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Articolo metodologico

Inibizione dell'osteoclastogenesi mediante LY90009 attraverso la modulazione del segnale Notch in modelli di malattia osteolitica

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DOI:

10.3791/69178

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7 ottobre 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per valutare gli effetti inibitori dell'inibitore della γ-secretasi LY900009 sull'osteoclastogenesi indotta da RANKL nei macrofagi derivati dal midollo osseo. Il protocollo include la valutazione della citotossicità, i saggi funzionali, le analisi molecolari e la validazione in vivo in un modello osteolitico murino, con applicazioni nello sviluppo terapeutico delle malattie osteolitiche.

Abstract

L'attività disregolata degli osteoclasti contribuisce profondamente alla progressione della malattia osteolitica, ma l'entità delle modalità di intervento terapeutico è limitata dagli effetti avversi. Questo studio ha indagato LY900009, un inibitore della γ-secretasi, e la sua capacità di sopprimere l'osteoclastogenesi indotta da RANKL attraverso la modulazione della segnalazione di Notch. Utilizzando macrofagi derivati dal midollo osseo, abbiamo eseguito valutazioni in vitro complete della citotossicità, della differenziazione e dei saggi funzionali. Per chiarire i meccanismi molecolari sottostanti sono state utilizzate analisi di espressione genica e proteica mediante qPCR e western blotting. L'efficacia in vivo è stata corroborata utilizzando un modello di riassorbimento osseo indotto da lipopolisaccaridi murino. LY900009 inibito la formazione di osteoclasti indotta da RANKL e la funzione di riassorbimento in modo dose-dipendente senza citotossicità alle concentrazioni terapeutiche. Questo trattamento ha ridotto significativamente il numero di osteoclasti TRAP-positivi, la ridotta formazione di cinture di actina e la soppressione della degradazione della matrice ossea. L'espressione dei marcatori degli osteoclasti, tra cui NFATc1, c-Fos, catepsina K e TRAP, è risultata marcatamente sottoregolata. Meccanicisticamente, LY900009 interrotto la segnalazione di Notch e i percorsi MAPK/Akt a valle. La somministrazione in vivo ha ridotto sostanzialmente la distruzione ossea indotta da LPS, migliorando i parametri ossei e riducendo la presenza di osteoclasti. Questi risultati dimostrano che LY900009 inibisce efficacemente l'osteoclastogenesi e il riassorbimento osseo modulando l'asse di segnalazione Notch/MAPK/Akt, rendendolo un promettente candidato terapeutico per i disturbi osteolitici.

Introduzione

L'omeostasi ossea costituisce un paradigma fisiologico squisitamente orchestrato nei vertebrati, armonizzato dal delicato equilibrio tra la formazione ossea mediata dagli osteoblasti e il riassorbimento osseo guidato dagli osteoclasti1. Questo intricato equilibrio mantiene l'integrità scheletrica, la resilienza biomeccanica e la fedeltà metabolica per tutta la durata della vita, rispondendo dinamicamente alle richieste meccaniche, alle perturbazioni endocrine e alle sfide patologiche2. Il ciclo di rimodellamento osseo prevede fasi sequenziali di attivazione, riassorbimento, transizione, formazione e terminazione, ciascuna governata da intricate cascate molecolari che assicurano la sincronizzazione spazio-temporale delle attività cellulari3.

L'interruzione di questo meccanismo omeostatico, in particolare attraverso un'eccessiva attività degli osteoclasti o un'inadeguata funzione degli osteoblasti, precipita la perdita ossea patologica, caratteristica di numerosi disturbi osteolitici 4,5. Queste condizioni comprendono un ampio spettro di malattie, tra cui l'osteoporosi postmenopausale e senescente, l'artrite reumatoide, l'artrite infiammatoria, il coinvolgimento osseo neoplastico, la malattia di Paget e i disturbi parodontali6. Le manifestazioni cliniche di un eccessivo riassorbimento osseo includono un aumento del rischio di fratture, deformità scheletrica, dolore cronico, disabilità funzionale e un notevole carico sanitario 6,7. Le metriche epidemiologiche contemporanee indicano che la sola osteoporosi colpisce oltre 200 milioni di individui in tutto il mondo, con fratture associate che comportano una significativa morbilità, mortalità e costi economici superiori a miliardi di dollari all'anno 7,8.

