CLCF1 Protocollo miochine indotto dall'esercizio per lo studio dei meccanismi di protezione ossea RANKL/OPG nell'osteoporosi postmenopausale

Houling Zhao; Hongfei Li; Yanbin Sun

doi:10.3791/69172

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Articolo metodologico

CLCF1 Protocollo miochine indotto dall'esercizio per lo studio dei meccanismi di protezione ossea RANKL/OPG nell'osteoporosi postmenopausale

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DOI:

10.3791/69172

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7 novembre 2025

Houling Zhao¹ , Hongfei Li¹ , Yanbin Sun¹

¹Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo completo per lo studio del fattore 1 delle citochine cardiotrofine (CLCF1) come mediatore della protezione ossea indotta dall'esercizio attraverso la modulazione dell'asse RANKL/OPG nell'osteoporosi postmenopausale.

Abstract

Studi recenti hanno identificato il fattore 1 delle citochine cardiotrofina (CLCF1) come una "molecola di giovinezza" indotta dall'esercizio fisico che media i benefici muscoloscheletrici, ma diminuisce con l'età. Questo protocollo descrive un approccio sistematico per studiare il ruolo regolatorio di CLCF1 nella protezione ossea mediata dall'esercizio attraverso meccanismi di crosstalk immunitario-osso. La metodologia comprende l'analisi clinica dei campioni, le tecniche di caratterizzazione molecolare e i saggi funzionali per chiarire l'influenza di CLCF1 sull'attivatore del recettore dell'asse di segnalazione del fattore nucleare-ligando κB (RANKL)/osteoprotegerina (OPG). Attraverso la reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR), il western blotting, l'editing genico CRISPR/Cas9 e i sistemi di co-coltura, questo protocollo dimostra le doppie azioni protettive dell'osso di CLCF1 attraverso l'inibizione degli osteoclasti mediata da STAT1 e la promozione degli osteoblasti mediata da STAT3. I metodi descritti consentono la valutazione completa dei modelli di espressione di CLCF1, le analisi di correlazione con i parametri di densità minerale ossea e la valutazione meccanicistica dei potenziali interventi di trattamento mimetico dell'esercizio. A differenza delle tradizionali terapie antiriassorbitive che si rivolgono principalmente agli osteoclasti, gli interventi basati su CLCF1 possono offrire il vantaggio unico di promuovere contemporaneamente la formazione ossea e inibire il riassorbimento. Questo protocollo fornisce ai ricercatori procedure standardizzate per studiare la regolazione del metabolismo osseo mediata dalle citochine indotta dall'esercizio fisico e facilita lo sviluppo di interventi terapeutici mirati per i disturbi ossei legati all'età.

Introduzione

L'osteoporosi postmenopausale (PMOP) rappresenta un esempio paradigmatico di declino muscoloscheletrico legato all'età in cui la disregolazione del sistema immunitario precipita la perdita ossea patologica ^1,2,3. Sebbene l'esercizio fisico sia ampiamente riconosciuto come l'intervento non farmacologico più efficace per prevenire il deterioramento osseo legato all'età, i precisi meccanismi molecolari alla base della protezione ossea indotta dall'esercizio sono rimasti sfuggenti fino^{a poco tempo} fa. La comprensione contemporanea del metabolismo osseo si è evoluta oltre i tradizionali quadri endocrinologici per comprendere complesse interazioni osteoimmuni e miochine indotte dall'esercizio fisico che governano l'omeostasi scheletrica⁵.

La recente identificazione del fattore 1 delle citochine cardiotrofine simili (CLCF1) come fattore indotto dall'esercizio fisico che combatte il declino muscoloscheletrico legato all'età rappresenta un cambiamento di paradigma nella comprensione del crosstalk osso-muscolo⁶. Questa scoperta rivoluzionaria spiega gli effetti protettivi dell'osso ben consolidati dell'esercizio attraverso un meccanismo molecolare precedentemente sconosciuto, posizionando CLCF1 come mediatore chiave dell'osteoanabolismo indotto dall'esercizio⁷. I topi transgenici che sovraesprimono CLCF1 hanno dimostrato una maggiore formazione ossea, una migliore tolleranza al glucosio e prestazioni fisiche superiori rispetto ai controlli wild-type⁶, suggerendo che l'integrazione di CLCF1 potrebbe potenzialmente imitare i benefici dell'esercizio fisico nelle popolazioni sedentarie o con mobilità compromessa.

Il trattamento mimetico dell'esercizio è definito come interventi farmacologici che replicano la cinetica CLCF1 indotta dall'esercizio, fornendo benefici terapeutici simili all'attività fisica attraverso le vie molecolari⁸. Il fattore 1 delle citochine cardiotrofina-simile (CLCF1), alternativamente designato come neurotrofina-1 (NNT-1) o fattore stimolante delle cellule B-3 (BSF-3), appartiene alla superfamiglia delle citochine interleuchina-6 (IL-6) e mostra funzioni biologiche pleiotropiche⁸. Originariamente caratterizzato per le sue proprietà neurotrofiche nella sopravvivenza e nello sviluppo dei motoneuroni spinali, il ruolo di CLCF1 come miochine indotta dall'esercizio è emerso come un'area di indagine significativa. Recenti studi clinici hanno convalidato CLCF1 come biomarcatore per lo stato di salute delle ossa, dimostrando che i livelli di proteina CLCF1 nelle cellule mononucleate del sangue periferico sono significativamente ridotti nelle donne in postmenopausa con osteoporosi rispetto ai controlli sani⁹. Questi studi hanno mostrato correlazioni positive tra l'espressione di CLCF1 e la densità minerale ossea in più siti scheletrici, fornendo una validazione clinica che rafforza il potenziale traslazionale degli interventi terapeutici mirati a CLCF1.

