Shrinky-Dink Hanging Gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali

Sommario

Mostriamo un metodo semplice e rapido per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali.

Abstract

Corpi embrionali (EB) sono aggregati di cellule staminali embrionali. Il modo più comune di creare questi aggregati è il metodo goccia, un approccio laborioso di pipettaggio un numero arbitrario di celle in piastre. Le interazioni tra le cellule staminali costretti a stretta vicinanza l'uno dall'altro favorisce la generazione di EBS. Perché i media in ciascuno dei pozzi deve essere manualmente scambiati ogni giorno, questo approccio è manualmente intensiva.

Inoltre, poiché i parametri ambientali, tra cui cellula-cellula, cellula-interazioni tra fattori solubili, pH, ossigeno e la disponibilità possono essere le funzioni di taglia EB, popolazioni di cellule ottenute dalle tradizionali gocce può variare notevolmente, anche se colto in condizioni identiche. Recenti studi hanno infatti dimostrato che il numero iniziale di cellule che formano l'aggregato possono avere effetti significativi sulla differenziazione delle cellule staminali. Abbiamo sviluppato un metodo cultura semplice, rapida e scalabile per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali. Infine, queste cellule sono facilmente accessibili per ulteriori analisi e sperimentazione. Questo metodo è suscettibile di ogni laboratorio e non richiede apparecchiature dedicate. Dimostriamo questo metodo mediante la creazione di corpi embrionali utilizzando una linea cellulare rosso fluorescente mouse (129S6B6-F1).

Protocollo

1. Fare Shrinky-Mold Dink

1. Stampare il modello voluto sulla Shrinky-dink foglio utilizzando una stampante buona definizione.
2. Cuocere Shrinky-dink foglio a 163 ° C per circa 10 minuti, o fino a completo ristretto e aver acquisito una forma regolare.
3. Dopo Shrinky-dink stampo è raffreddato, immergere in un bagno di isopropanolo fino a quando l'intera superficie è a malapena coperto.
4. Attenzione, spray alcuni acetone sopra lo stampo e agitare il contenitore un paio di volte. Aggiungere più isopropanolo per lavare l'eccesso di acetone e ripetere l'operazione un paio di volte fino a quando Shrinky-muffa sembra pulito.
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Discussione

Abbiamo sviluppato un metodo cultura semplice, rapida e scalabile per caricare predefiniti numero di cellule nei pozzetti microfabbricazione (stampato da Shrinky-Dinks) e mantenerli per lo sviluppo del corpo embrionali. Infine, queste cellule sono facilmente accessibili per ulteriori analisi e sperimentazione. Questo metodo è suscettibile di ogni laboratorio e non richiede attrezzature dedicate perché abbiamo ovviare alla necessità di fotolitografia. Siamo in grado di variare la dimensione dei pozzetti così come la concentrazione di cellule.......

Materiali

Per i media Mesc (McCloskey laboratorio di protocollo): (per i media totale preparato: 50ml, 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM L-glutammina: 0,5 ml; 1ml NEAA: 0,5 ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul diluito BME:. 50ul; 100ul (Aggiungi 35ul di sterile BME filtrato a 5 ml di PBS e siringhe filtro sterilizzare Scartare dopo 2 settimane. Concentrazione finale della soluzione è 0,1 mM)