Gli osteoclasti si manifestano come cellule giganti multinucleate altamente specializzate derivate da precursori ematopoietici della linea dei fagociti mononucleati, in particolare macrofagi derivati dal midollo osseo9. La loro formazione rappresenta un complesso processo a più fasi che richiede il coordinamento preciso di segnali extracellulari, cascate di segnalazione intracellulare e programmi trascrizionali10. Le citochine essenziali che governano l'osteoclastogenesi includono l'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB (RANKL) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), che si legano ai rispettivi recettori RANK e c-Fms per avviare programmi di differenziamento11. L'interazione RANKL-RANK innesca l'attivazione di molteplici vie di segnalazione a valle, tra cui le protein chinasi attivate dal mitogeno (MAPK), il fattore nucleare κB (NF-κB), la fosfoinositide 3-chinasi/proteina chinasi B (PI3K/Akt) e le vie calcio/calcineurina, che convergono sul fattore nucleare delle cellule T attivate citoplasmatico 1 (NFATc1), il principale regolatore trascrizionale dell'osteoclastogenesi 10,11,12.

Tra i vari meccanismi regolatori che controllano la biologia degli osteoclasti, la segnalazione di Notch è emersa come un modulatore critico con funzioni complesse e dipendenti dal contesto13. La via di Notch è un sistema di comunicazione cellula-cellula conservato evolutivamente che governa la determinazione, la differenziazione, la proliferazione e l'apoptosi del destino cellulare attraverso diversi tessuti e stadi di sviluppo14. Nei mammiferi, quattro recettori Notch (Notch1-4) interagiscono con cinque ligandi canonici (Delta-like 1, 3 e 4 e Jagged 1 e 2) per mediare la segnalazione intercellulare. L'attivazione della via coinvolge il legame con il ligando, i cambiamenti conformazionali e la scissione proteolitica sequenziale da parte delle metalloproteasi ADAM e del complesso γ-secretasi, che rilascia infine il dominio intracellulare di Notch (NICD) per la traslocazione nucleare e la regolazione trascrizionale dei geni bersaglio, comprese le famiglie Hes e Hey14,15. Il ruolo della segnalazione di Notch nell'osteoclastogenesi rimane controverso e sembra essere altamente dipendente dal contesto, con studi che riportano effetti sia stimolatori che inibitori a seconda dei sottotipi specifici del recettore, della disponibilità di ligando, del microambiente cellulare e delle condizioni sperimentali 16,17,18.

Gli approcci terapeutici prevalenti per le malattie osteolitiche si concentrano principalmente sulle strategie anti-riassorbimento, tra cui i bifosfonati, il denosumab (inibitore RANKL), i modulatori selettivi del recettore degli estrogeni e la calcitonina 7,8,19. Sebbene questi trattamenti riducano efficacemente il riassorbimento osseo e il rischio di fratture, sono associati a limitazioni significative, tra cui tossicità gastrointestinale, osteonecrosi della mascella, fratture atipiche, aumento del rischio di infezione e preoccupazioni sulla sicurezza a lungo termine. Inoltre, questi agenti possono sopprimere eccessivamente il turnover osseo, compromettendo potenzialmente la qualità ossea e i meccanismi di riparazione. Di conseguenza, vi è un urgente bisogno clinico di nuovi agenti terapeutici in grado di inibire selettivamente l'attività patologica degli osteoclasti, riducendo al minimo gli effetti avversi e preservando la fisiologica capacità di rimodellamento osseo 8,14.

Gli inibitori della γ-secretasi rappresentano una promettente classe di composti con potenziali applicazioni nelle malattie osteolitiche attraverso la modulazione della segnalazione di Notch14,20. Questi agenti sono stati ampiamente studiati in oncologia e nella ricerca sulle malattie neurodegenerative, con diversi composti che avanzano verso gli studi clinici per il morbo di Alzheimer e vari tipi di cancro. LY900009, un potente e selettivo inibitore della γ-secretasi, ha dimostrato proprietà farmacologiche favorevoli, tra cui elevata specificità, biodisponibilità e un profilo di sicurezza gestibile in studi preliminari21,22. Tuttavia, i suoi effetti specifici sull'osteoclastogenesi indotta da RANKL e la potenziale utilità terapeutica nelle malattie osteolitiche rimangono non completamente caratterizzati. Questo studio è stato progettato per valutare se LY900009 potrebbe inibire l'osteoclastogenesi attraverso l'interruzione della segnalazione di Notch, offrendo potenzialmente un nuovo approccio terapeutico per le malattie osteolitiche. Abbiamo sviluppato protocolli completi per valutare i loro effetti sulla formazione degli osteoclasti, sull'attività di riassorbimento osseo, sulle vie di segnalazione e sull'efficacia in vivo nei modelli di perdita ossea infiammatoria.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali e sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Ospedale centrale affiliato alla Shandong First Medical University (numero di approvazione IACUC-2024-015). Lo studio ha aderito ai principi etici stabiliti per la ricerca sugli animali e alle linee guida ARRIVE, tra cui la stabulazione degli animali in gabbie standard (5 topi/gabbia, ciclo luce/buio di 12 ore, cibo/acqua ad libitum ) e la randomizzazione in gruppi

1. Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo

  1. Sopprimere topi maschi C57BL/6 di 5 settimane (n=5 per isolamento) mettendoli in una camera di CO2 con una portata del 30% del volume della camera al minuto per 5 minuti. Confermare la morte per lussazione cervicale.
  2. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%. Praticare un'incisione sulla linea mediana dal pube allo sterno usando le forbici sterili. Rimuovere femore e tibie in modo asettico. Metti le ossa in PBS sterile sul ghiaccio.
  3. Pulire le ossa dai tessuti molli con una garza sterile. Taglia entrambe le estremità delle ossa con forbici sterili. Sciacquare il midollo utilizzando un ago da 25 G con 10 ml di α-MEM freddo per topo. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm.
  4. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C. Pellet di risospensione in α-MEM contenente il 10% di FBS e 33,3 ng/mL M-CSF. Contare le cellule utilizzando un emocitometro con esclusione del blu di tripano. Piastra a 2 x 106 cellule/mL in matracci T75.
  5. Mantenere le colture a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2 con cambi di fluido ogni 48 ore.
  6. Raccogli 1x 106 celle. Lavare con PBS contenente il 2% di FBS. Incubare con anti-CD11b-FITC (1:100) e anti-F4/80-PE (1:100) per 30 minuti a 4 °C al buio. Analizzare mediante citometria a flusso utilizzando la seguente strategia di gating: in primo luogo, le cellule gate si basano sulla diffusione diretta (FSC) e sulla dispersione laterale (SSC) per escludere i detriti e selezionare le cellule vitali. In secondo luogo, le cellule CD11b-positive gate dalla popolazione cellulare vitale. In terzo luogo, dalle cellule CD11b-positive, le cellule F4/80-positive gate identificano i macrofagi CD11b+/F4/80+ doppi positivi. Imposta i cancelli in base ai controlli non colorati e ai controlli monocolore. Procedere solo se il >95% delle cellule è CD11b+/F4/80+.

2. Valutazione della citotossicità

  1. Semina di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) a 1 x 104 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti utilizzando 100 μL di terreno per pozzetto. Lasciare aderire le celle per 4 ore a 37 °C.
  2. Preparare LY900009 diluizioni in terreno completo: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Rimuovere il vecchio terreno. Aggiungere 100 μl di terreno di trattamento per pozzetto. Preparare triplicati per ogni concentrazione.
  3. Incubare per 24 ore, 48 ore o 96 ore. Rimuovere completamente il terreno di coltura. Aggiungere 100 μl di terreno fresco contenente il 10% di reagente CCK-8 (10 μl di CCK-8 in 90 μl di terreno). Incubare per esattamente 2 ore a 37 °C. Utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 450 nm con un riferimento a 650 nm.
  4. Calcola IC50 utilizzando GraphPad Prism. Software aperto, concentrazione di input (asse X) e percentuale di fattibilità (asse Y). Selezionare Analizza > Regressione non lineare > Dose-risposta > Inibizione > log(inibitore) rispetto alla risposta con pendenza variabile. Imposta vincoli: Bottom=0, Top=100. Registra IC50 con un intervallo di confidenza del 95%.