Le citochine operano attraverso complessi recettoriali eteromerici, tra cui i recettori solubili del fattore neurotrofico ciliare (sCNTFR) e il fattore 1 simile al recettore delle citochine (CRLF-1), per orchestrare diverse risposte cellulari^10,11. Recenti studi meccanicistici hanno chiarito il paradigma del doppio segnale in base al quale CLCF1 inibisce contemporaneamente il riassorbimento osseo e promuove la formazione ossea 2,6,7,9. Questa duplice azione avviene attraverso l'attivazione della via del trasduttore di segnale differenziale e dell'attivatore della trascrizione (STAT): la fosforilazione di STAT1 media la soppressione degli osteoclasti interferendo con l'attivatore del recettore del segnale del fattore nucleare-ligando κB (RANKL) indotto dal fattore nucleare-κB (RANKL) (NF-κB), mentre l'attivazione di STAT3 negli osteoblasti promuove l'espressione dei marcatori di formazione ossea, tra cui la fosfatasi alcalina e l'osteocalcina.

Comprendere come le risposte acute all'esercizio si traducano in adattamenti ossei cronici rimane fondamentale per lo sviluppo terapeutico¹³. Mentre l'aumento acuto di CLCF1 dopo singoli periodi di esercizio fornisce intuizioni meccanicistiche, le risposte acute ripetute per settimane o mesi possono portare a effetti protettivi dell'osso sostenuti attraverso la segnalazione cumulativa e gli adattamenti cellulari¹⁴.

Il razionale per studiare CLCF1 nella fisiopatologia osteoimmune deriva dal suo ruolo consolidato nella regolazione dei linfociti B e dal riconoscimento che le cellule B costituiscono produttori significativi sia di RANKL che di osteoprotegerina (OPG)^12,13. L'attivatore del recettore dell'asse fattore nucleare-ligando κB (RANKL)/osteoprotegerina (OPG) funge da meccanismo di regolazione centrale per la differenziazione degli osteoclasti e il riassorbimento osseo^14,15. A differenza di altri membri della famiglia IL-6 che hanno dimostrato il controllo regolatorio sull'omeostasi scheletrica attraverso la modulazione del rimodellamento osseo, l'esclusivo meccanismo di doppia protezione ossea di CLCF1 offre un potenziale terapeutico superiore 16,17,18.

I vantaggi di questo protocollo rispetto alle metodologie esistenti includono il suo approccio completo all'indagine osteoimmune da esercizio, che incorpora sia l'analisi di correlazione clinica che gli studi cellulari meccanicistici per fornire informazioni traslazionali sulla regolazione del metabolismo osseo mediata da CLCF1. La rilevanza clinica di questo protocollo è ulteriormente rafforzata dall'emergere di prove che i livelli di CLCF1 possono essere modulati attraverso interventi sullo stile di vita, posizionandolo come bersaglio terapeutico attuabile per i disturbi ossei legati all'età.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico per la ricerca istituzionale (Protocollo #2024-CHSD-0156) e aderisce ai principi della Dichiarazione di Helsinki. Tutte le procedure per gli animali sono state conformi alle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Protocollo #2024-037). Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto.

1. Raccolta di campioni clinici e valutazione dell'intervento di esercizio

Reclutamento dei partecipanti e valutazione della cronologia degli esercizi
1. Reclutare donne in postmenopausa di età compresa tra 55 e 75 anni con una durata minima di 1 anno in postmenopausa.
2. Valuta la cronologia dettagliata degli esercizi, inclusa la frequenza, l'intensità, il tipo e la durata dell'attività fisica negli ultimi 6 mesi utilizzando questionari standardizzati sull'attività fisica.
3. Classificare i partecipanti in gruppi sedentari (< 150 minuti a settimana), moderatamente attivi (150-300 minuti a settimana) e molto attivi (> 300 minuti a settimana) in base alle linee guida dell'OMS sull'esercizio fisico.
4. Esegui una valutazione completa dell'anamnesi e l'esame fisico, inclusa la revisione dei farmaci e lo screening delle comorbidità.
5. Ottenete misure di assorbimetria a raggi X (DXA) a doppia energia utilizzando il densitometro Hologic Discovery A con software APEX v4.5. Eseguire la calibrazione giornaliera con il fantoccio della colonna vertebrale. Posizionare il paziente supino con le gambe sollevate su un blocco di posizionamento secondo le linee guida dell'International Society for Clinical Densitometry (ISCD).
6. Classificare i partecipanti in base ai criteri dell'Organizzazione Mondiale della Sanità per l'osteoporosi (T-score ≤ -2,5 SD).
7. Applicare i criteri di esclusione: precedente terapia anti-osteoporotica entro 12 mesi, trattamenti immunosoppressivi, malattie metaboliche ossee, osteoporosi secondaria o controindicazioni al test da sforzo.
Valutazione della risposta CLCF1 indotta dall'esercizio fisico
1. Raccogliere campioni di sangue al basale tra le 8:00 e le 10:00 dopo 12 ore di digiuno notturno in provette EDTA.
2. Implementare un protocollo standardizzato di esercizio acuto: 45 minuti di camminata di intensità moderata al 65-70% della frequenza cardiaca massima. Calcola la frequenza cardiaca massima utilizzando la formula di Karvonen (220 anni)¹⁹. Esegui l'esercizio su un tapis roulant motorizzato con monitoraggio continuo della frequenza cardiaca tramite un monitor della fascia toracica. Mantenere la velocità di camminata a 3,5-4,5 km/h con regolazione della pendenza per raggiungere la frequenza cardiaca target.
3. Raccogliere campioni di sangue post-esercizio a intervalli di 1 ora, 4 ore e 24 ore per valutare la cinetica di CLCF1, mantenendo condizioni di raccolta coerenti.
4. Conservare le aliquote di siero a -80 °C per la successiva quantificazione con CLCF1. Utilizzare il kit ELISA CLCF1 umano con un intervallo di rilevamento di 31,2-2000 pg/mL. Diluire i campioni 1:2 in diluente per saggi. Preparare una curva standard a 7 punti utilizzando diluizioni seriali a 2 volte. Eseguire esempi in duplicato. Lettura di lastre a 450 nm con correzione della lunghezza d'onda di 540 nm. Accettare un coefficiente di variazione (CV) < 20 % tra i duplicati.
Protocollo di intervento sull'esercizio longitudinale
1. Progetta un programma di esercizi progressivi di 12 settimane con tre sessioni a settimana.
2. Raccogliere campioni di sangue al basale, a 4, 8 e 12 settimane per l'analisi della traiettoria CLCF1.
3. Valuta i miglioramenti della forma fisica utilizzando il test VO2 max al basale e al punto finale.
4. Correlare le variazioni di CLCF1 con i miglioramenti della BMD misurati mediante DXA a 12 settimane.
5. Documenta gli adattamenti dell'allenamento, inclusa la tolleranza all'esercizio e i modelli di recupero.

