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Microlesione della giunzione tendine-osso causata da esercizio acuto ed esaustivo nei ratti: cambiamenti ultrastrutturali e meccanismo

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DOI:

10.3791/69184

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14 novembre 2025

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1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo studio mirava a esplorare i cambiamenti e i meccanismi ultrastrutturali alla giunzione tendine-osso dovuti all'esercizio acuto ed esaustivo. L'esercizio acuto ed esaustivo induce microlesioni alla giunzione tendine-osso, attivando transitoriamente lo stress ER e le sue vie di segnalazione apoptotiche mediate. Tuttavia, queste microlesioni e lo stress del pronto soccorso possono essere progressivamente ripristinati dopo l'esercizio.

Abstract

Le microlesioni indotte dall'esercizio fisico alla giunzione tendine-osso (entesi) possono portare a tendinopatia. Studiare i cambiamenti ultrastrutturali e i meccanismi all'interno dell'entesi dopo un esercizio acuto ed esaustivo può migliorare la nostra comprensione della tendinopatia e guidare i trattamenti clinici. In questo studio, trentasei ratti maschi di Sprague-Dawley sono stati assegnati in modo casuale a due gruppi: controllo ed esercizio fisico esaustivo. Il gruppo di esercizi esaustivo è stato ulteriormente suddiviso in cinque sottogruppi in base al tempo post-esercizio: 0 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore e 48 ore. La colorazione ematossilina-eosina e la microscopia elettronica sono state impiegate per esaminare i cambiamenti nella giunzione tendine calcaneare-osso. L'espressione delle proteine GRP78, CHOP e Caspasi-12 correlate allo stress del reticolo endoplasmatico (ERS) alla giunzione tendine-osso è stata quantificata utilizzando l'immunoistochimica (IHC). Dopo un esercizio acuto estenuante, le giunzioni tendinee-osso dei ratti sottoposti a esercizio esaustivo hanno mostrato significative alterazioni strutturali. I condrociti e le fibre di collagene hanno mostrato notevoli cambiamenti ultrastrutturali indicativi di ERS. I livelli di proteina ERS sono aumentati immediatamente dopo l'esercizio, raggiungendo un picco a 6 ore. Questi livelli di proteine hanno iniziato a diminuire a 12 ore dopo l'esercizio e sono tornati al basale entro 48 ore. In conclusione, l'esercizio acuto ed esaustivo induce micro-danni e stress del reticolo endoplasmatico alla giunzione tendine-osso nei ratti, ma non ne consegue alcun danno irreversibile. Il trattamento e la riparazione tempestivi di queste microlesioni possono prevenire danni eccessivi e lo sviluppo di tendinopatie.

Introduzione

La tendinopatia di Achille è una condizione clinica comune causata da frequenti lesioni da uso eccessivo della caviglia. Questo disturbo è caratterizzato da gonfiore, dolore e disfunzione dei tendini. È più diffuso negli individui più anziani e negli atleti, in particolare corridori e saltatori. La tendinopatia di Achille è classificata in tendinopatia non inserzionale e tendinopatia inserzionale. La tendinopatia non inserzionale colpisce il tendine da 2 a 6 cm sopra la sua inserzione ossea, mentre la tendinopatia inserzionale colpisce la giunzione tendine-osso1. Inoltre, la tendinopatia non inserzionale tende a verificarsi in persone in sovrappeso, anziane e meno attive, mentre la tendinopatia inserzionale tende a verificarsi in persone più attive1.

La giunzione tendine-osso, dove il tendine si inserisce nell'osso, comporta una transizione graduale dal tessuto tendineo al tessuto osseo, compresa la fibrocartilagine non calcificata e la fibrocartilagine calcificata2. Questo cambiamento fornisce una transizione da un tessuto tendineo morbido e flessibile a un osso duro. In termini ingegneristici, questa regione funge da punto di ancoraggio, trasmettendo la forza muscolare per facilitare il movimento articolare 3,4. Pertanto, questa regione è un sito di concentrazione di stress ed è comunemente soggetta a lesioni da uso eccessivo nello sport.

