FFPE fissati in paraffina fissata (FFPE) processati e conservati nelle condizioni raccomandate rimangono adatti alla profilazione spaziale per circa 3 anni, anche se la qualità dell'RNA diminuisce con l'età del blocco. Di conseguenza, si raccomanda la valutazione della qualità dell'RNA per campioni a bassa cellularità, blocchi conservati in 6 mesi, campioni di biobanca e tessuti post-mortem. La qualità minima accettabile dell'RNA dipende dal test selezionato, dalla selezione del ROI, dalla risoluzione desiderata e dalle raccomandazioni della struttura principale. In pratica, circa 50-100 nuclei per segmento sono comunemente raccomandati per risultati robusti. La piattaforma DSP supporta sia FFPE che tessuti freschi congelati. In questo protocollo, ci concentriamo sui tessuti FFPE.

Sebbene questo studio si concentri sulla trascrittomica spaziale, è facilmente integrato con scRNA-seq. Utilizzando dataset pubblicati di scRNA-seq e deconvoluzione spaziale computazionale, le proporzioni di tipo cellulare possono essere stimate per ogni punto spaziale e gli stati cellulari definiti da scRNA-seq possono essere proiettati sull'architettura tissutale. Mantenendo sia la struttura che l'integrità dell'RNA, il nostro protocollo consente la validazione a valle di singola o singola molecola, massimizzando le intuizioni biologiche da preziosi campioni vascolari e un'adozione più ampia della trastrastomica spaziale nella ricerca in biologia vascolare.

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Protocollo

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Tutte le procedure per la raccolta di campioni arteriosi umani sono state approvate dal Consiglio di Revisione Istituzionale (IRB) della Divisione Soggetti Umani dell'Università di Washington e dall'IRB del VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). Sono stati ottenuti i consensi informati scritti dai pazienti prima della raccolta dei tessuti. I materiali e le attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Taglio e fissaggio dei tessuti

  1. Ritaglio dei tessuti
    1. Prepara la borsa di trasporto utilizzando un imballaggio multistrato, contenente una camera d'aria, un contenitore secondario, un contenitore esterno per la spedizione e una borsa per campioni di rischio biologico. Riempire il tubo interno della centrifuga da 50 mL con 30 mL di mezzo di stoccaggio del Medium Eagle Modificato (DMEM) di Dulbecco, contenente l'1% di acido 4-[2-idrossietil]-1-piperazina-etanosulfonico (HEPES) e l'1% di penicillina-streptomicina (P/S).
    2. Posizionare separatamente le arterie tibiale anteriore (AT), tibiale posteriore (PT) e peroneale tibiale (PR) (idealmente > 5 cm di lunghezza) separatamente nei tubi centrifughe da 50 mL. Trasferire i taniche sul ghiaccio dalla sala operatoria alla sala coltura dei tessuti.
      NOTA: Si raccomanda che la lunghezza del campione prelevato sia di almeno 5 cm per consentire repliche e un tessuto sufficiente da crioconservare per altre valutazioni o validazioni.
    3. Trasferire ogni arteria in una piastra di Petri da 100 mm insieme al mezzo. Rimuovere l'eccesso di tessuti connettivi perivascolari utilizzando forbici sterili e pinze, lasciando solo la parete arteriosa (adventitia verso l'interno).
      NOTA: Maneggiare e ritagliare i tessuti in un armadietto di biosicurezza pulito con una soluzione di inattivazione RNasi per prevenire la contaminazione da RNA. Usa bisturi e pinze sterili; Tra un campione e l'altro, sciacquali in acqua sterile e priva di nucleasi per rimuovere i residui e strofina accuratamente con etanolo al 70%.
    4. Risciacquo brevemente l'arteria tagliata con la soluzione salina tamponata a fosfato (PBS) di Dulbecco in una nuova piastra di Petri. Metti un tagliere sterile dentro una ciotola nuova e sposta l'arteria sopra.
    5. Tagliare l'arteria in sezione trasversale in segmenti di 1 cm con una lama chirurgica.
  2. Fissazione e conservazione dei tessuti
    1. Congelare rapidamente due segmenti in criotubi per la crioconservazione in azoto liquido (LN2) e conservarli per futuri lavori su proteine/RNA.
    2. Inserire i segmenti rimanenti in tubi da 15 mL contenenti il 10% di NBF e fissare a 4 °C per 24-48 ore per segmenti arteriosi da 1 cm.
      NOTA: Si consiglia l'uso del 10% di NBF. Se si utilizza il paraformaldeide (PFA) al 4%, preparatelo con freschezza o verifica un pH neutro prima dell'uso per minimizzare i danni all'RNA.