2. Isolamento ed elaborazione migliorati di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

Isolamento PBMC ottimizzato per l'analisi CLCF1
1. Raccogliere 20 mL di campioni di sangue venoso in provette contenenti EDTA (5 mL di EDTA per provetta) in condizioni sterili.
2. Processare i campioni entro 2 ore dalla raccolta per una vitalità cellulare ottimale e la conservazione dell'espressione di CLCF1.
  1. Diluire i campioni di sangue 1:1 con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a temperatura ambiente. Mescolare 20 mL di sangue con 20 mL di PBS.
  2. Strato di sangue diluito su terreno di gradiente di densità in provette coniche da 50 mL. Utilizzare un terreno di gradiente di densità di 15 mL per 20 mL di sangue diluito (rapporto 1:1,33).
3. Centrifugare a 400 × g per 30 min a temperatura ambiente senza interruzioni.
4. Aspirare con cautela lo strato di PBMC all'interfaccia plasma-Ficoll utilizzando una pipetta sterile Pasteur.
5. Lavare due volte le cellule con PBS contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) mediante centrifugazione a 300 × g per 10 minuti.
Valutazione della vitalità cellulare e misurazione basale di CLCF1
1. Determinare la vitalità cellulare utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano (obiettivo > vitalità del 95%)²⁰.
2. Valutare l'espressione intracellulare di CLCF1 al basale immediatamente dopo l'isolamento.
3. Regolare la concentrazione delle cellule a 1 × 10⁶ cellule/mL in un terreno appropriato.
4. Allocare le celle per applicazioni a valle o immagazzinarle in azoto liquido. Congelare le PBMC in un mezzo di congelamento contenente il 90% di FBS + il 10% di DMSO. Utilizzare un contenitore di congelamento a velocità controllata da -1 °C/min a -80 °C. Conservare 1 mL di aliquote (5 × 10⁶ cellule/flaconcino) in crioviali.

3. Analisi quantitativa completa dell'espressione genica

Estrazione e purificazione dell'RNA con considerazioni specifiche per CLCF1
1. Lisi 1 × 10⁶ PBMC in 1 mL di reagente di lisi dell'RNA entro 1 ora dall'isolamento.
2. Aggiungere 200 μl di cloroformio, agitare energicamente e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
3. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per ottenere la separazione di fase.
4. Trasferire la fase acquosa in una provetta nuova, aggiungere un volume uguale di isopropanolo.
5. Precipitare l'RNA per centrifugazione a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
6. Lavare il pellet di RNA con etanolo al 75%, asciugarlo all'aria e scioglierlo in acqua priva di nucleasi.
7. Valutare l'integrità dell'RNA utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio o il bioanalizzatore (target RIN >7.0).
Trascrizione inversa e PCR quantitativa con set di primer aggiornati
1. Quantificare la concentrazione di RNA utilizzando l'analisi spettrofotometrica (target A260/A280 rapporto 1,8-2,2).
2. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando 1 μg di RNA totale con il kit di reagenti per trascrizione inversa.
3. Preparare le reazioni qPCR: Preparare reazioni da 20 μL contenenti 10 μL di Master Mix, 0,8 μL di ciascun primer (10 μM di stock, finale 400 nM), 2 μL di stampo di cDNA (50 ng), 6,4 μL di acqua priva di nucleasi. Esegui in triplice copia. Utilizzare un sistema PCR in tempo reale.
4. Utilizzare sequenze di primer convalidate:
  1. CLCF1 in avanti: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
    retromarcia: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
  2. CRLF1 in avanti: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
    rovescio: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
  3. STAT1 avanti: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
    retromarcia: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
  4. STAT3 attaccante: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
    rovescio: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
5. Eseguire il protocollo qPCR: 95 °C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 minuto.
6. Analizzare i risultati utilizzando il metodo 2^(-ΔΔCt) con normalizzazione β-actina²¹.
Analisi del pannello genico sforzo-risposta
1. Includere geni responsivi all'esercizio: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 e miostatina.
2. Utilizzare sequenze di primer convalidate:
  1. IL-6 avanti: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
    rovescio: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3';
  2. TNF-α avanti: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
    rovescio: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
  3. IL-1β in avanti: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
    retromarcia: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
  4. BDNF in avanti: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3',
    rovescio: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
  5. IGF-1 avanti: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
    rovescio: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
  6. Miostatina in avanti: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
    retromarcia: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
3. Correlare i cambiamenti indotti dall'esercizio in CLCF1 con altri modelli di espressione della miochina.
4. Valutare i rapporti di co-espressione CLCF1/CRLF1 come indicatori della formazione di complessi citochinici funzionali.

