Questo studio mira a indagare gli effetti dell'elettroagopuntura sulla rigenerazione della mielina in un modello ratto di LM e a verificare se la via di segnalazione Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 abbia un ruolo in questo processo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Questo studio mira a indagare gli effetti dell'elettroagopuntura sulla rigenerazione della mielina in un modello ratto di LM e a verificare se la via di segnalazione Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 abbia un ruolo in questo processo.
La lesione del midollo spinale (LMS) spesso provoca gravi disfunzioni neurologiche, e la riparazione della mielina è un passo cruciale nel recupero della funzione neurologica. L'elettroagopuntura (EA), un metodo terapeutico che combina agopuntura tradizionale con stimolazione elettrica, è stata ampiamente applicata nel campo della riparazione nervosa. Tuttavia, i percorsi di segnalazione specifici coinvolti nell'EA non sono stati completamente chiariti. Questo studio mira a indagare gli effetti dell'EA sulla rigenerazione della mielina nei ratti con lezioni medulari e a verificare se la via di segnalazione Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4 giochi un ruolo in questo processo. I ratti con LM sono stati indotti da una lesione da clip aneurisma nel segmento spinale T10. Un catetere in polietilene (PE) è stato impiantato nel canale vertebrale tra gli spazi intervertebrali L5-6 e fissato sottocutaneamente per stabilire un sistema di somministrazione a lungo termine del farmaco. NRG1 esogeno e il suo antagonista venivano somministrati tramite catetere PE a giorni alterni, con un volume di 20 μL per iniezione. Il trattamento EA è stato applicato ai punti di agopuntura Dazhui (GV14) e Mingmen (GV4) a giorni alterni, ogni sessione durava 30 minuti per 4 settimane consecutive. I risultati hanno mostrato che il trattamento con EA ha promosso significativamente l'espressione della proteina mielinica base (MBP) nel tessuto del midollo spinale e ha migliorato la funzione motoria degli arti posteriori nei ratti. Inoltre, il NRG1 esogeno produceva effetti simili a quelli dell'EA. In conclusione, la via di segnalazione NRG1-ErbB4 svolge un ruolo importante nella rigenerazione della mielina indotta da EA nei ratti con LM.
La LMS è una condizione traumatica che porta a gravi deficit neurologici, tipicamente manifestati da deficit motori, perdita sensoriale e disfunzione autonoma, con un tasso di incidenza annuo di circa 40-80 casi per milione di persone a livelloglobale 1,2. Dopo l'infortunio, la rottura assonale e la perdita di mielina sono le principali caratteristiche patologiche che ostacolano la conduzione del segnaleneurale 3. La mielina è formata da oligodendrociti nel sistema nervoso centrale (SNC) e dalle cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico (SNP), e la sua integrità è cruciale per la rapida conduzione degli impulsinervosi 4. Tuttavia, la risposta infiammatoria, lo stress ossidativo e la formazione della cicatrice gliale nel microambiente locale dopo una LM inibiscono significativamente la rigenerazione della mielina, portando a una disfunzione neurologicacronica 5. Allo stesso tempo, la morte degli oligodendrociti (OL) dopo LM porta alla demielinizzazione degli assoni, un processo che si sviluppa in modo cronico e persistente. Gli studi hanno dimostrato che la demielinizzazione assonale sia in modelli umani che animali può essere efficacemente riparata tramite la rigenerazionedella mielina 6. Pertanto, esplorare strategie per promuovere la riparazione della mielina è una delle direzioni chiave nel trattamento delle LMS.
L'agopuntura, come antica tecnica medica tradizionale, è stata ampiamente applicata nella pratica clinica in diversi paesi, tra cui Cina, Corea eGiappone 7,8. EA, che combina l'agopuntura tradizionale con la stimolazione elettrica, è stata ampiamente adottata in ambito clinico. Sempre più evidenze mostrano che l'EA ha effetti terapeutici su varie malattie, in particolare nel promuovere la rigenerazione della mielina dopo lesioni del midollo spinale. La selezione dei punti di agopuntura è fondamentale durante il trattamento EA, come GV14 eGV49. GV14 si trova sotto il processo spinoso dellasettima vertebra cervicale, vicino alla linea mediana della colonna vertebrale, mentre GV4 si trova tra i processi spinosi dellaseconda e terzavertebra lombare. Studi precedenti hanno dimostrato che le vie di segnalazione infiammatorie, lo stress ossidativo, i fattori neurotrofici e l'autofagia giocano un ruolo nella riparazione della mielina indottadall'EA 10,11,12. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che specifici punti di agopuntura, come GV14 e GV4, svolgono un ruolo attivo nel promuovere la rigenerazione della mielina durante il trattamentoEA 13,14,15. Tuttavia, i meccanismi molecolari attraverso cui l'EA regola la rigenerazione della mielina dopo una lesione del midollo spinale non sono stati completamente chiariti.
