Articolo metodologico

FLEX: Protocollo di allenamento al volo per il moscerino della frutta Drosophila

DOI:

10.3791/69217

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14 ottobre 2025

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1Department of Comparative Biomedical Sciences, LSU School of Veterinary Medicine

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire esercizio di volo per il moscerino della frutta Drosophila. Risultati rappresentativi mostrano che l'allenamento con esercizi di volo si traduce in un aumento della capacità aerobica e della resistenza a una dieta ricca di grassi.

Abstract

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La Drosophila è recentemente diventata un modello popolare per lo studio dell'obesità e dei disturbi correlati. Sebbene sia relativamente facile indurre disturbi metabolici nella Drosophila utilizzando diete specifiche, la creazione di un modello di esercizio per le mosche è più impegnativa. I metodi esistenti, come la Power Tower e la Treadwheel, utilizzano fiale agitate o rotanti per indurre le mosche a salire, sfruttando la loro risposta negativa alla geotassasi. Tuttavia, l'arrampicata continua per lunghi periodi è innaturale per le mosche e può portare a lesioni e mortalità legate all'esercizio. Questo documento introduce un nuovo protocollo di esercizio che sfrutta la naturale capacità della mosca di volare, offrendo un approccio all'esercizio più naturale, fisiologico e privo di lesioni. Gli esperimenti dimostrano che un regime di esercizio di volo di 5 giorni aumenta la capacità bioenergetica della mosca e contrasta gli effetti avversi di una dieta occidentale (WD), migliorando il comportamento di arrampicata e riducendo la mortalità associata alla WD. Questo protocollo consente l'addestramento simultaneo di un gran numero di mosche per studiare l'interazione tra l'esercizio fisico e vari fattori, tra cui dieta, farmaci, invecchiamento e genetica. Insieme, questo metodo può integrare i metodi esistenti per studiare gli effetti dell'esercizio fisico sulla fisiologia e sul comportamento delle mosche.

Introduzione

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L'attività fisica e l'esercizio fisico sono al centro di un'intensa ricerca per i loro benefici immediati e a lungo termine per la salute1. Grazie al suo potente effetto sistemico sul metabolismo, l'esercizio fisico è sempre più utilizzato per prevenire e trattare i disturbi metabolici, cardiovascolari e neurologici 2,3,4. Nonostante la crescente evidenza dei numerosi benefici per la salute associati all'esercizio fisico regolare, gli esatti meccanismi molecolari alla base di tali benefici rimangonopoco compresi. Per comprendere questi meccanismi, l'uso di modelli animali innovativi e ad alto rendimento è essenziale. Mentre i modelli di roditori sono comunemente usati per studiare l'impatto dell'esercizio sulle malattie metaboliche, tali studi richiedono costi significativi, supervisione normativa e attrezzature specializzate 6,7.

Recentemente, Drosophila melanogaster è emersa come un nuovo modello per la ricerca sulla biologia dell'esercizio fisico (recensito 8,9,10). Dotato di un'ampia gamma di potenti strumenti genetici, di un ciclo di vita breve, di una progenie estesa e di requisiti di manutenzione economici, il moscerino della frutta rappresenta una risorsa preziosa per lo studio dei meccanismi genetici, epigenetici e transgenerazionali. Quando si modella l'esercizio nelle mosche, i metodi attuali si basano tipicamente sulla geotassis negativa, la reazione comportamentale per salire verso l'alto11,12.

Uno dei primi protocolli di esercizio automatizzati utilizzava uno speciale apparato di esercizio chiamato Power Tower11. La Power Tower utilizza un'unità motoria che solleva ripetutamente le fiale con gli animali e poi le fa cadere per indurre la risposta negativa della geotassi11. L'esercizio prolungato nella Power Tower si traduce in una riduzione significativa del declino della mobilità e delle prestazioni cardiache legato all'età13. Inoltre, il regime Power Tower può essere stressante per le mosche ed è stato segnalato che un'intensità di allenamento eccessiva causa lesioni o mortalità11.

Per affrontare questo problema, è stato sviluppato un altro paradigma di esercizio chiamato Treadwheel14. La Treadwheel sfrutta anche la risposta negativa della geotassi di Drosophila, ma invece di sollevare e far cadere le mosche come nella Power Tower, capovolge le fiale con gli animali. A differenza della Power Tower, questo metodo è più delicato sulle mosche e previene le lesioni e la mortalità legate all'eserciziofisico 9. Tuttavia, le mosche nella ruota del pedale potrebbero abituarsi al movimento rotatorio, il che potrebbe complicare l'interpretazione dei risultati12. Per risolvere questo problema, è stato aggiunto un monitor dell'attività locomotoria (LAM25H, Trikinetics) per misurare l'attività durante l'esercizio, quantificare l'attività della Drosophila e tenere conto dell'assuefazione. Successivamente, il nome del sistema è stato aggiornato in Rotational Exercise Quantification System (REQS)12.