4. Analisi avanzata dell'espressione proteica con focus sulla via STAT

Estrazione e quantificazione di proteine per l'analisi STAT
1. Lisi di PBMC in tampone di lisi (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0) integrato con cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi.
2. Aggiungere alcuni inibitori specifici della fosfatasi: ortovanadato di sodio (1 mM) e fluoruro di sodio (50 mM) immediatamente prima dell'uso.
3. Incubare i lisati su ghiaccio per 30 min con vortice periodico a velocità media ogni 10 min.
4. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
5. Quantificare la concentrazione di proteine utilizzando il saggio Bradford o il metodo BCA²².
6. Regolare le concentrazioni proteiche a 2 μg/μL in un tampone campione e conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi per applicazioni di western blotting.
Analisi completa del western blot con focus sulla segnalazione STAT
1. Preparare 10 mL di gel SDS-PAGE al 10% utilizzando soluzioni standard di acrilammide/bisacrilammide.
2. Caricare 20 μg di proteine per corsia insieme a marcatori di peso molecolare precolorati e risolvere a 120 V per 90 minuti.
3. Trasferire le proteine alle membrane in PVDF a 100 V per 2 ore a 4 °C utilizzando il tampone di trasferimento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo).
4. Bloccare le membrane con 50 mL di latte in polvere scremato al 5% in soluzione salina tamponata con Tris con Tween-20 allo 0,1% (TBST).
5. Incubare con anticorpi primari per una notte a 4 °C: Anti-CLCF1 (1:1.000); Anti-CRLF1 (1:1.000); Anti-OPG (1:1.000); Anti-RANKL (1:1.000); Anti-JAK2 (1:1.000); Anti-fosfo-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1.000); Anti-STAT1 (1:1.000); Anti-fosfo-STAT1 (Tyr701, 1:1.000); Anti-STAT3 (1:1.000); Anti-fosfo-STAT3 (Tyr705, 1:1.000); Anti-β-actina (1:1.000)
6. Lavare le membrane 3 volte per 10 minuti ciascuna con 15 ml di TBST. Incubare con anticorpi secondari appropriati per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Rileva le bande proteiche utilizzando un substrato di chemiluminescenza potenziato. Immagine con sistema di imaging a chemiluminescenza con ottimizzazione automatica dell'esposizione. Quantifica utilizzando l'analisi densitometrica con lo strumento di analisi su gel ImageJ v1.53.
Analisi della doppia via STAT1/STAT3
1. Calcola i rapporti fosfo-STAT1/STAT1 totale e fosfo-STAT3/STAT3 totale utilizzando il software ImageJ/Fiji versione 1.54f.
2. Valutare il bilancio di attivazione STAT1/STAT3 come indicatore dell'attività funzionale di CLCF1.
3. Correlare i pattern di attivazione delle statistiche con i rapporti di espressione RANKL/OPG.
4. Valutare la fosforilazione di STAT1/STAT3 tramite Western blot a 0, 15, 30, 60, 120 e 240 minuti dopo il trattamento con CLCF1. Normalizzare la fosfoproteina ai livelli proteici totali utilizzando la densitometria.

5. Knockout genico avanzato mediato da CRISPR/Cas9 con convalida

Costruzione migliorata del vettore lentivirale
1. Progettare l'RNA a guida singola (sgRNA) che ha come bersaglio la sequenza genica CLCF1:
  TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
2. Includi sequenze di sgRNA aggiuntive per una migliore efficienza del knockout:
  GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
3. Clonare gli sgRNA in vettore lentivirale utilizzando tecniche di clonaggio molecolare standard.
4. Verifica l'integrità del costrutto attraverso l'analisi del sequenziamento del DNA.
5. Valutare l'efficienza di taglio dell'sgRNA utilizzando il test dell'endonucleasi I T7²³.
6. Includere la convalida della specificità del percorso utilizzando inibitori: AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabina (STAT1, 10 μM) e Stattic (STAT3, 5 μM).
7. Esegui esperimenti di salvataggio utilizzando costrutti STAT costitutivamente attivi per convalidare la necessità del percorso.
Protocollo di trasduzione lentivirale ottimizzato
1. Coltura di cellule Raji in terreno RPMI-1640 (500 mL) integrato con il 10% di FBS. Mantenere tutte le colture cellulari a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Pre-equilibrare i terreni di coltura per almeno 30 minuti prima dell'uso.
2. Pretrattare le cellule con polibrene (8 μg/mL) per migliorare l'efficienza di trasduzione.
3. Produrre lentivirus utilizzando cellule HEK293T con plasmidi di imballaggio e involucro tramite trasfezione di fosfato di calcio. Determinare il titolo mediante p24 ELISA (> 10⁸ TU/mL richiesto). Seguire le procedure di contenimento BSL-2²³.
4. Trasdurre le cellule con lentivirus a una molteplicità di infezione (MOI) di 100. Cambio del supporto 24 ore dopo la trasduzione. Selezionare le cellule trasdotte utilizzando la puromicina (4 μg/mL) per 7 giorni, quindi amplificare una regione di 500 bp che attraversa il sito target utilizzando le seguenti condizioni PCR: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 s, ricottura a 60 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 30 s, con un'estensione finale a 72 °C per 5 min. Per il saggio dell'endonucleasi T7, denaturare e ricuocere i prodotti della PCR, digerire con endonucleasi T7E1 per 30 minuti a 37 °C, quindi analizzare i prodotti su un gel di agarosio al 2%.
5. Convalidare l'efficienza del knockout genico attraverso il western blotting e il sequenziamento Sanger^24,25.
6. Eseguire analisi fuori bersaglio utilizzando GUIDE-seq o una metodologia simile²⁶.
  NOTA: Recenti evidenze dimostrano che l'efficienza della secrezione di CLCF1 richiede la co-espressione con la proteina chaperone CRLF1. Prendere in considerazione approcci a doppio knockout per un'ablazione funzionale completa²⁷.