NRG1 appartiene alla famiglia dei fattori di crescita epidermici e, in base alla sua regione ammino-terminale, può essere classificato in sei tipi (I-VI)16. NRG1 e la sua famiglia di recettori, ErbB (ErbB1/2/3/4), svolgono ruoli significativi nello sviluppo e nella riparazione del sistema nervoso, inclusi processi come la migrazione neuronale, la differenziazione, la remielinizzazione e la sinaptogenesi. Durante lo sviluppo della SNP, le cellule di Schwann (SC) proliferano e migrano lungo gli assoni dei neuroni per formare mielina, e la via di segnalazione NRG1-ErbB4 svolge un ruolo chiave nella maturazione delle cellule progenitrici di Schwanndella SNP 17,18. Studi precedenti hanno dimostrato che la via di segnalazione NRG1 è coinvolta nella differenziazione delle cellule staminali neurali in cellule di Schwann e promuove la riparazione della mielina dopo laSCI 19. Inoltre, uno studio ha dimostrato che, dopo una lesione del midollo spinale, la via di segnalazione NRG1-ErbB4 favorisce la trasformazione delle cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) in cellule simili a Schwann con potenziale diremielinizzazione 20. Alex et al. hanno costruito un sistema di co-coltura di neuroni sensoriali umani derivati da cellule staminali pluripotenti e cellule di Schwann di ratto e hanno scoperto che bloccare la via di segnalazione NRG1-ErbB con farmaci inibiva significativamente la mielinizzazione neuronale, fornendo prove dirette del ruolo di questa via nella promozione della mielinizzazione degli assoni sensorialiumani 21. Un altro studio ha anche dimostrato che il trattamento con EA può aumentare l'espressione di NRG1 nel midollo spinale e alleviare il doloreinfiammatorio 22.
Le ricerche sull'impatto dell'EA sulla via di segnalazione NRG1-ErbB4 nelle LM sono limitate e i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Questo studio mira a indagare se la stimolazione dell'EA nei punti di agopuntura GV14 e GV4 possa regolare la trasduzione del segnale NRG1-ErbB4 ed esplorare il suo potenziale ruolo nella promozione della rigenerazione della mielina e nel recupero della funzione neurologica nei ratti con lezioni leggeri. Questo è il primo studio a esaminare la relazione tra la via di segnalazione NRG1-ErbB4 e la rigenerazione mielina indotta da EA nei ratti con LM, fornendo prove sperimentali per lo sviluppo di strategie di trattamento nuove ed efficaci per la LME.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Durante l'esperimento sono state rispettate tutte le linee guida etiche per minimizzare la sofferenza animale. Il protocollo sperimentale e il progetto sono stati approvati dal Comitato per l'Esperimentazione Animale dell'Università Medica di Kunming (Approvazione n. KMMU2021051) e condotta in conformità con le linee guida di ricerca sugli animali dell'università. Ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (8 settimane, con un peso di 250-270 g, n = 60) sono stati ottenuti presso la Kunming Medical University (Yunnan, Cina).
Preparazione degli animali
Gli animali venivano ospitati in un ambiente controllato con umidità costante, temperatura moderata e un ciclo di 12 ore di luce e buio. Gli animali sono stati assegnati casualmente a 11 gruppi: gruppo di intervento fittizio (S, n = 6), gruppo LMI (M, n = 6), LM con gruppo trattamento EA (M + EA, n = 6), LMI con gruppo trattamento NRG-1β (M + NRG-1β, n = 6), LMI con gruppo solvente DMSO al 5% (M + D, n = 6), LM con inibitore PD158780 e gruppo trattamento NRG-1β (M + PD+NRG-1β, n = 6), LM con gruppo di trattamento PD158780 inibitore e EA (M + EA + PD, n = 6), LM con solvente e gruppo di trattamento EA (M + EA + D, n = 6), LMI con gruppo di trattamento shRNA e EA (M + EA + shRNA, n = 6), LMI con lentivirus contenente shRNA non targeting e gruppo trattamento EA (M + EA + NC, n = 6), LM con gruppo di trattamento con shRNA (M + shRNA, n = 6). La dimensione attuale del campione è stata determinata sulla base della nostra esperienza precedente con modelli e interventi simili, che hanno costantemente mostrato effetti significativi con questo numero. Inoltre, nonostante la dimensione del campione, abbiamo osservato differenze statisticamente solide e significative negli esiti chiave, rafforzando la fiducia nei risultati riportati.