3. Differenziamento degli osteoclasti e colorazione TRAP

  1. Seme di macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) a 1 x 104 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Coltura notturna in α-MEM con il 10% di FBS e 33,3 ng/mL M-CSF.
  2. Sostituire il terreno con 100 μL di terreno di differenziazione: α-MEM contenente il 10% di FBS, 33,3 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL di RANKL e LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Prepara i quadrupli per ogni condizione.
  3. Sostituire il fluido ogni 48 ore con un nuovo mezzo di differenziazione. Continuare per 6 giorni. Monitorare quotidianamente utilizzando un microscopio invertito a 100x per la formazione di osteoclasti.
  4. Rimuovere tutto il fluido per aspirazione. Lavare una volta con 200 μL di PBS. Aggiungere 100 μl di paraformaldeide al 4% in PBS. Incubare per esattamente 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il fissativo. Lavare 3 volte con 200 μL di PBS.
  5. Preparare la soluzione colorante TRAP: miscelare 50 mL di tampone acetato di sodio 0,1 M (pH 5,0), 10 mL di tartrato di sodio 50 mM, 1 mL di naftolo AS-MX fosfato 5 mg/mL in dimetilformammide e 0,5 mL di sale Fast Red Violet LB 11 mg/mL. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Applicare 200 μl per pozzetto. Incubare a 37 °C per 30 minuti al buio. Arrestare la reazione lavando 3 volte con acqua distillata.
  6. Identificare gli osteoclasti come cellule TRAP-positive (viola/rosse) contenenti tre o più nuclei. Contare utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x. Fotografa cinque campi casuali per pozzo.
  7. Quantifica utilizzando ImageJ. Fare clic sull'immagine > Converti in 8 bit (Tipo di > immagine > 8 bit) > Imposta soglia (Regola > soglia > immagine) > Seleziona aree positive > TRAP Analizza particelle (Analizza > Analizza particelle: dimensione 100-Infinity μm2, circolarità 0-1,0) > Esporta i risultati in Excel 23.

4. Saggio funzionale di riassorbimento osseo

  1. Coltura di BMM in piastre a sei pozzetti (2 x 10,5 cellule/pozzetto) con M-CSF per 24 ore. Aggiungere RANKL (100 ng/mL) per indurre la formazione di pre-osteoclasti per 3 giorni.
  2. Raccogliere le cellule utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% per 5 minuti a 37 °C. Neutralizzare con mezzo completo. Conta le cellule vitali usando il blu di tripano.
  3. Seminare 1 x 104 pre-osteoclasti per pozzetto su piastre da 96 pozzetti rivestite di idrossiapatite. Lasciare fissare per 4 ore.
  4. Trattare con M-CSF (33,3 ng/mL), RANKL (100 ng/mL) e LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) per 4 giorni. Cambiare il fluido ogni 2 giorni.
  5. Rimuovere le cellule con candeggina al 10% per 10 minuti. Lavare 5 volte con acqua distillata. Asciugare completamente all'aria.
  6. Visualizzate i pozzi di riassorbimento utilizzando un lettore di immagini automatizzato con ingrandimento 4x. Cattura l'intera area del pozzo. Quantificare l'area riassorbita come percentuale dell'area totale utilizzando ImageJ.

5. Microscopia a immunofluorescenza

  1. Coltura di osteoclasti su vetrini coprioggetto in piastre a 24 pozzetti per 5-7 giorni come descritto nella fase 3.
  2. Fissare con paraformaldeide al 4% per 15 min. Permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,1% in PBS per 10 min. Bloccare con l'1% di BSA in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Incubare con rodamina-falloidina (1:200) in tampone bloccante per 45 minuti a temperatura ambiente al buio. Controcolorare i nuclei con DAPI (1 μg/mL) per 10 min.
  4. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini utilizzando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento. Esamina utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 200x. Misurare l'area dell'anello di actina utilizzando ImageJ.

6. Analisi quantitativa della PCR in tempo reale

  1. Estrarre l'RNA totale da 2 x 106 cellule utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA. Omogeneizzare mediante pipettaggio. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Aggiungere 200 μl di cloroformio. Agitare energicamente per 15 s. Incubare 3 min. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
  3. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere 500 μl di isopropanolo. Mescolare delicatamente. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 °C.
  4. Lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 75%. Asciugare all'aria per 10 min. Sciogliere in 30 μl di acqua priva di RNasi. Misurare la concentrazione utilizzando lo spettrofotometro (richiede un rapporto A260/A280 >1,8).
  5. Sintetizzare il cDNA utilizzando 1 μg di RNA con il kit di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
  6. Preparare le reazioni qPCR: 10 μL di Master Mix, 1 μL di cDNA, 0,5 μL di ciascun primer (10 μM), 8 μL di acqua. Esecuzione con sistema PCR in tempo reale: 95 °C per 10 minuti, quindi 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 60 s. Calcola l'espressione relativa utilizzando il metodo 2-ΔΔCt con GAPDH come gene di riferimento.