6. Sistema completo di co-coltura con mimetici dell'esercizio

NOTA: Per la validazione traduzionale, adattarsi a modelli murini ovariectomizzati somministrando rhCLCF1 a 10 μg/kg i.p. al giorno per 4 settimane, valutando la BMD tramite micro-CT.

Configurazione avanzata della co-coltura Raji-MG-63
1. Seminare cellule simili agli osteoblasti MG-63 in camere inferiori a piastra a 24 pozzetti a una densità di 2 × 10⁴ cellule/pozzetto in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO₂ e 95% di umidità. Pre-equilibrare il fluido nell'incubatrice per 30 minuti prima dell'uso. Per una migliore traduzione, sostituire con osteoblasti umani primari (densità 1 ×^{10 4}/pozzetto) da fonti commerciali.
2. Posizionare inserti di membrana con pori di 0,4 μm in pozzetti contenenti cellule MG-63.
3. Cellule Raji seme (wild-type, CLCF1-knockout o CLCF1-overexpressing) in camere superiori a densità di 1 × 10⁵ cellule/pozzetto.
4. Mantenere le co-colture in terreno RPMI-1640 completo (2 mL nella camera inferiore, 1,5 mL nella camera superiore) per periodi sperimentali specificati (7, 14, 21 giorni) a 37 °C con CO₂ al 5%.
5. Includere gruppi di trattamento con CLCF1 ricombinante (5-10 ng/mL) per valutare le relazioni dose-risposta.
Protocollo di trattamento CLCF1 mimetico dell'esercizio
1. Trattare i sistemi di co-coltura con concentrazioni fisiologiche di CLCF1 ricombinante (5-10 ng/mL) in base ai livelli indotti dall'esercizio.
2. Applicare il regime di trattamento pulsatile CLCF1: applicare CLCF1 per impulsi di 2 ore a 0, 8 e 16 ore il giorno 1, seguito da un'esposizione continua per 24 ore, quindi ripetere il ciclo. Durata totale del trattamento: 7 giorni con 9 impulsi totali.
3. Valutare gli effetti dipendenti dal tempo a 1 ora, 4 ore, 24 ore e 7 giorni dopo il trattamento.
4. Monitorare la cinetica di fosforilazione di STAT1/STAT3 in entrambe le popolazioni cellulari tramite Western blot a 0, 15, 30, 60 min. Lisi le cellule in tampone (500 μL) con inibitori, normalizzare a STAT1/3 totale e β-actina.
Valutazione avanzata della differenziazione osteogenica
1. Indurre la differenziazione osteogenica utilizzando un terreno osteogenico standard contenente acido ascorbico (50 μg/mL), β-glicerofosfato (10 mM) e desametasone (10 nM). Cambiare il terreno osteogenico ogni 3 giorni (2 mL nella camera inferiore, 1,5 mL nella camera superiore). Preparare una soluzione fresca di acido ascorbico per ogni cambio; β-glicerofosfato e desametasone rimangono stabili.
2. Valutare l'attività della fosfatasi alcalina (ALP) utilizzando il saggio enzimatico colorimetrico ai giorni 7, 14 e^{21 28}. Utilizzare 500 μl di volume di estrazione. Lettura a 405 nm. Normalizzare al contenuto proteico totale. Gamma di colori prevista: dal giallo chiaro (basso) al giallo scuro (alto).
3. Valutare la deposizione di calcio attraverso la colorazione e la quantificazione del rosso di alizarina al giorno 21. Estratto con 500 μl di cloruro di cetilpiridinio, letto a 540 nm, gamma di colori prevista: dal rosa chiaro (bassa mineralizzazione) al rosso scuro (alta mineralizzazione).
4. Quantificare la mineralizzazione misurando l'assorbanza a 540 nm dopo l'estrazione del cloruro di cetilpiridinio.
5. Analizzare l'espressione genica osteogenica: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN e OPG utilizzando i protocolli qPCR descritti nel passaggio 3.2.
6. Valutare i marcatori correlati agli osteoclasti: TRAP, catepsina K e RANKL nelle cellule MG-63.

7. Analisi statistica avanzata e interpretazione dei dati

Metodologia statistica completa
1. Eseguire il test di normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk per tutte le variabili continue²⁹. Utilizzare test non parametrici quando vengono violate le ipotesi di normalità (p < 0,05).
2. Applicare il test U di Mann-Whitney per confronti non parametrici tra gruppi³⁰.
3. Condurre l'analisi di correlazione di Spearman per studi di associazione tra i livelli di CLCF1 e i parametri clinici³¹.
4. Eseguire analisi di regressione multipla per valutare predittori indipendenti di BMD.
5. Utilizzare l'ANOVA a misure ripetute per l'analisi del tempo-andamento dell'intervento sull'esercizio³².
6. Applicare la correzione di Bonferroni per confronti multipli³³.
7. Impostare la soglia di significatività statistica a p < 0,05 per tutte le analisi.
Presentazione e analisi dei dati migliorate
1. Presenta i dati continui come media ± deviazione standard o mediana con intervallo interquartile.
2. Crea grafici di correlazione per l'espressione di CLCF1 rispetto alla BMD, alla conta dei linfociti e ai parametri dell'esercizio utilizzando GraphPad Prism v9 per le statistiche, ImageJ v1.53 per la densitometria. Non sono necessari script personalizzati. Genera ROC tramite lo strumento integrato di Prism; correlazioni tramite Spearman in Prism.
3. Genera grafici dell'andamento temporale per la cinetica di risposta CLCF1 indotta dall'esercizio.
4. Sviluppo di curve ROC (Operating Characteristic) del ricevitore per CLCF1 come biomarcatore dell'osteoporosi.
  NOTA: Le immagini rappresentative del western blot sono state create utilizzando l'analisi densitometrica quantitativa.