Modello del ratto con SCI
Una clip per aneurisma di Yasargil (titanio, forza di chiusura standard di 70 g) è stata utilizzata per stabilire un modello di ratto di LM utilizzando una tecnica a pinza (Figura 1A). I ratti sono stati anestetizzati con pentobarbital sodio al 2% (30 mg/kg, intraperitoneale) e posti su un tavolo operatorio. È stata effettuata un'incisione di 3-4 cm nella pelle posteriore, seguita da una dissezione strato per strato del tessuto sottocutaneo e del muscolo per esporre i processi spinosi toracici T9-11 e gli archi vertebrali. Una clip vascolare veniva utilizzata per rimuovere il processo spinoso toracico T10 e l'arco vertebrale, esponendo completamente il midollo spinale. La clip per aneurisma Yasargil è stata posizionata verticalmente su tutto il segmento T10 e rilasciata rapidamente dopo un tempo di permanenza di 60 s. Il modello è stato considerato positivo se sono stati osservati due o più dei seguenti segni: (1) tremori spasmodici del corpo, (2) riflesso di scodinzolare la coda e (3) segni neri visibili sul midollo spinale. Dopo aver assicurato un'adeguata emostasi, l'incisione è stata disinfettata e suturata. Nel gruppo di operazione simulata è stata eseguita la stessa procedura, tranne che il midollo spinale non è stato clampato. Postoperatoriamente, i ratti hanno ricevuto soluzione salina normale (3 mL, intraperitoneale) per la reidratazione e penicillina (100.000 unità, intraperitoneale) una volta al mattino e una volta alla sera per 3 giorni consecutivi per prevenire infezioni. È stata fornita assistenza manuale per la minzione fino al ripristino della minzione spontanea (2 volte al giorno).
Tubi intratecali per ratti e somministrazione di farmaci
Seguendo il metodo di Storkson et al.23, un catetere è stato impiantato nello spazio subaracnoideo nei ratti una settimana prima dell'induzione del modello SCI. Dopo l'anestesia, i ratti venivano fissati sul tavolo operatorio e lo spazio intervertebrale L5-6 veniva esposto. Un ago da 19G veniva utilizzato per penetrare verticalmente la dura madre e la membrana aracnoide. L'ago fu avanzato di circa 1-2 mm e, dopo aver attraversato la membrana aracnoide, si percepì una sensazione di spazio, seguita dal flusso limpido del liquido cerebrospinale, indicando una puntura riuscita e riuscita a essere percepita. Un catetere PE-10 (polietilene, diametro interno 0,38 mm, diametro esterno 1,09 mm) è stato inserito nello spazio subaracnoideo lungo l'ago per la puntura. Il catetere fu avanzato a una lunghezza di circa 3 cm, con la punta del catetere posizionata vicino al corpo vertebrale L3. Durante l'inserimento sono stati osservati scossici della coda e contrazioni degli arti posteriori nei ratti, e il liquido cerebrospinale è uscito attraverso il catetere, confermando la posizione del catetere nello spazio subaracnoidea.
Sia NRG-1β che PD158780 sono stati disciolti nel dimetilsolfossido (DMSO) e successivamente diluiti con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), assicurando che la concentrazione finale di DMSO rimanesse sotto lo 0,5%. Le concentrazioni finali di lavoro erano 20 nM per NRG-1β e 20 μM per PD15878024. Il secondo giorno dopo la LM, i ratti del gruppo M + NRG-1β hanno ricevuto iniezioni intratecali di 20 μL di NRG-1β a giorni alterni. Ai ratti del gruppo M + EA + PD sono stati somministrati 20 μL di PD158780intratecalmente 25, 2 ore prima del trattamento EA.
