Articolo metodologico

Studio comparativo delle modalità di acquisizione DDA e DIA sulla spettrometria di massa UPLC-Q-orbitrap utilizzando polvere di Huaihua

DOI:

10.3791/69227

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3 ottobre 2025

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacy, Shizuishan Maternal and Child Health Hospital, 3Department of Assets and Laboratory Management, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

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Questo studio confronta le modalità DDA e DIA (UPLC-QE-Orbitrap MS) per l'analisi della polvere di Huaihua, un complesso MTC. Sono stati sviluppati metodi DDA e DIA ottimizzati; i composti sono stati identificati tramite Compound Discoverer. Sono state valutate le prestazioni (identificazione dei composti, riproducibilità, qualità spettrale, sensibilità), fornendo una guida empirica per la selezione della modalità di scansione TCM.

Abstract

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Questo studio valuta sistematicamente le prestazioni comparative di due modalità di acquisizione della spettrometria di massa, l'acquisizione dipendente dai dati (DDA) e l'acquisizione indipendente dai dati (DIA), abbinate alla cromatografia liquida ad altissime prestazioni-quadrupolo-orbitrap ad alta risoluzione (UPLC-Q-Orbitrap HRMS) per la profilazione chimica completa di formulazioni complesse della medicina tradizionale cinese (MTC). La polvere di Huaihua, una prescrizione formulata classicamente, è stata impiegata come sistema modello per la valutazione empirica. I metodi di acquisizione DDA e DIA ottimizzati sono stati stabiliti separatamente: il metodo DDA incorporava una strategia mirata di selezione degli ioni precursori con parametri di frammentazione personalizzati, mentre il metodo DIA impiegava una strategia di finestra variabile segmentata per coprire l'intervallo m/z target, eseguendo una frammentazione imparziale su tutti gli ioni precursori. L'identificazione dei composti è stata eseguita utilizzando il software Compound Discoverer. La valutazione comparativa si è concentrata in particolare sulle caratteristiche prestazionali delle due modalità di acquisizione, comprendendo il numero di composti identificati, la riproducibilità, la qualità spettrale MS/MS e la sensibilità di rilevamento per i costituenti attivi a bassa abbondanza. I risultati hanno dimostrato che la modalità DDA ha prodotto un numero totale più elevato di composti rilevati, mentre la modalità DIA ha generato una percentuale maggiore di identificazioni ad alta confidenza (10,63 % con punteggi di corrispondenza spettrale >0,8). In particolare, l'approccio DIA ha mostrato una riproducibilità significativamente superiore nel tempo di ritenzione e nell'area di picco per sei composti rappresentativi, con la rutina che mostra una differenza di >3 volte nel tempo di ritenzione RSD tra le due modalità di acquisizione. Tuttavia, DDA ha prodotto spettri MS/MS più puliti con ioni frammento distinti, mentre gli spettri DIA hanno mostrato interferenze da ioni contaminanti. Allo stesso tempo, la DIA ha rilevato efficacemente costituenti attivi a bassa abbondanza i cui cromatogrammi ionici e frammenti MS/MS non potevano essere estratti in modalità DDA. Questo studio contribuisce con prove sperimentali critiche e set di dati analitici per informare la selezione delle modalità di acquisizione della spettrometria di massa ad alta risoluzione per la ricerca complessa sulla formulazione della MTC. I ricercatori successivi possono integrare i vantaggi complementari di entrambi gli approcci per raggiungere un duplice obiettivo nella caratterizzazione completa dei composti.