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Risultati

L'implementazione di questo protocollo dimostra con successo il ruolo regolatorio di CLCF1 nel metabolismo osseo immuno-mediato utilizzando molteplici approcci sperimentali. Gli studi di validazione clinica mostrano una significativa sottoregolazione dell'espressione di CLCF1 nei pazienti PMOP rispetto ai controlli sani, come dimostrato nella Figura 1A, l'analisi PCR quantitativa delle cellule mononucleate del sangue periferi...

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Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un quadro metodologico completo per studiare il ruolo di CLCF1 come mediatore della protezione ossea indotto dall'esercizio fisico attraverso un'analisi sistematica dell'asse RANKL/OPG. Recenti ricerche rivoluzionarie hanno identificato CLCF1 come un fattore indotto dall'esercizio che combatte il declino muscoloscheletrico legato all'età, posizionandolo come mediatore centrale della protezione ossea indotta dall'esercizio 34,35,36.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano i partecipanti che si sono offerti volontari per questo studio e il personale clinico dell'Ospedale Centrale affiliato alla Shandong First Medical University per la loro assistenza nel reclutamento dei pazienti e nella raccolta dei campioni. Ringraziamo i tecnici di laboratorio per il loro supporto nelle colture cellulari e negli esperimenti di biologia molecolare. H.Z. ha ideato e progettato lo studio, ha eseguito gli esperimenti, ha analizzato i dati e ha scritto il manoscritto. H.L. ha contribuito alla progettazione sperimentale, alla raccolta dei dati e alla revisione dei manoscritti. Y.S. ha supervisionato il progetto, ha fornito un feedback critico e ha curato il manoscritto. Tutti gli autori hanno esaminato e approvato il manoscritto finale per la presentazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Media di coltura cellulare e media Reagenti
Dimetil Solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Purpose_Application: Componente del mezzo di crioconservazione Specifications_Comments: Grado biologico molecolare, filtrato sterile
Mezzo DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	Purpose_Application: Mezzo di coltura di osteoblasti MG-63 Specifications_Comments: Formulazione ad alto contenuto di glucosio con L-glutamina
Siero Fetale Bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16000044	Purpose_Application: Integratore per coltura cellulare (inattivato al calore) Specifications_Comments: inattivato al calore a 56Â ° C per 30 min
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Purpose_Application: Integratore antibiotico per coltura sterile Specifications_Comments: 100 volte la sta, concentrazione finale 1%
Polibrene (bromuro di esadimetrina)	Santa Cruz Biotecnologia	SC-134220	Purpose_Application: Potenziatore della trasduzione lentivirale Specifications_Comments: 8 & Icirc; ¼ Concentrazione di lavoro g/mL
Diidrocloruro di puromicina	InvivoGen	ANT-PR-1	Purpose_Application: Antibiotico di selezione per cellule trasdotte Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ Concentrazione di selezione g/mL per 7 giorni
RPMI-1640 media	Thermo Fisher Scientific	11875093	Purpose_Application: Raji B-coltura di linfociti Specifications_Comments: Con L-glutammina, preferito senza rosso di fenolo
Soluzione Trippan Blue	Thermo Fisher Scientific	15250061	Purpose_Application: Valutazione della vitalità cellulare Specifications_Comments: soluzione dello 0,4% per il test di esclusione
Contenitore di congelamento a velocità controllata	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Purpose_Application: Congelamento delle celle a velocità controllata (-1Â ° C/min) Specifications_Comments: Mr. Frosty o equivalente per -1Â ° Raffreddamento C/min
Tubi di raccolta del sangue EDTA	BD in Biologia	366643	Purpose_Application: Raccolta venosa con anticoagulante Specifications_Comments: capacità 10-20 mL, tubi superiori viola
Gradiente di densità FICOLL-Paque PLUS	Cytiva (GE Healthcare)	17144003	Purpose_Application: Isolamento PBMC tramite centrifugazione a densità Specifications_Comments: Sterile, testato con endotossine per separazione cellulare
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190144	Purpose_Application: Lavaggio cellulare e tampone diluizionale Specifications_Comments: Sterile, di grado coltura cellulare
RNA forte e qPCR
Cloroformio (Grado ACS)	Sigma-Aldrich	C2432	Purpose_Application: Separazione di fase nell'estrazione di RNA Specifications_Comments: grado reagente ACS, â ‰ ¥ 99% di purezza
Etanolo (75%, grado molecolare)	Sigma-Aldrich	E7023	Purpose_Application: Lavaggio dei pellet di RNA Specifications_Comments: Grado biologico molecolare, preparare fresco
Isopropanolo (grado molecolare)	Sigma-Aldrich	I9516	Purpose_Application: Precipitazione dell'RNA Specifications_Comments: grado di biologia molecolare, â ‰ ¥ Purezza del 99,5%
Acqua priva di nucleasi	Thermo Fisher Scientific	AM9930	Purpose_Application: Preparazione alla reazione PCR Specifications_Comments: Priva di DNasi/RNasi, testata per applicazioni PCR
Film adesivo ottico	Thermo Fisher Scientific	4311971	Purpose_Application: Sigillatura ottica per piastre qPCR Specifications_Comments: Qualità ottica per applicazioni qPCR
Piastre PCR (96 pozzi)	Thermo Fisher Scientific	N8010560	Purpose_Application: Formato a 96 pozzi per qPCR Specifications_Comments ad alta produttività: Bianco, fondo trasparente per il rilevamento ottico