Trattamento EA
Alterzo giorno post-intervento, i ratti sono stati fissati sul tavolo di trattamento per la terapia con elettroagopuntura (EA) ai punti di agopuntura GV14 e GV4 (Figura 1B). Due aghi di agopuntura (0,25 mm x 13 mm) sono stati inseriti in questi punti fino a una profondità di 3-4 mm. La terapia EA è stata somministrata utilizzando un dispositivo di elettroagopuntura con un pattern d'onda scarso-denso (onda scarsa a 2 Hz e onda densa a 10 Hz, con rapporto di frequenza 1:5)26. L'intensità di uscita era impostata a 5 (circa 0,5 mA) per 30 minuti, a giorni alterni.
Valutazione comportamentale
La funzione locomotoria è stata valutata utilizzando la scala Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) 27, che valuta il movimento degli arti, l'andatura, la coordinazione e la posizione delle zampe nei seguenti momenti: 0, 3, 7, 14, 21 e 28 giorni dopo l'intervento ( Figura 2D). La scala BBB varia da 0 (che rappresenta la paralisi completa) a 21 (che indica l'andatura normale). Tutte le valutazioni sono state effettuate indipendentemente da due ricercatori che erano ciechi di fronte agli esercizi sperimentali di gruppo.
Raccolta di campioni
Dopo la conclusione dell'esperimento, i ratti anestetizzati sono stati fissati su una piattaforma di dissezione per la raccolta dei tessuti. La cavità addominale fu aperta per esporre completamente il diaframma, che fu accuratamente inciso con forbici dell'iride per evitare lesioni vascolari. La gabbia toracica è stata quindi tagliata lungo entrambi i margini costali per esporre il cuore, dopodiché è stato inserito un ago nel ventricolo sinistro all'apice e circa 300-400 mL di PBS pre-raffreddato sono stati rapidamente perfusi per liberare il sangue sistemico fino a quando il liquido trasparente non è sceso dall'atrio destro. Per l'analisi delle proteine molecolari, la perfusione veniva interrotta in questa fase e la colonna vertebrale veniva dissezionata. Dopo aver rimosso costole e muscoli adiacenti per esporre le vertebre, è stato individuato il segmento T10, e un segmento del midollo spinale di circa 1 cm rostrale e caudale a T10 è stato raccolto usando forbici dell'iride, poi congelato subito in azoto liquido e conservato a -80 °C. Per l'esame morfologico, la perfusione è stata sostituita al 4% di paraformaldeide dopo la PBS, con una fissazione efficace indicata dalla contrazione muscolare e dalla rigidità del tronco. Lo stesso segmento spinale è stato poi accuratamente dissezionato per preservare l'architettura tissutale e post-fissato in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore.
Colorazione di ematossilina ed eosina
Le sezioni di paraffina del midollo spinale sono state messe in forno a 60 °C per il preriscaldamento per 30 minuti. Deceratura: Xilene I per 15 minuti seguita da Xilene II per 15 minuti. Reidratazione: trattata con etanolo al 100% per 2 minuti, poi etanolo al 95% per 2 minuti, poi con etanolo all'80% per 2 minuti, seguito da etanolo al 70% per 2 minuti, Infine acqua distillata per 5 minuti. La colorazione con l'ematossilina è stata fatta per 7 minuti, seguita da un risciacquo con acqua distillata per rimuovere la soluzione residua di macchie. La differenziazione in alcol cloridrico all'1% è stata effettuata per 3 secondi, seguita da un risciacquo con acqua distillata per rimuovere residui di soluzione di colorazione. Ho fatto il bluing con acqua ammoniaca al 5% per 2 minuti, seguito dal lavaggio della soluzione residua di bluing. È stata effettuata una colorazione con eosina per 30 secondi, seguita da un risciacquo con acqua distillata per rimuovere residui di soluzione di macchia. La disidratazione delle sezioni è stata effettuata con il 70% di etanolo per 10 secondi, poi l'80% di etanolo per 10 secondi, e infine con il 100% di etanolo per 30 secondi. La pulizia è stata fatta trattando con Xylene per 5 minuti. Dopo il montaggio, le vetrine venivano asciugate all'aria e le immagini venivano catturate dopo l'asciugatura.
Colorazione blu veloce Luxol
Le sezioni sono state decerate 2 volte con xilene per 10 minuti ciascuna, poi colorate con soluzione di colorazione per mielina LFB e incubate durante la notte a 37 °C. Il giorno seguente, la soluzione di colorazione in eccesso è stata rimossa usando etanolo al 90%. Le sezioni sono state differenziate in soluzione di differenziazione Luxol per 10 secondi (C0631S), seguite da immersione in etanolo al 75% per 30 secondi fino a quando la sostanza grigia non è apparsa limpida. Infine, le sezioni sono state controcolorate con soluzione di colorazione a eosina per 1 minuto.