La ricerca clinica si è concentrata principalmente sulla tendinopatia non inserzionale, con minore attenzione alla tendinopatia inserzionale alla giunzione tendine-osso2. La ricerca indica che il carico eccessivo favorisce la disorganizzazione e la frammentazione del collagene, l'infiltrazione del tessuto adiposo e la neovascolarizzazione nel tendine. Porta anche a iperplasia dei fibrocondrociti, ossificazione endocondrale e speroni ossei in entrambe le regioni della fibrocartilagine non calcificata e calcificata5. Tuttavia, studi recenti suggeriscono che i modelli di contrazione muscolare possono svolgere un ruolo più significativo rispetto alla quantità di esercizio nella tendinopatia inserzionale 6,7. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere l'impatto di un uso eccessivo sulle giunzioni tendine-osso. Studi precedenti hanno esplorato gli effetti di un uso eccessivo, come saltare o correre a lungo termine, su queste giunzioni. Tuttavia, pochi hanno studiato l'impatto dell'esercizio fisico acuto ed esaustivo. Uno studio recente suggerisce che l'esercizio fisico acuto induce stress del reticolo endoplasmatico nei reni dei ratti, indicando una sovraregolazione delle proteine di segnalazione IL-6 e dello shock termico (HSP) e una diminuzione del complesso respiratorio mitocondrialemRNA 8. Non è stato riportato se tali cambiamenti si verifichino nelle giunzioni tendine-osso. Questo studio si concentra sulla giunzione tendine-osso (entesi) per chiarire i cambiamenti e i meccanismi sottostanti indotti dall'esercizio acuto ed esaustivo. I risultati mirano a contribuire allo sviluppo di strategie preventive per la tendinopatia inserzionale.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con gli standard etici per gli animali da esperimento stabiliti dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia dell'Istituto Superiore di Medicina Tradizionale Cinese del Sichuan (Approvazione n.: 2023DS01). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Disegno sperimentale e procedura

  1. Animali
    Trentasei ratti maschi CD-Sprague-Dawley di 12 settimane sono stati alloggiati e alimentati ad libitum per tutto il periodo sperimentale. L'ambiente è stato mantenuto ad una temperatura di 20-25 °C e ad un livello di umidità del 50%-60%, con un ciclo luce/buio di 12 ore.
  2. Progettazione di gruppi
    Dopo una settimana di alimentazione adattativa, i ratti sono stati assegnati in modo casuale a un gruppo di controllo (Con, n = 6) o a un gruppo di esercizi esaustivi (EE, n = 30). I ratti del gruppo EE sono stati sottoposti a un allenamento di adattamento correndo a una velocità di 10 m/min per 15 minuti su un tapis roulant in salita con un'inclinazione di 10 gradi per tre giorni. Dopo l'allenamento adattivo, il gruppo EE è stato ulteriormente diviso in cinque sottogruppi temporali: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h dopo un esercizio esaustivo.
  3. Procedura di intervento
    I ratti del gruppo di controllo non si sono esercitati, mentre quelli del gruppo EE si sono sottoposti a una corsa esaustiva su un tapis roulant in salita con un'inclinazione di 10 gradi (Figura 1A). Seguendo il protocollo di Bedford9, il carico di esercizio è stato suddiviso in tre livelli: Livello 1 a 10 m/min per 15 minuti, Livello 2 a 15 m/min per 15 minuti e Livello 3 a 20 m/min fino all'esaurimento (Figura 1B). L'esaurimento è stato determinato quando un ratto non poteva più correre ed è rimasto bloccato sulla pista tre volte in un periodo inferiore a 1 minutoe 10, nonostante le ripetute stimolazioni elettriche (150 V, 0,5 mA di corrente alternata) e sonore (70 dB) a bassa intensità.

I ratti sono stati sacrificati tramite un'eccessiva iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio al 3% (200 mg/kg) ai tempi specificati (0 ore, 6 ore, 12 ore, 24 ore e 48 ore dopo l'esercizio fisico esaustivo). La pelle e i tessuti sottocutanei del calcagno sono stati accuratamente sezionati e il tendine d'Achille è stato tagliato 2 cm sopra il calcagno con forbici oftalmiche. Il calcagno destro (compreso il tendine d'Achille annesso), è stato conservato in paraformaldeide al 4% per l'esame istopatologico e i test immunoistochimici. Inoltre, tre campioni casuali dal lato sinistro sono stati conservati in una soluzione di paraformaldeide al 2% e glutaraldeide al 2,5% per la microscopia elettronica per studiare i cambiamenti ultrastrutturali (Figura 1C).

2. Istologia della giunzione tendinea-osso

I campioni sono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 48 ore e decalcificati con EDTA al 15% per 4 settimane a temperatura ambiente (20-25 °C), con la soluzione cambiata quotidianamente. Il processo di decalcificazione si concludeva quando l'osso poteva essere facilmente perforato da un ago senza applicare alcuna forza. Dopo la decalcificazione, i campioni sono stati sottoposti a disidratazione attraverso un processo automatizzato che coinvolge una serie graduata di etanolo e xilene, seguito da tre lavaggi con PBS. I campioni sono stati incorporati in paraffina per via sagittale e sezionati a 5 μm. La colorazione con ematossilina-eosina è stata eseguita secondo le procedure standard e le immagini sono state acquisite con un sistema di microcamere trioculari digitali Panthera con ingrandimento del 20× e del 40×.

3. Scansione al microscopio elettronico

I campioni rimasti sono stati prefissati con paraformaldeide al 2% e glutaraldeide al 2,5% per 48 ore, quindi disidratati in una serie di soluzioni di acetone, infiltrati in un analizzatore di polimerizzazione epossidica e incorporati agittalmente. Le sezioni semisottili sono state colorate con blu di metilene per identificare la regione di giunzione tendine-osso. Le sezioni ultrasottili, spesse circa 60-90 nm, sono state tagliate utilizzando un coltello diamantato. Queste sezioni sono state colorate con acetato di uranile per 10-15 minuti, seguito da citrato di piombo per 1-2 minuti. Le sezioni sono state esaminate con un microscopio elettronico a trasmissione con ingrandimenti di 6000×,12000× e 25000×.