2. Decalcificazione, elaborazione dei tessuti e sezionamento

  1. Preparare la soluzione di decalcificazione: dissolvere l'acido etilene-diamina-tetraacetico (EDTA) al 10% (p/v) in soluzione di stabilizzazione RNA (RSS). La filtrazione non è obbligatoria. Regolare il pH a 9,2 con pellet di idrossido di sodio (NaOH) per sciogliere completamente l'EDTA, poi abbassare a 5,2 con 10 M HCl, che è il pH tipico di lavoro dell'RSS e aiuta a preservare l'integrità dell'RNA.
  2. Risciacqua brevemente manualmente i fazzoletti fissi in PBS. Trasferire ogni campione in un tubo da 15 mL contenente la soluzione di decalcificazione e agitare a 4 °C per 72 ore.
  3. Quando la decalcificazione è completa, lava i campioni in PBS (2 × 5 minuti). Inserire i tessuti in cassette e caricarli in un processore di tessuti usando un programma di elaborazione di 4 ore.
  4. Inserisci più segmenti arteriari per ogni blocco tissutale. Segna l'area di tessuto ristretto sul retro delle scorre e verifica che tutte le sezioni rientrino in questa area.
  5. Taglia l'eccesso di paraffina. Tagliare i blocchi a 5 μm con un microtomo e lame a profilo basso, e montare le sezioni di tessuto all'interno dell'area contrassegnata per il vetrino.
    NOTA: Scartare le prime sezioni dopo aver fatto la faccia e raccogliere le sezioni di tessuto successive. Usa spazzole senza RNase e pulisci il bagno d'acqua tra un lotto e l'altro di campioni.
  6. Preparare almeno quattro sezioni seriali per blocco per diverse colorazioni e l'esperimento di profilazione spaziale digitale (DSP). Conserva i vetri a 4 °C fino all'uso (idealmente < 6 mesi).

3. RNAscopio Ibridazione in situ (ISH) e colorazione istologica

  1. RNAscope ISH
    1. Cuocere i vetri in forno asciutto a 60 °C durante la notte per migliorare l'adesione dei tessuti alle vetrine.
    2. Deparaffinizzazione: Immergere le vetrine nello xilene (3 × 5 minuti), seguite da etanolo al 100% (2 × 3 minuti). Scivola a secco a 60 °C per 7 minuti.
    3. Eseguire il test RNAscope 2.5 HD Red ISH secondo il protocollo del produttore. Bloccare la perossidasi endogena con 3% diH2O2 per 10 minuti a RT; Risciacquare in acqua distillata (DI).
    4. Incubare i vetri in un buffer di recupero preriscaldato a 100 °C (diluito 1:10 in acqua DI) per 15 minuti (utilizzare 200 mL di buffer di recupero per un rack fino a 24 vetri in un vaporizzatore), immergere 5 volte in etanolo al 100% e asciugare i vetri a 60 °C per 7 minuti. Crea una barriera idrofobica per le soluzioni intorno al tessuto usando una penna barriera idrofobica PAP.
    5. Posiziona le vetri in una griglia di forno ibridato, aggiungi 200 μL di integratore enzimatico digestivo (prediluito dal venditore in flacon contagocce) a ogni vetrino e incuba a 40 °C per 15 minuti. Risciacqua i vetri due volte con acqua DI.
    6. Applicare la sonda di controllo positivo Human Ppib sulle vetrine e incubare per 2 ore a 40 °C. Lava le vetrine 2 volte nel wash buffer.
    7. Eseguire amplificazione sequenziale: AMP1 a 40 °C per 30 minuti; AMP2 a 40 °C per 15 minuti; AMP3 a 40 °C per 30 minuti; AMP4 a 40 °C per 15 minuti; AMP5 al RT per 30 minuti; e AMP6 in RT per 15 minuti. Lava per 2 x 2 minuti tra una sessione e l'altra.
    8. Aggiungi la soluzione funzionante Fast Red, incuba a RT per 10 minuti. Svuota, immergi i vetri in acqua DI, poi immergi 5 volte in acqua DI fresca. Confermare che i punti di controllo positivo Ppib appaiono come punti rossi discreti e puntati.
    9. Controcolorare con 1 ematossilina di Gill, immergere 5 volte in 2 variazioni di acqua DI, blu in idrossido di ammonio allo 0,02% e immergere 5 volte in 2 variazioni di acqua DI. Confermare che i nuclei colorino di blu e che la morfologia tissutale sia preservata. Lascia asciugare le slide durante la notte e poi copriscione con un mezzo di montaggio.
  2. Colorazione S con Alizarin Red
    1. Per ulteriori sezioni seriali, ripetere la deparaffinizzazione e la reidratazione nei Passaggi 3.1.2.
    2. Conferma che il pH della soluzione operativa Alizarina Rosso S sia 4,1-4,3.
    3. Immergi i vetri in Alizarin Red S per 30-60 secondi, o finché i depositi di calcio non assumono un colore arancione-rosso.
    4. Scaccia il colorante che tinge troppo spesso si tinge. Disidrata con 20 immersioni rapide in acetone al 100%, poi 20 immersioni in acetone:xilene (1:1).
    5. Libera i vetri in due vasche fresche di xilene, 3 minuti ciascuna. Copertura con mezzo di montaggio.