Western blotting
I campioni di proteine sono stati bolliti in acqua per 5 minuti. Un totale di 5 μL di marcatore proteico è stato prima caricato nel gel di elettroforesi, seguito dal caricamento sequenziale dei campioni proteici di test. L'elettroforesi veniva avviata a 80 V fino a quando le bande marcatrici non venivano chiaramente separate, dopodiché la tensione veniva aumentata a 130 V e mantenuta fino al completamento dell'elettroforesi. Le membrane PVDF pre-tagliate venivano attivate nel metanolo per 1 minuto, poi applicate su carta filtrante e sovrapposte con il gel preparato. Il trasferimento proteico è stato eseguito a una corrente costante di 300 mA, con il tempo di trasferimento regolato in base al peso molecolare (± 10 minuti). Dopo il trasferimento, la membrana PVDF è stata posta in una scatola di incubazione, risciacquata con il tampone TBST per 5 minuti, e poi bloccata con latte scremato al 5% a temperatura ambiente su uno shaker per 2 ore. La membrana è stata successivamente lavata 3 volte con tampone TBST per 5 minuti ciascuno prima dell'incubazione con anticorpi primari, inclusi GAPDH (1:2000), Tubulina (1:2000), NRG1 (1:1000), ErbB4 (1:1000) e MBP (1:1000), durante la notte a 4 °C con lievi scuoti. Il giorno seguente, la membrana è stata lavata 3 volte con tampone TBST per 5 minuti ciascuna, poi incubata con un anticorpo secondario, anti-coniglio di capra (1:4000), a temperatura ambiente su uno shaker per 2 ore. Dopo il lavaggio con TBST, le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando la chemiluminescenza. Importare l'immagine WB nel software ImageJ ed eseguire la sottrazione dello sfondo utilizzando un raggio di palla rotolante di 50 pixel. Per le bande inclinate, usa lo strumento Linea Segmentata per raddrizzare le fasce. Usa lo strumento Rettangolo per selezionare le bande target e generare un profilo di densità selezionando Traccia Corsie per visualizzare i valori in scala di grigi delle bande. Usa lo strumento Magic Wand per segmentare i picchi ed estrarre i valori in scala di grigi. Dopo aver salvato i dati, usa il software GraphPad Prism per creare grafici a barre.
Immunofluorescenza
Le sezioni di paraffina sono state decerate 2 volte con xilene per 10 minuti ciascuna e reidratate tramite una serie di etanolo gradato. Il prelievo dell'antigene è stato eseguito bollendo le sezioni in una soluzione di acido citrico al 5% per 15 minuti, seguita da un blocco con siero di capra al 10% per 2 ore. Le sezioni sono state poi incubate durante la notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari: NRG-1 monoclonale di topo (1:200), ErbB4 monoclonale di coniglio (1:300) e MBP monoclonale umano (1:300). Dopo tre lavaggi con soluzione salina tamponata fosfato contenente 0,1% di Triton X-100 (PBST) per 10 minuti ciascuna, le sezioni sono state incubate per 1 ora al buio con i seguenti anticorpi secondari: IgG anti-topo marcato con FITC (1:500), IgG anti-coniglio di capra marcato con FITC (1:500) e IgG anti-umano di capra marcato con FITC (1:500). Le sezioni sono state lavate 3 volte con PBST per 10 minuti ciascuna, poi fissate e montate con reagente antifade per preservare i segnali fluorescenti. Le vetri venivano conservate a 4 °C al buio. Dopo aver individuato le cellule bersaglio sotto una lente obiettivo 10x usando un microscopio a fluorescenza, si passa a una lente 40x per catturare l'immagine di fluorescenza.
Reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR)
I primer per ErbB4 e il gene di riferimento GAPDH sono stati progettati utilizzando il sito web del NCBI. Le sequenze degli innesco erano le seguenti: ErbB4 innesco anteriore: ACAGCCCCCCTCCTGCCTAC; Primer inverso ErbB4 : ATCTCAGCCGTTGCACCCT; Primer in avanti GAPDH : CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; Primer inverso GAPDH : TACGCCAAATCCGTTCACA. Tessuto midollare spinale di dimensioni approssimativamente di soia è stato inserito in un tubo centrifugo da 1,5 mL e sono stati aggiunti 600 μL di reagente totale di estrazione di RNA. Il tessuto è stato completamente omogeneizzato e incubato sul ghiaccio per 5 minuti, seguito da centrifugazione a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Il sovrantantante fu trasferito in un nuovo tubo da 1,5 mL e furono aggiunti 400 μL di cloroformio. La miscela è stata accuratamente miscelata e centrifugata a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Il soprantantante fu nuovamente trasferito in un nuovo tubo e furono aggiunti 400 μL di isopropanolo. La soluzione è stata incubata a temperatura ambiente per 10 minuti, seguita da centrifugazione a 12.000 x g per 10 minuti. Il soprantantante veniva scartato e la pellet di RNA veniva lavata con 400 μL di etanolo al 75%. Dopo la centrifugazione a 7.500 x g per 5 minuti a 4 °C, il sovrantantante veniva scartato e il tubo veniva rovesciato per asciugare all'aria su una superficie pulita. Il pellet di RNA è stato disciolto in 60 μL di acqua priva di RNA, miscelato accuratamente, e la concentrazione di RNA è stata misurata. La purezza e la concentrazione dell'RNA sono state registrate misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nm, assicurando che il rapporto 260/280 fosse intorno a 2,0. Per la sintesi del cDNA, la Reazione 1 (contenente gDNA Eraser, ecc.) e la Reazione 2 (contenente trascridasi inversa, ecc.) sono state accuratamente miscelate, e la miscela è stata incubata a 95 °C per 15 minuti. Il sistema di reazione PCR a fluorescenza è stato preparato secondo le istruzioni del kit di sintesi cDNA. Un campione da 2 μL è stato aggiunto a 23 μL di miscela di reazione PCR e l'amplificazione è stata eseguita secondo il protocollo del kit PCR quantitativo a fluorescenza. La temperatura di ricottura fu impostata a 60 °C e le condizioni di amplificazione furono le seguenti: Pre-denaturazione: 95 °C per 30 secondi, 1 ciclo; Reazione PCR: 95 °C per 3 secondi, 60 °C per 30 secondi, 40 cicli; L'analisi della curva di dissocia è stata eseguita come segue: 95 °C per 5 s, 60 °C per 30 s, seguiti da un aumento graduale da 60 °C a 95 °C con acquisizione continua del segnale di fluorescenza. I valori di Ct sono stati misurati e calcolati utilizzando il software Bio-Rad, e i livelli relativi di mRNA sono stati determinati con il metodo 2-ΔΔCt .
Linee guida per la sicurezza e la maneggevolezza
Fissazione con il paraformaldeide: Usa il paraformaldeide esclusivamente in una cappa ventilata ben ventilata. Indossa sempre l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, inclusi mascherina, guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Conserva la soluzione di paraformaldeide in un contenitore ben sigillato, lontano dalla luce solare diretta e dalle fonti di calore. Smaltire il paraformaldeide di scarto secondo le linee guida di sicurezza del laboratorio dell'Università Medica di Kunming, collocandolo in un contenitore di rifiuti pericolosi.
Soluzione DMSO: Il DMSO può essere assorbito attraverso la pelle ed entrare nel corpo. Indossare DPI adeguati, inclusi guanti e occhiali di sicurezza, durante la manipolazione. Conserva il DMSO in un contenitore sigillato a temperatura ambiente, lontano da agenti ossidanti forti. Smaltire i rifiuti DMSO in conformità con le linee guida di sicurezza di laboratorio dell'Università Medica di Kunming, collocandoli in un contenitore di rifiuti pericolosi.
Anestesia pentobarbitale: Il Pentobarbital è una sostanza controllata e dovrebbe essere gestito solo da personale autorizzato. Evita esposizioni accidentali durante la maneggiatura e assicurati una corretta ventilazione durante l'uso. Indossa l'attrezzatura protettiva appropriata. Conserva il pentobarbital in un armadietto chiuso a chiave a temperatura ambiente, sotto la supervisione di personale autorizzato. Smaltire i rifiuti pentobarbital in conformità con le linee guida dell'Università Medica di Kunming per le sostanze controllate, garantendo una corretta autorizzazione all'uso e procedure di smaltimento dei rifiuti.