7. Analisi del Western blot

  1. Lisi le cellule in tampone RIPA contenente proteasi e inibitori della fosfatasi su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare a 14.000 x g per 15 min a 4 °C.
  2. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il dosaggio BCA secondo le istruzioni del produttore. Preparare campioni di proteine da 30 μg nel tampone di caricamento. Far bollire per 5 min.
  3. Caricare i campioni su gel SDS-PAGE al 10%. Far funzionare a 80 V per 30 minuti, quindi a 120 V per 90 minuti. Trasferimento su membrane PVDF a 100 V per 90 minuti in tampone di trasferimento a freddo.
  4. Bloccare le membrane con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris con Tween-20 allo 0,1% (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente con un leggero oscillamento.
  5. Incubare con gli anticorpi primari descritti nella Tabella dei materiali (1:1000) per una notte a 4 °C con un leggero oscillamento. Lavare 3 volte con TBST per 10 minuti ciascuno.
  6. Incubare con anticorpi secondari coniugati con HRP (1:5000) per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con TBST.
  7. Rilevare utilizzando il reagente ECL secondo le istruzioni del produttore. Cattura immagini utilizzando un sistema di imaging a infrarossi. Quantifica l'intensità della banda utilizzando ImageJ.

8. Modello di riassorbimento osseo indotto da LPS in vivo

  1. Calcola la dimensione del campione utilizzando G*Power 3.1 (dimensione dell'effetto=0.8, α=0.05, power=0.80, ottenendo n=5/gruppo). Assegna in modo casuale topi maschi C57BL/6 di 7-8 settimane ai gruppi utilizzando un generatore di numeri casuali. Ospita 5 topi per gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura 22 ± 2 °C, umidità 55% ± 10%, accesso ad libitum a cibo e acqua standard.
  2. Anestetizzare i topi utilizzando l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg). Confermare l'anestesia con il riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi.
  3. Preparare il controllo del veicolo: PBS contenente l'1% di DMSO. Preparare LY900009: Dose bassa (2,5 mg/kg) e dose alta (5 mg/kg) nel veicolo. Iniettare 100 μl per via sottocutanea sulla calvaria utilizzando un ago da 27 G al giorno per 14 giorni. Iniettare LPS (10 mg/kg) nei giorni 1 e 8.
  4. Monitora i topi 2 volte al giorno per segni di angoscia. Definire gli endpoint umani: perdita di peso >20%, incapacità di deambulare, postura curva, riduzione della toelettatura. Sopprimere immediatamente se vengono raggiunti i punti finali.
  5. Sopprimere il giorno 15 utilizzando un sovradosaggio di pentobarbital (100 mg/kg per via intraperitoneale). Raccogli le calvariae. Fissare in paraformaldeide al 4% per 48 ore a 4 °C.

9. Micro-TC e analisi istologica

  1. Scansione di calvariae fisse utilizzando uno scanner micro-CT con i seguenti parametri: 70 kV, 114 μA, filtro in alluminio da 0,5 mm, risoluzione 9 μm, rotazione di 180° con incrementi di 0,4°.
  2. Ricostruisci le immagini utilizzando il software NRecon. Analizza utilizzando il software CTAn. Definire la regione di interesse come un'area di 3 x 3 mm centrata sulla sutura sagittale. Calcola BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. Decalcificare i campioni in EDTA al 10% (pH 7,4) per 14 giorni con variazioni giornaliere. Completare il test di decalcificazione con il test dell'ossalato di calcio24.
  4. Processo per l'inclusione della paraffina: disidratare con alcool graduato, limpido in xilene, infiltrare con paraffina. Sezione a 4 μm di spessore utilizzando microtomo.
  5. Garantire l'accecamento: codificare tutti i campioni utilizzando numeri casuali a tre cifre. Chiedi a un collega di mantenere la chiave di codice. Eseguire tutte le analisi senza conoscere i gruppi di trattamento. Decodifica solo dopo il completamento della raccolta dei dati.
  6. Eseguire la colorazione H&E: deparaffinizzare, reidratare, colorare con ematossilina per 5 minuti, differenziare in alcol acido, colorare con eosina per 2 minuti, disidratare e montare.
  7. Eseguire la colorazione TRAP come al punto 3.5. Contare le cellule multinucleate TRAP-positive lungo la superficie ossea. Espresso come numero per mm di perimetro osseo.