È interessante notare che pochissimi studi hanno sfruttato le naturali capacità di volo della Drosophila per modellare l'esercizio. L'attenzione predominante della ricerca sul volo è stata sugli aspetti aerodinamici e biomeccanici del volo stazionario e delle manovre in aria 15,16,17,18. Diversi studi hanno approfondito i meccanismi fisiologici e cellulari legati al volo 19,20. In questi studi, la capacità di volo è stata valutata tramite il saggio di volo21,22, in cui le singole mosche sono state rilasciate in una scatola acrilica trasparente ed è stata osservata la loro capacità di mantenere un'elevazione e un volo costanti23.

In uno studio particolare, i ricercatori hanno esaminato gli effetti dell'esercizio di volo indotto posizionando le mosche in bottiglie attaccate a uno shaker a vortice. Lo shaker agitava delicatamente le bottiglie a intervalli casuali tra 5 minuti e 10 minuti, utilizzando un timer programmabile19. Questo studio ha riportato che il comportamento di volo indotto accelera la senescenza e la perdita di capacità antiossidante correlata all'età nei muscoli del volo19. Sulla base delle ricerche precedenti, il nostro laboratorio ha sviluppato un nuovo protocollo di esercizio chiamato FLEX (esercizio di volo) integrando un sistema automatizzato di geotassi negativa con mosche di alloggiamento in grandi contenitori24. Per l'addestramento FLEX, le mosche sono state collocate in ciotole per pesci a tamburo di plastica trasparente da 1 gallone legate a una piattaforma orizzontale collegata a un motore. Il motore era controllato da un timer, che avviava i giri del motore ogni 5 minuti. Ogni giro sollevava la piattaforma e poi la faceva cadere, innescando le mosche in volo. Il FLEX è stato eseguito quotidianamente per 7 ore per 5 giorni. Non sono stati osservati decessi o lesioni associate all'esercizio24. Inoltre, un regime FLEX di 5 giorni nei moscerini con la dieta occidentale (WD) ha notevolmente annullato gli effetti avversi della WD, migliorando la sopravvivenza, il comportamento di arrampicata e la respirazione mitocondriale24. Insieme, questo articolo presenta un nuovo paradigma di esercizio basato sull'attività di volo naturale che non causa lesioni. Si tratta di una procedura ad alto rendimento che consente di addestrare contemporaneamente un gran numero di mosche per studiare l'interazione tra esercizio fisico, dieta, farmaci, invecchiamento, ambiente e/o genetica. Il protocollo può essere utilizzato per integrare i metodi di esercizio esistenti per studiare gli effetti dell'attività fisica sulla fisiologia e sul comportamento delle mosche.

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Protocollo

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1. Configurazione e funzionamento della macchina per esercizi

  1. Costruisci una macchina presso l'officina meccanica dell'università. Utilizzare una base rettangolare in alluminio da 35 mm x 35 mm x 1,4 mm con un motore CA/CC e una piattaforma orizzontale in alluminio da 35 mm x 35 mm x 0,5 mm (Figura 1A).
  2. Per la conversione del moto rotatorio in movimento lineare, costruire una camma rotante rotante su misura di 15 cm di diametro montata sul motore (Figura 1B). Fissare un inseguitore con un rullo da 2 cm alla parte inferiore della piattaforma orizzontale in modo che la piattaforma venga sollevata dall'inseguitore e poi rimessa nella posizione originale una volta che il rullo inseguitore ha liberato la camma.
  3. Regolare la velocità del motore con un potenziometro rotante in modo tale che un periodo di rotazione completo sia lungo circa 5.360 ms.
    NOTA: Le specifiche esatte del motore, le dimensioni del cedente e del rullo, nonché la geometria della camma, non sono fondamentali. È accettabile qualsiasi configurazione motorizzata che sollevi e abbassi in modo affidabile la piattaforma per rimuovere le mosche e consenta all'utente il controllo della frequenza di caduta.
  4. Fissare le ciotole per pesci a tamburo in plastica trasparente da 1 gallone alla piattaforma con corde elastiche agganciate a occhielli a vite (Figura 1C).