Smaltimento generale dei rifiuti: Tutte le sostanze chimiche pericolose e i reagenti devono essere smaltiti secondo le linee guida di gestione del laboratorio dell'Università Medica di Kunming. Assicurati che tutti i materiali di scarto siano correttamente etichettati e collocati in contenitori adeguati per uno smaltimento sicuro.
Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicata o più. I valori della densità di banda delle proteine target sono stati normalizzati a quelli del gruppo di controllo per facilitare i confronti tra i gruppi. I dati sono presentati come mediana (intervallo interquartile) o media ± deviazione standard, con n che rappresenta il numero di ratti. Per i dati normalmente distribuiti, le differenze significative tra i gruppi sono state valutate utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). Per dati non normalmente distribuiti, è stato applicato il test Kruskal-Wallis H per confrontare i gruppi. La significanza statistica è stata fissata a p < 0,05.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
La colorazione H&E e la puntatura BBB dimostrano gli effetti protettivi dell'EA sui ratti con punteggio di lezione leggera
La colorazione H&E è stata utilizzata per esaminare la morfologia e la struttura delle cellule del corno posteriore del midollo spinale (Figura 2D). I risultati H&E hanno rivelato che nel gruppo S le cellule del corno posteriore erano ordinatamente disposte, con contorni cellulari ben definiti...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Questo studio dimostra che il trattamento con EA allevia la cavitazione e la demielinizzazione del midollo spinale dopo LME, promuovendo la rimielinizzazione tramite la regolazione all'alto dell'espressione della proteina MBP e migliora di conseguenza la funzione motoria degli arti posteriori nei ratti. Inoltre, abbiamo identificato la via di segnalazione NRG-1/ErbBB4 come un mediatore critico della mielinizzazione neuronale e un potenziale meccanismo terapeutico attraverso il quale l'EA...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamo gli autori per i loro contributi a questo studio. Questo studio è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC 81960817, 82260387) e dal Programma Speciale di Ricerca di Base del Piano di Scienza e Tecnologia del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Yunnan (202301AS070020). Progetto di Ricerca e Sviluppo Scientifico e Sviluppo del North Sichuan Medical College (CBY22-QNA20)
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di rilevamento delle proteine BCA | Beyotime Biotechnology | P0012S | Analisi quantitativa delle proteine |
| Dispositivo di elettroagopuntura | Strumento di Elettroagopuntura Huatuo, SDZ-V, Suzhou | — | Apparecchiature terapeutiche |
| Capra etichettata FITC, anti-umana IgG | Beyotime | A0556 | Anticorpo secondario fluorescente |
| Capra anti-IgG etichettata FITC | Beyotime | A0568 | Anticorpo secondario fluorescente |
| Capra etichettata FITC anti-coniglio IgG | Beyotime | A0562 | Anticorpo secondario fluorescente |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | — | — |
| MBP monoclonale umano | Abcam | ab209328 | Anticorpo specifico |
| Soluzione di colorazione con mielina LFB | Solarbio | G3240 | Macchia di guaina mielinica |
| ECL a Milliporo | Millipore | WBKLS0100 | Reagenti di rilevamento |
| NRG-1 monoclonale di topo | Santa Cruz | SC-57384 | Anticorpo specifico |
| Nanodrop ND-1000 | LabTech | — | |
| Beta di NRG1-1 | Novoprotein Technology Co | C753 | NRG1-1 beta umano ricombinante |
| PD158780 | Tecnologia GlpBio | GC15925 | Il receptore del fattore di crescita epidermico (EGFR) inibitore della tirosina chinasi |
| Condotto PE-10 | Becton, Dickinson and Company | 427401 | Iniezione intratecale |
| Penicillina sodica per iniezione | Harbin Zhongjing Biotechnology Co | 80451182 | Terapia anti-infecciosa post-operatoria |
| ErbB4 monoclonale di coniglio | Abcam | ab109273 | Anticorpo specifico |
| RNAiso Plus Kit | Takara | 9109 | Reagenti RT-PCR |
| Kit Reagente RT | Takara | RR037A | Reagenti RT-PCR |
| Anticorpo secondario | Beyotime Biotechnology | — | Anticorpo specifico |
| Pentobarbital sodico | Sigma-Aldrich | 69020100 | Anestesia animale |
| Clip per aneurisma di Yasargil | Rebstock Instruments GmbH | — | Costruzione di un modello di lesione del midollo spinale di ratto |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.