10. Analisi statistica

  1. Calcola la dimensione del campione richiesta utilizzando G*Power 3.1: Dimensione dell'effetto di input f=0.8, α=0.05, power=0.80, numero di gruppi. Registra il minimo n per gruppo.
  2. Testare la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk in SPSS 28.0. Si consideri p > 0,05 come normalmente distribuito. Verifica l'omogeneità della varianza utilizzando il test di Levene. Considera p > 0,05 come varianze uguali.
  3. Applicare test appropriati in base alla distribuzione: per i dati normali con varianze uguali, utilizzare i test parametrici. Per i due gruppi, applicare il test t di Student non accoppiato. Per più gruppi, utilizzare l'ANOVA unidirezionale.
  4. Eseguire un'analisi post hoc: per un'ANOVA significativa (p<0,05), applicare il test di differenza onestamente significativo di Tukey per tutti i confronti a coppie.
  5. Utilizzare alternative non parametriche per dati non normali: applicare il test U di Mann-Whitney per due gruppi e Kruskal-Wallis con il post hoc di Dunn per più gruppi.
  6. Calcola le dimensioni dell'effetto: d di Cohen per i t-test, eta parziale al quadrato per ANOVA.
  7. Riporta i valori p esatti con tre cifre decimali e intervalli di confidenza del 95%. Presenta i dati normali come media ± deviazione standard, non normali come mediana (intervallo interquartile).
  8. Considera p < 0,05 statisticamente significativo. Applicare la correzione di Bonferroni quando vengono eseguiti più confronti.

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Risultati

Il successo dell'implementazione di questo protocollo ha rivelato che LY900009 esercitato potenti effetti inibitori sulla formazione e sulla funzione degli osteoclasti attraverso molteplici meccanismi interconnessi. La valutazione iniziale della citotossicità nei macrofagi derivati dal midollo osseo ha dimostrato un aumento della tossicità dipendente dal tempo, con valori IC50 calcolati di 4,44 μM, 3,66 μM e 2,93 μM rispettivamente a 24 ore, 48 ore e 96 ore (Figura 1A, B