2. Protocollo FLEX

  1. Tenere le mosche in un'incubatrice a 24 °C o in una stanza con il 60% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore.
  2. Raccogli mosche di pari età entro 3-4 giorni dalla schiusa. Dopo la raccolta, assegnare in modo casuale le mosche ai gruppi di esercizi e sedentari. Usa un numero uguale di mosche sia per l'esercizio che per i gruppi sedentari.
    NOTA: Le mosche possono essere alloggiate a densità comprese tra 30 e 400 per ciotola, in quanto ciò non interferisce con l'esercizio di volo. Tuttavia, i gruppi sperimentali e di controllo devono sempre essere abbinati per numero, sesso ed età per garantire la comparabilità.
  3. Fornire a mosche sedentarie e controllate 7 ml di formula alimentare. Fissare le fiale di cibo nelle ciotole con del nastro adesivo.
  4. Trasferire le mosche nelle ciotole utilizzando un'anestesia leggera e breve con CO2 un giorno prima di iniziare il regime di esercizio. Coprire le aperture delle ciotole con una rete fissata con elastici.
    NOTA: Le mosche devono essere anestetizzate brevemente sotto una leggera CO2 su un tampone. L'esposizione deve rimanere breve per evitare effetti comportamentali duraturi; pertanto, l'anestesia deve essere eseguita 1 giorno prima dell'esperimento di esercizio.
  5. Fissare le ciotole alla piattaforma con corde elastiche. Eseguire l'allenamento in una stanza con una temperatura di 24 °C e un'umidità dell'aria del 60%. Se l'umidità nella stanza non è controllata, fornire alle mosche l'accesso all'acqua mettendo fiale di cotone bagnato nelle ciotole dei pesci e fissando le fiale alla parete della ciotola con del nastro adesivo.
  6. Per gli esperimenti di controllo (esercizio fittizio), posizionare un numero uguale di mosche in una ciotola posizionata accanto alla macchina per esercizi ma non attaccata alla piattaforma.
  7. L'esercizio vola per 5 giorni consecutivi.
    1. Controllare il motore con due timer (Figura 1D). Il primo timer accende e spegne la macchina a un'ora specifica della giornata. Inizia l'esercizio alle 8 del mattino e termina alle 3 del pomeriggio.
    2. Utilizzare il secondo timer per avviare una serie di tre giri del motore, con ogni sequenza che si verifica ogni 5 minuti. Ogni giro solleverà la piattaforma e poi la farà cadere, innescando le mosche in volo.
    3. Una volta completato il trattamento fisico per un determinato giorno, rimetti le ciotole nelle loro incubatrici. Questo protocollo può essere facilmente modificato per adattarsi a un particolare esperimento.
      NOTA: Un'umidità inferiore al 60% può causare un aumento della mortalità. Un piccolo numero di mosche potrebbe non iniziare il volo dopo la prima caduta, ma in genere inizia a volare dopo la seconda o la terza caduta. Sebbene non sia possibile tracciare il volo in ogni individuo, la maggior parte delle mosche si impegna nel volo e si presume che tutte le mosche alla fine partecipino all'esercizio. Inoltre, il grande contenitore offre spazio per il volo volontario tra una goccia e l'altra.
  8. Al termine del regime FLEX, immobilizzare le mosche posizionando le ciotole nella cella frigorifera per 5 minuti. Quindi trasferire le mosche in nuove fiale per alimenti per ulteriori analisi delle caratteristiche fenotipiche o in provette da microcentrifuga per saggi molecolari e/o biochimici di interesse.
    NOTA: Esempi di ulteriori analisi includono saggi comportamentali e biochimici e/o espressione genica. I saggi che coinvolgono mosche viventi dovranno essere condotti prontamente in conformità con gli obiettivi specifici del saggio fenotipico. Il protocollo può essere messo in pausa con i campioni per la biochimica/biologia molecolare congelati e conservati in modo appropriato, a seconda delle valutazioni da eseguire. Un riassunto del protocollo è fornito nella Tabella 1.

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Risultati

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Il protocollo FLEX è stato precedentemente convalidato in un lavoro pubblicato dal nostro laboratorio. In uno studio pubblicato, abbiamo dimostrato che l'esercizio in volo mitiga gli effetti metabolici negativi di una dieta occidentale (WD)24. Questa dieta è stata realizzata sulla base della dieta standard Nutri-Fly Bloomington con le seguenti aggiunte del 15% di Nutiva Certified Organic USDA, non OGM, olio di palma rosso, 15% di saccarosio e 0,1 M di NaCl.

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Discussione

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Il protocollo FLEX fornisce un metodo nuovo e fisiologicamente rilevante per indurre l'esercizio aerobico in Drosophila melanogaster attraverso il volo. A differenza dei paradigmi tradizionali come la Power Tower e la TreadWheel, che si basano sulla geotassi negativa e sull'agitazione meccanica, FLEX sfrutta il comportamento di volo innato della mosca. Questo approccio riduce al minimo le lesioni indotte dall'esercizio e le risposte allo stress, rendendolo un modello più sicuro ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata dal NIDDK R01DK129455 (AKM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo di coltura in polipropilene da 17 x 100 mm 14 mL  VWR  60818-689
Bocce per pesci trasparenti
plastiche da 1 gallone  		PetcoN/ADisponibile da Petco
Protezione contro sovratensioni a 8 prese con timer digitale di 7 giorniBN-LINK EGPH020028Disponibile su Amazon
Motore AC/DC  Dayton Modello 12W368 con coppia 80 IN-LBS
Dieta Bloomington Formulation  Nutri-Fly  66-112Disponibile presso Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
Kim-wipesFisher Scientific06-666Kimberly-Clark Professionale 34120
Timer multifunzionale programmabile a presa con conto alla rovescia e ciclo infinito a breve cicloNEARPOW SPM10188153502Disponibile su Amazon

Riferimenti

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