4. Dosaggio immunoistochimico

La giunzione tendine-osso è stata regolarmente decalcificata e sezionata come descritto in precedenza. Dopo l'incubazione con una soluzione tampone di recupero dell'antigene citrato per 10 minuti, i campioni sono stati trattati con 3% H2O2 per 10 minuti per bloccare l'attività endogena della perossidasi, seguiti da blocco con siero di capra normale per 20 minuti a 25 °C. Le sezioni sono state quindi incubate per una notte a 4 °C con anticorpi primari, tra cui GRP78 (1:100), CHOP (1:100) e Caspase-12 (1:100). Successivamente, i campioni sono stati incubati con anticorpi secondari per 2 ore a 25 °C. Lo sviluppo del colore è stato ottenuto utilizzando DAB per 8 minuti a 25 °C, ottenendo un segnale positivo marrone-giallo. I nuclei sono stati colorati nuovamente con ematossilina per 3 minuti. Il software Image-Pro Plus 6.0 è stato utilizzato per analizzare la densità media. Tre regioni di interesse della regione della giunzione tendone-osso (tendine, fibrocartilagine e fibrocartilagine mineralizzata) sono state selezionate per l'analisi ed è stato calcolato il valore medio.

5. Analisi statistica

GraphPad Prism 8 è stato utilizzato per analizzare i dati e generare grafici. Tutti i dati sono espressi come media ± deviazione standard. I confronti tra i diversi gruppi sono stati effettuati utilizzando l'ANOVA unidirezionale e il test della differenza meno significativa (LSD) è stato utilizzato per i confronti a coppie. Un valore P di < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Come mostrato nella Figura 2A, nel gruppo di controllo, i condrociti e i fibrociti di collagene nella giunzione tendine-osso sono disposti regolarmente e c'è una linea blu liscia tra la fibrocartilagine e la fibrocartilagine mineralizzata, nota come tidemark (frecce gialle). Nei gruppi di esercizi esaustivi, si sono verificati cambiamenti ultrastrutturali alla giunzione tendine-osso. I cambiamenti comportano un aumento dei co...

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Discussione

La giunzione tendine-osso, nota anche come entesi o siti di inserimento, consente l'inserimento dei tendini nell'osso ed è un sito di concentrazione di stress in cui legamenti e tendini si attaccano all'osso4. Come punto di ancoraggio, facilita il movimento della caviglia, trasmette la forza della contrazione muscolare del polpaccio ai legamenti e ai tendini del piede e partecipa al movimento della caviglia e del piede2. La giunzione tendon...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano esprimere la loro sincera gratitudine per il sostegno ricevuto dalla Natural Science Foundation (Grant No. 23ZRYB03), dal Research and Innovation Team Project (TD-2022-04), dal Clinical Medicine Science and Education Innovation Group e dal Sichuan College of Traditional Chinese Medicine, nonché dal progetto di ricerca 2025 (25MSZX329) finanziato dall'Amministrazione provinciale del Sichuan di medicina tradizionale cinese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione 2% di paraformaldeide-2,5% glutaraldeideMKBio, CinaMM1515, Scansione della microscopia elettronica
Anti-Caspasi12AnticorpoHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.HA500144Saggio immunoistochimico
Anticorpo Anti-CHOPHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ET1703-05Saggio immunoistochimico
Anticorpo anti-GRP78Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ER1706-50Saggio immunoistochimico
BiomicroscopyMotic Industrial Group Co., Ltd.CHINABA210DigitalBiomicroscopia per istologia della giunzione tendine-osso Analisi immunoistochimica
Ratti CD-Sprague-DawleyBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK2021-0007 CD
Soluzione di recupero dell'antigene tampone del citratoZSGB-Bio, CinaZLI-9065, Saggio immunoistochimico
DAB   ZSGB-Bio, CinaZLI-9018 Saggio immunoistochimico
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Colorazione ematossilina-eosina  
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Scansione della microscopia elettronica
Etanolo Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Colorazione ematossilina-eosina  
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.  GraphPad Prism 8 Analisi statistica
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Saggio immunoistochimico
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. USAImage-Pro Plus 6.0Saggio immunoistochimico
Paraformaldeide Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Colorazione ematossilina-eosina   Saggio immunoistochimico
PBSZSGB-Bio, CinaZLI-9062Scansione della microscopia elettronica
Microscopio elettronico a trasmissioneLABORATORIO DI OTTICA ELETTRONICA GIAPPONESE CO., LTDJEM-1400Flash, GiapponeScansione della microscopia elettronica
Tapis roulant per ratti e TopoBioMed Easy Technologies Co., Ltd  CINASA101Ho eseguito esercizi esaustivi sul tapis roulant
xileneSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Colorazione ematossilina-eosina  

Riferimenti

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