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Discussione

La presente indagine fornisce prove convincenti che l'LY900009 rappresenta un promettente agente terapeutico per le malattie osteolitiche attraverso la sua potente e selettiva inibizione dell'osteoclastogenesi, in linea con il crescente interesse per gli inibitori della γ-secretasi per i disturbi ossei 14,20,21. I risultati dimostrano che questo inibitore della γ-secretasi sopprime efficacemente...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse. Nessun autore ha alcun rapporto finanziario con le entità commerciali menzionate in questo lavoro. Tutti gli autori hanno compilato i moduli di divulgazione ICMJE.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il personale dell'Ospedale Centrale Affiliato alla Shandong First Medical University e al Feicheng People's Hospital per il supporto tecnico e l'assistenza durante il corso di questo studio. Apprezziamo anche i contributi dei nostri colleghi di laboratorio per le loro preziose discussioni e assistenza con gli esperimenti sugli animali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre per colture cellulari a 24 pozzettiCorning3524Microscopia a immunofluorescenza
Piastre per colture cellulari a 6 pozzettiCorning3516Colture cellulari e western blot
70% EtanoloSigma-AldrichE7023Sterilizzazione e disinfezione
75% EtanoloSigma-AldrichE7148Tampone di lavaggio dell'RNA
Piastre per colture cellulari a 96 pozzettiCorning3596Colture cellulari e saggi
Filtro in alluminio (0,5 mm)BrukerN/AFiltro di scansione Micro-CT
Anticorpo anti-CD11b-FITCBioLeggenda101206Citometria a flusso - marcatore macrofagico
Anticorpo Notch1 anti-scissione (monoclonale di coniglio)Tecnologia di segnalazione cellulare4147SWestern blot - Segnalazione a tacca
Anticorpo anti-F4/80-PEBioLeggenda123108Citometria a flusso - marcatore macrofagico
Mezzo di montaggio anti-sbiadimentoLaboratori VectorH-1000Montaggio per microscopia a fluorescenza
Anticorpo anti-Hes1 (monoclonale di coniglio)Tecnologia di segnalazione cellulareAnni 11988Western blot - Obiettivo a valle con intaglio
Anticorpo anti-NFATc1 (monoclonale di topo)Santa Cruz BiotecnologiaSC-7294Western blot - regolatore master osteoclasti
Anticorpo anti-fosfo-akt (Ser473)Tecnologia di segnalazione cellulareAnni 4060Western blot - Segnalazione PI3K/Akt
Anticorpo anti-fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)Tecnologia di segnalazione cellulare4370SWestern blot - Segnalazione MAPK
Anti-fosfo-NF-κ Anticorpo B p65 (Ser536)Tecnologia di segnalazione cellulare3033SWestern blot - NF-κ Segnalazione B
Anticorpo anti-fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)Tecnologia di segnalazione cellulare4511SWestern blot - segnalazione p38 MAPK
Anticorpo anti-beta;-actina (monoclonale di topo)Tecnologia di segnalazione cellulareANNI 4970Controllo del carico del western blot
Lettore automatico di immaginiDispositivi molecolariImageXpress MicroQuantificazione del pozzo di riassorbimento
Kit per il dosaggio delle proteine BCAPierce/Thermo Fisher23225Determinazione della concentrazione proteica
Candeggina (ipoclorito di sodio al 10%)Sigma-Aldrich425044Rimozione delle cellule dalle piastre di riassorbimento
BSA (albumina sierica bovina)Sigma-AldrichCodice: A7906Tampone bloccante per immunofluorescenza
C57BL/6 topi (maschi, 5-8 settimane)Laboratori del fiume Charles27Isolamento in vitro di BMM e studi in vivo
Reagente per test dell'ossalato di calcioSigma-AldrichCodice: C0350Test di completamento della decalcificazione
Reagente CCK-8 (Cell Counting Kit-8)Dojindo Molecular TechnologiesCK04Valutazione della vitalità cellulare
Filtro cellulare (70 μ m)Falco BD352350Filtrazione delle cellule del midollo osseo
Centrifuga (refrigerata)Eppendorf5424RPreparazione di celle e campioni
CloroformioSigma-AldrichCodice: C2432Separazione della fase di estrazione dell'RNA
Camera CO2Euthanex CorpEX-075Eutanasia animale
Il software CTAnBrukerVersione 1.20Analisi di immagini micro-CT
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo)Sigma-AldrichD9542Controcolorazione nucleare
Dimetilformammide (DMF)Sigma-AldrichD4551Solvente colorante TRAP
DMSO (dimetilsolfossido)Sigma-AldrichD2650Predisposizione per il controllo del veicolo
Substrato di blotting occidentale ECLPierce/Thermo Fisher32106Rilevamento di proteine nel western blot
EDTA (10%, pH 7,4)Sigma-AldrichE6758Soluzione decalcificante
eosina ySigma-AldrichE4009H& E colorazione istologica
Sale veloce rosso viola LBSigma-AldrichF3381Cromogeno colorante TRAP
Siero fetale bovino (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Integratore per colture cellulari