4. Preparazione delle slide GeoMx DSP e selezione del ROI

  1. Prima di iniziare, pulire tutte le attrezzature e i contenitori con una soluzione inattivante RNAsi e asciugare o risciacquare con acqua trattata con DEPC per prevenire la contaminazione da RNA. Segui le istruzioni per il saggio di profilazione spaziale dell'RNA.
  2. Cuocere i vetri in forno asciutto a 60 °C durante la notte per migliorare l'adesione dei tessuti alle vetrine.
  3. Deparaffinizzazione e reidratazione: Immergere le lamine in xilene (3 × 5 minuti), seguite da etanolo al 100% (2 × 5 minuti) e etanolo al 95% diluito in acqua trattata con DEPC per 5 minuti. Trasferisci le diapositive a 1× PBS per 1 minuto.
  4. Incubare i vetri in un tampone di pre-riscaldamento di Tris/EDTA pH 9,0 per 20 minuti e trasferire i vetri a 1× PBS per 5 minuti a RT.
  5. Incubare i vetri in 1,0 μg/ml di proteinasi K preriscaldata per 15 minuti e risciacquare in 1× PBS per 5 minuti a tempo di respiro.
  6. Fissa le vetrine al 10% di NBF (200 μL per diapositiva) per 5 minuti a RT, e lava in PBS per 5 minuti.
  7. Rimuovi i vetrini dal PBS, batti su un tovagliolo di carta, puli il liquido in eccesso intorno al fazzoletto con un Kimwipe e metti sul portacoloranti di ibridazione.
  8. Aggiungere 200 μL di soluzione ibrida (diluita 1:10 in Buffer W) a ogni vetrina e applicare un slip di ibridazione. Chiudi la camera di ibridazione, inseriscila nel forno e incuba a 37 °C durante la notte.
  9. L'immersione si inserisce in un tampone salino-citrato di sodio (SSC, 2×) e lascia scivolare via l'ibridazione da sola entro 5 minuti.
  10. Lavare i vetri in un tampone di lavaggio rigoroso composto da parti uguali di 4× SSC e formamide deionizzata a 37 °C, 25 minuti per lavaggio. Lava le veglie con 2× SSC buffer, 2 min per lavaggio.
  11. Blocca le slide con il buffer W a RT per 30 minuti.
  12. Copri il tessuto con una soluzione primaria di anticorpi (Rabbit anti-CD45) per 1 ora nella scatola della camera di umidità a RT, lava con 2× SSC buffer 3 volte.
  13. Applicare una soluzione secondaria di anticorpi (anti-Rabbit Goat IgG-AF647) per 1 ora e lavare in 2× SSC buffer.
  14. Copri il tessuto con anticorpi marcati (anti-SMA-AF488) per 1 ora nella scatola della camera di umidità a RT. Lava in 2× buffer SSC.
  15. Tingi i vetri per 10 minuti con un marcatore nucleare Syto83 da 2 μM diluito nel tampone W per 10 minuti.
  16. Scansionare le vetrine con uno strumento di profilazione RNA per visualizzare la colorazione morfologica dei marcatori. Selezionare i ROI prossimali e distali a calcificati di ciascun tessuto arterico, annotando la posizione specifica per strato di ciascun ROI.
    NOTA: Prestare attenzione per prevenire la formazione di bolle d'aria quando si applica lo slip di ibridazione alle sezioni tissutali.