Strisce per tubi PCR	Thermo Fisher Scientific	AB0451	Purpose_Application: Reazioni PCR a piccolo volume Specifications_Comments: strisce a 8 tubi con tappi individuali
Kit di reagenti PrimeScript RT	Biografia di Takara	RR037A	Purpose_Application: Trascrizione inversa di RNA in cDNA Specifications_Comments: Con gomma gDNA per la rimozione genomica del DNA
SYBR Green Master Mix	Biosistemi applicati	4309155	Purpose_Application: Amplificazione e rilevamento PCR in tempo reale Specifications_Comments: con colorante di riferimento ROX per la normalizzazione
Reagente TRIzol (Lisi di RNA)	Thermo Fisher Scientific	15596026	Purpose_Application: Lisi cellulare ed estrazione di RNA Specifications_Comments: conserva a 4Â ° C, da utilizzare entro 6 mesi
- Western Blot
Acrilammide/Bis-acrilammide (29:1)	Bio-Rad	1610146	Purpose_Application: SDS-PAGE polimerizzazione gel Specifications_Comments: soluzione di acrilammide al 30%
Kit per il test proteico BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	Purpose_Application: Quantificazione della concentrazione proteica Specifications_Comments: Compatibile con la riduzione per una quantificazione accurata
Substrato a Chimiluminescenza Potenziata (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32106	Purpose_Application: Rilevamento delle proteine chemiluminescenti Specifications_Comments: Rilevamento della sensibilità da femtogramma
Latte secco scremo	Laboratorio Scientifico	170-6404	Purpose_Application: Western blotting agente Specifications_Comments: Grado di bloccaggio, basso background
Cocktail di inibitori della fosfatasi	Scienza Applicata Roche	4906845001	Purpose_Application: Prevenire la defosforilazione delle proteine Specifications_Comments: Include acido okadaico e calicolina A
Scala delle proteine prestainate	Bio-Rad	1610394	Purpose_Application: Standard di riferimento del peso molecolare Specifications_Comments: intervallo 10-250 kDa con 11 bande
Cocktail di inibitori della proteasi	Scienza Applicata Roche	11697498001	Purpose_Application: Prevenire la degradazione delle proteine durante la lisi Specifications_Comments: EDTA per le fosfatasi dipendenti da metalli
Membrane PVDF (0,45 & icirc; ¼ m)	Millipore Sigma	IPVH00010	Purpose_Application: Membrana di trasferimento proteico (0,45 & Icirc; ¼ poro m) Specifications_Comments: Fondo a bassa fluorescenza
Buffer di lisi RIPA	Tecnologia di segnalazione cellulare	9806S	Purpose_Application: Estrazione proteica a cellula intera Specifications_Comments: tampone per la lisi pronto all'uso con detersivi
Buffer di caricamento campione (4X)	Bio-Rad	1610747	Purpose_Application: Preparazione del campione proteico per SDS-PAGE Specifications_Comments: Caricamento del colorante con Î ²-mercaptoetanolo
SDS-PAGE Buffer di esecuzione	Bio-Rad	1610732	Purpose_Application: Elettroforesi proteica Specifications_Comments: sistema tampone Tris-glicina-SDS
Fluoruro di sodio	Sigma-Aldrich	201154	Purpose_Application: Inibizione aggiuntiva della fosfatasi Specifications_Comments: 50 mM concentrazione di lavoro
Ortovanadato di sodio	Sigma-Aldrich	S6508	Purpose_Application: JAK2/STAT fosforilazione preservazione Specifications_Comments: 1 mM concentrazione di lavoro, preparare fresco
Concentrato di tampone di trasferimento	Bio-Rad	1704156	Purpose_Application: Trasferimento proteico semi-secco Specifications_Comments: 10 volte concentrato, diluire prima dell'uso
Soluzione fisiologica con Tris Buffer con Tween-20 (TBST)	Tecnologia di segnalazione cellulare	9997S	Purpose_Application: Lavaggio della membrana e diluizione degli anticorpi Specifications_Comments: 0,1% Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Editing Genetico
Kit di trasfezione di fosfato di calcio	Promega	E1200	Purpose_Application: Trasfezione di DNA nelle cellule di imballaggio Specifications_Comments: Alta efficienza di trasfezione per la produzione di lentivirus
Kit per l'estrazione del gel di DNA	Qiagen	28706	Purpose_Application: Purificazione PCR del prodotto per sequenziamento Specifications_Comments: Sistema di purificazione basato su colonne
GV371 Vettore lentivirale	GeneChem Co., Ltd	GV371	Purpose_Application: Espressione CRISPR/Cas9 per geni knockout Specifications_Comments: Sistema lentivirale CRISPR/Cas9 pronto all'uso
HEK293T Linea Cellulare	ATCC	CRL-3216	Purpose_Application: Linea cellulare per imballaggio lentivirale Specifications_Comments: linea cellulare di imballaggio altamente trasfettabile
Servizio di Sequenziamento Sanger	Macrogen Inc.	Costume	Purpose_Application: Validazione del knockout e analisi off-target Specifications_Comments: sequenziamento standard con primer personalizzati
Endonucleasi T7 I	New England Biolabs	M0302S	Purpose_Application: Validazione dell'efficienza del taglio CRISPR Specifications_Comments: endonucleasi specifica per disadattamento per la validazione CRISPR
ELISA & Immunoanalisi
Piastre ELISA (96 pozzi, fondo piatto)	Corning	3590	Purpose_Application: Reazione del substrato ELISA Specifications_Comments: Alto legame, fondo piatto per ELISA
CLCF1 DuoSet ELISA umano	R& Sistemi D	DY1234	Purpose_Application: Quantificazione della proteina CLCF1 (31,2-2000 pg/mL) Specifications_Comments: Intervallo di rilevamento: 31,2-2000 pg/mL, CV & 10%
Kit ELISA p24 (titolo lentivirale)	ZeptoMetrix Corporation	801111	Purpose_Application: Determinazione del titolo lentivirale Specifications_Comments: Per la determinazione del titolo lentivirale (>10â ¸ TU/mL)