Citometro a flussoBD BioscienzeFACSCaliburCaratterizzazione BMM
Microscopio a fluorescenzaOlimpoIX73Imaging in immunofluorescenza
Software G*PowerUniversità Heinrich HeineVersione 3.1Analisi statistica della potenza
Vetrini coprioggetti (22 & 22 mm)Fisher Scientifico12-541-BMicroscopia a immunofluorescenza
Prisma GraphPadGraphPad SoftwareVersione 9.0Calcolo e rappresentazione grafica dell'IC50
EmatossilinaSigma-AldrichH3136H& E colorazione istologica
EmocitometroHausser Scientific3200Conteggio delle cellule
Kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacitàBiosistemi Applicati4368814Sintesi di cDNA dall'RNA
IgG anti-topo coniugate HRPTecnologia di segnalazione cellulare7076SAnticorpo secondario Western blot
IgG anti-coniglio coniugate HRPTecnologia di segnalazione cellulare7074SAnticorpo secondario Western blot
Piastre a 96 pozzetti rivestite di idrossiapatiteCorning BioCoat354651Saggio funzionale di riassorbimento osseo
ImmagineJNIHVersione 1.53eAnalisi e quantificazione delle immagini
Incubatore (CO2)Thermo Fisher51033058Mantenimento di colture cellulari
Sistema di imaging a infrarossiBio-RadChemiDoc MPRilevamento di Western blot
Microscopio invertitoOlimpoCKX41Monitoraggio di colture cellulari, conteggio TRAP
IsopropanoloSigma-AldrichI9516Precipitazione dell'RNA
LPS (lipopolisaccaride da E. coli)Sigma-AldrichL4391Riassorbimento osseo infiammatorio in vivo
LY900009 (inibitore della γ-secretasi)Selleck Prodotti chimiciS7999Composto di prova - inibitore degli osteoclasti
M-CSF (fattore stimolante le colonie di macrofagi)R& Sistemi D416-ML-010Sopravvivenza dei macrofagi e differenziamento degli osteoclasti
Scanner per micro-CTBrukerSkyScan 1272Analisi della microarchitettura ossea
Lettore di micropiastreBioTekSinergia H1Misure di assorbanza (CCK-8)
MicrotomoLeicaCodice: RM2255Sezionamento istologico
Naftolo AS-MX fosfatoSigma-AldrichN5000Substrato di colorazione TRAP
Aghi (25G, 27G)BD305122, 305109Lavaggio del midollo osseo, iniezioni
Software NReconBrukerVersione 1.7Ricostruzione dell'immagine Micro-CT
ParaffinaSigma-AldrichP3683Inclusione tissutale
Paraformaldeide (4%)Sigma-AldrichP6148Fissazione cellulare e tissutale
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Gibco/Thermo Fisher14190-144Lavaggio delle celle e preparazione del tampone
Pentobarbital sodicoSigma-AldrichP3761Anestesia animale ed eutanasia
Cocktail di inibitori della fosfatasiRoche4906837001Conservazione della fosforilazione
PowerUp SYBR Mix Master VerdeBiosistemi ApplicatiCodice: A25742PCR quantitativa in tempo reale
Cocktail di inibitori della proteasiRoche11697498001Prevenzione della degradazione delle proteine
Membrana in PVDF (0,45 μ m)Bio-Rad1620177Trasferimento proteico Western blot
RANKL (attivatore del recettore di NF-κ B Ligando)R& Sistemi D462-TEC-010Induzione della differenziazione degli osteoclasti
Sistema PCR in tempo realeBiosistemi Applicati7500 VeloceAnalisi quantitativa dell'espressione genica
Rodamina-falloidinaInvitrogen/Thermo FisherR415Visualizzazione della f-actina
Tampone RIPATecnologia di segnalazione cellulare9806SEstrazione delle proteine
Acqua priva di RNasiAmbion/Thermo FisherAM9937Dissoluzione dell'RNA e PCR
Gel SDS-PAGE (10%)Bio-Rad4561036Separazione delle proteine Western blot
Latte scremato in polvereBio-Rad1706404Blocco del western blot
Tampone acetato di sodio (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichEpisodio 2889Tampone di colorazione TRAP
Tartrato di sodio (50 mM)Sigma-AldrichS4297Specificità della colorazione TRAP
SpettrofotometroThermo FisherNanoDrop 2000Misurazione della concentrazione di RNA/proteine
SPSSSocietà IBMVersione 28.0Analisi statistica
Siringhe (1 mL, 10 mL)BD309659, 309604Lavaggio del midollo osseo, iniezioni
Palloni per colture cellulari T75Corning430641Cultura primaria del BMM
TBST (soluzione salina tamponata con 0,1% Tween-20)Bio-Rad1706531Tampone di lavaggio Western blot
Buffer di trasferimentoBio-Rad1704270Trasferimento proteico Western blot
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Permeabilizzazione cellulare
Reagente TRIzolInvitrogen/Thermo Fisher15596026Estrazione dell'RNA totale
Blu di tripano (0.4%)Sigma-AldrichT8154Valutazione della vitalità cellulare
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco/Thermo Fisher25200-056Raccolta e distacco di cellule
Sistema di trasferimento Western blotBio-RadTrans-Blot TurboTrasferimento di proteine alla membrana
XileneSigma-AldrichX3750Processamento e pulizia dei tessuti
α-MEM (alfa minimo essenziale medio)Gibco/Thermo Fisher12561-056Terreno di coltura cellulare

Riferimenti

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