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Risultati

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Il protocollo qui descritto guida gli investigatori dalla ricezione delle arterie tibiali alla generazione di vetri TMA che mantengono sia la morfologia che l'integrità dell'RNA per l'analisi della trascrivomica spaziale. Dettaglia inoltre metodi istologici per visualizzare i depositi di calcio nelle arterie, la colorazione morfologica dei marcatori e le strategie di selezione del ROI.

Nella Figura 1, le arterie sono fissate in un...

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Discussione

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Questo protocollo dettaglia i passaggi necessari per preparare le arterie tibiali umane calcificate per la profilazione trascritomica spaziale sul NanoString GeoMx DSP. Le arterie tibiali, come tutti i vasi, possiedono strati concentrici di intima, media e adventizia, ciascuna ospite di distinte popolazioni cellulari che orchestrano lesioni e riparazioni. Mantenere l'architettura di questi strati è essenziale per le analisi trasscrittomiche risolte a livelli, ma diversi passaggi preparat...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento iniziale del VA Puget Sound, dal VA Merit Award I01 BX004975-02, e dalle risorse e dall'uso delle strutture presso il VA Puget Sound Health Care Center.  L'opera è opera degli autori e non riflette necessariamente la posizione o la politica del Dipartimento per gli Affari dei Veterani o del governo degli Stati Uniti.  Desideriamo riconoscere il servizio di imaging fornito dall'Histology and Imaging Core (HIC) dell'Università di Washington.  Vorremmo ringraziare il dottor Shreeram Akilesh per la sua guida sugli esperimenti DSP presso l'Università di Washington e il suo gruppo presso MANTIS Labs: UW Spatial Biology Core.  Vorremmo anche ringraziare Nishi Ivanov del Diabetes Research Center dell'Università di Washington per la colorazione istologica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), glucosio alto, piruvato  Thermo Fisher Scientific11995065
Soluzione tampone di acido tampone 4-(2-2-idrossietil)-1-piperazina, etanolosulfonico (HEPES), 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Penicillina-Streptomicina (P/S), 10.000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
Formalina Bufferizzata Neutra al 10% (NBF)Millipore Sigma65346-M
Etilene-diammina-acido tetraacetico (EDTA)Millipore Sigma3620
Soluzione di stabilizzazione RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7024Soluzione di stabilizzazione dell'RNA (RSS)
Perossido di idrogeno (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
Soluzione di recupero del bersaglioAdvanced Cell Diagnostics, Inc322001
Proteasi PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331Integratore enzimatico digestivo
DapB (controllo negativo)Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
RNAscope wash buffer (kit di analisi RNAscope 2.5 HD Red ISH)Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 RossoAdvanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 RossoAdvanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
Human PpibAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Gill' s ematossilinaMillipore SigmaGHS132
Prelevato di antigeni, Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
Proteinasi KThermo Fisher ScientificAM2546
Soluzione di ibridazione-Hs WTANanostringa121401102
HybrislipScivolamento di ibridazione
Soluzione ibridazione-Buffer RNanostringa121300313
Rabbit anti-CD45 Segnalazione cellulare1317
Buffer WNanostringa121300313
Capra anti-coniglio IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
Mouse anti-SMA-AF488 Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83 Thermo Fisher ScientificS11364
Lama chirurgicaBD in Biologia371110
Superfrost  Più vetri per microscopioThermo Fisher Scientific1255015
Penna ImmEdge
Lame a microtomoThermo Fisher Scientific22-500-125
RNase AWAYSoluzione inattivante RNasi
Equipaggiamento
Forno ibrido HybEZ & nbsp;Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanostring Modello: GeoMx DSP
Piattaforma di accesso dati: GeoMx DSP Control Center (Versione 3.1.2.12)		Impostazione della scansione del canale: per il FITC, il tempo di esplosione è 300 ms, mentre il fluorofero è AlexaFluro 488; per il canale Cy3, il tempo di esposizione è di 50 ms, mentre il fluoroforio è Syto83; e per il canale Cy5, il tempo di esposizione è di 300 ms, mentre il fluoroforio è AlexaFluor 647.

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
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  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
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