Forti
Kit per la colorazione Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533	Purpose_Application: Visualizzazione della deposizione di calcio Specifications_Comments: soluzione al 2% in acqua distillata, pH 4,1-4,3
Kit di attività della fosfatasi alcalina	Abcam	ab83369	Purpose_Application: Misurazione dell'attività enzimatica ALP Specifications_Comments: Saggio colorimetrico, rilevato a 405 nm
Acido ascorbico (L-Acido ascorbico)	Sigma-Aldrich	A4544	Purpose_Application: Componente del mezzo osteogenico Specifications_Comments: 50 & icirc; ¼ Concentrazione finale g/mL
Cloruro di cetilpiridinio	Sigma-Aldrich	C9002	Purpose_Application: Estrazione con Alizarina Rossa S per quantificazione Specifications_Comments: soluzione al 10% per l'estrazione del colorante
Desametasone	Sigma-Aldrich	D4902	Purpose_Application: Componente del mezzo osteogenico Specifications_Comments: concentrazione finale di 10 nM
Î ²-Glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	Purpose_Application: Componente del mezzo osteogenico Specifications_Comments: concentrazione finale di 10 mM
Mezzo di differenziazione osteogenica	PromoCell	C-28010	Purpose_Application: Induzione della differenziazione degli osteoblasti Specifications_Comments: mezzo osteogenico completo pronto all'uso
Inserti di coltura cellulare Transwell (0.4 & icirc; ¼ m)	Corning	3470	Purpose_Application: Sistema di co-cultura con 0.4 & Icirc; ¼ Separazione M Specifications_Comments: Membrana tereftalata di polietilene, sterile
Equipaggiamento - Strumenti Principali
Centrifuga (ad alta velocità, refrigerata)	Eppendorf	5430R	Purpose_Application: Lavorazione del campione e separazione delle celle Specifications_Comments: Refrigerata, massimo 30.000 x g
Sistema di imaging a chemiluminescenza	Laboratori Bio-Rad	12003154	Purpose_Application: Imaging e quantificazione Western Blot Specifications_Comments: Documentazione dei gel e imaging Western blot
Incubatrice CO2 (umidificata)	Thermo Fisher Scientific	51030287	Purpose_Application: Mantenimento della coltura cellulare (37Â ° C, 5% CO2) Specifications_Comments: Triplo gas (CO2/O2/N2), controllo dell'umidità
Cardiofrequenzimetro (fascia toracica)	Polar Electro	H10	Purpose_Application: Monitoraggio continuo della frequenza cardiaca Specifications_Comments: connettività Bluetooth e Acirc; ± Precisione di 1 bpm
Scoperta Hologic: Uno scanner DXA	Hologic Inc.	Scoperta A	Purpose_Application: Misurazione della densità minerale ossea Specifications_Comments: Con il software APEX v4.5, è richiesto il controllo qualità giornaliero
Lettore di microplacche (Multimodale)	BioTek Instruments	Sinergia H1	Purpose_Application: Lettura e misurazione dell'assorbenza della piastra ELISA Specifications_Comments: rilevamento UV-Vis, fluorescenza e luminescenza
Tapis roulant motorizzato	Fitness di Vita	95Ti	Purpose_Application: Intervento standardizzato di esercizio fisico Specifications_Comments: velocità variabile 0-16 km/h, pendenza 0-15%
Sistema PCR in tempo reale (CFX96 o equivalente)	Laboratori Bio-Rad	1855195	Purpose_Application: Amplificazione e rilevamento PCR in tempo reale Specifications_Comments: blocco a 96 pozzi, capace di gradiente
Software & Software Strumenti di analisi
APEX Software v4.5 (Analisi DXA)	Hologic Inc.	v4.5	Purpose_Application: Analisi della scansione DXA e calcolo della DMO Specifications_Comments: analisi della DMO con database di riferimento
Bio-Rad CFX Maestro	Laboratori Bio-Rad	CFX Maestro	Purpose_Application: Analisi dei dati qPCR e determinazione del CT Specifications_Comments: Analisi PCR in tempo reale ed esportazione dei dati
GraphPad Prism v9.0	GraphPad Software	v9.0	Purpose_Application: Analisi statistica e generazione di grafi Specifications_Comments: Software statistico con generazione di grafi
ImageJ/Fiji v1.53	Istituti Nazionali di Salute	v1.53	Purpose_Application: Western blot densitometria e analisi delle immagini Specifications_Comments: Analisi delle immagini con strumenti di misurazione
Microsoft Excel 365	Microsoft Corporation	365	Purpose_Application: Organizzazione dei dati e calcoli di base Specifications_Comments: Organizzazione dei dati e funzioni statistiche di base
Consumabili e Consumabili Plastica
Tubi microcentrifughe da 1,5 mL	Eppendorf	22363204	Purpose_Application: Archiviazione e elaborazione di campioni a piccolo volume Specifications_Comments: senza DNasi/RNasi, a basso legame
Tubi conici da 15 mL	Corning	430766	Purpose_Application: Trattamento di campioni a medio volume Specifications_Comments: Polipropilene, graduato, con condensatori
Piastre di coltura cellulare a 24 pozzi	Corning	3524	Purpose_Application: Co-coltura e configurazione del saggio funzionale Specifications_Comments: coltura tissutale trattata, fondo piatto
Tubi conici da 50 mL	Corning	430829	Purpose_Application: Raccolta e lavorazione di campioni di grande volume Specifications_Comments: Polipropilene, graduato, con tappi
Cryovials (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418	Purpose_Application: Conservazione a lungo termine di celle e campioni a -80Â ° C Specifications_Comments: Filettatura esterna, guarnizione dell'anello O, -196Â ° Classificato C
Pipette Pasteur (Sterili)	Fisher Scientific	13-678-20A	Purpose_Application: Raccolta e trasferimento del campione sterile Specifications_Comments: Avvolto singolarmente, sterile

Riferimenti

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