Introduzione

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Le formule della medicina tradizionale cinese (MTC) possiedono sistemi chimici complessi con variazioni significative nelle concentrazioni dei componenti, in particolare la presenza di numerosi principi attivi a bassa abbondanza, che pongono gravi sfide alle tecnologie analitiche. La polvere di Huaihua, una formula classica e rinomata della medicina tradizionale cinese, è composta da quattro erbe medicinali: Sophora japonica, foglie di Platycladus orientalis, spighe di Schizonepeta tenuifolia e scorza di Citrus aurantium. Questa formula contiene una vasta gamma di sostanze bioattive, tra cui flavonoidi, alcaloidi e oli volatili, con variazioni significative nelle loro concentrazioni. Serve come modello rappresentativo dei sistemi complessi1 per lo studio delle basi materiali delle formule della MTC. Una caratterizzazione accurata, completa e affidabile della sua composizione chimica è un prerequisito fondamentale per chiarire le basi farmacodinamiche del materiale e migliorare gli standard di controllo della qualità.

La spettrometria di massa ad alta risoluzione UPLC-QE-Orbitrap (UPLC-QE-Orbitrap MS) è emersa come piattaforma di base per l'analisi di componenti chimici in sistemi TCM complessi, grazie alla sua eccezionale risoluzione, sensibilità e precisione di massa. In termini di strategie di acquisizione dei dati, l'acquisizione dipendente dai dati (DDA) e l'acquisizione indipendente dai dati (DIA) sono due modalità principali 2,3,4 (Figura 1). La modalità DDA innesca selettivamente la frammentazione di ioni ad alta abbondanza in base a regole preimpostate (ad esempio, soglie di intensità degli ioni precursori, esclusione dinamica), producendo spettri MS/MS mirati di alta qualità che facilitano la delucidazione strutturale. Tuttavia, ha limitazioni 5,6,7,8 nel coprire gli ioni a bassa abbondanza. Al contrario, la modalità DIA esegue la frammentazione non discriminatoria di tutti gli ioni precursori all'interno di un intervallo specificato di rapporto massa-carica utilizzando finestre continue o variabili. In teoria, cattura tutti gli ioni rilevabili, migliorando significativamente l'ampiezza e la riproducibilità della rivelazione, particolarmente adatto per analisi globali non mirate, sebbene gli spettri misti MS/MS risultanti siano più complessi da interpretare 5,9.

Attualmente, mentre le tecniche DDA e DIA sono state applicate individualmente nell'analisi TCM, gli studi comparativi sistematici ed empirici sugli indicatori di prestazione principali, come l'ampiezza di identificazione (soprattutto per i componenti a bassa abbondanza), la qualità dello spettro MS/MS e la sensibilità di rilevamento, all'interno dello stesso complesso sistema di formule TCM (ad esempio, polvere di Huaihua) rimangono insufficienti. Chiarire gli scenari applicabili, i vantaggi e i limiti di queste due modalità in matrici TCM complesse è fondamentale per i ricercatori per ottimizzare la selezione della strategia sulla base di specifici obiettivi sperimentali10.

I parametri chiave e le limitazioni sono riassunti qui per guidare i lettori sull'applicabilità di questo protocollo. Il metodo è molto efficace per la profilazione di matrici erboristiche complesse, con parametri ottimizzati per un sistema contenente flavonoidi e alcaloidi. La finestra critica della variabile DIA è stata impostata a 30 m/z dopo i test empirici; Questo parametro deve essere regolato per campioni con diverse proprietà fisico-chimiche. Il metodo rileva in modo affidabile gli ioni a bassa abbondanza (area di picco ~105), ma richiede l'acquisizione in modalità di ionizzazione positiva e negativa separate per garantire la qualità dei dati. Una limitazione primaria è la dipendenza della DIA dalle librerie spettrali e dal software di deconvoluzione avanzato per identificazioni sicure, che influenza i requisiti delle risorse computazionali.

Di conseguenza, questo studio mira a condurre un confronto approfondito e sistematico delle prestazioni complete delle modalità di scansione DDA e DIA sulla piattaforma UPLC-QE-Orbitrap MS, utilizzando la formula classica Huaihua Powder come caso di studio. Verranno sviluppati metodi di scansione DDA e DIA ottimizzati su misura per l'analisi della polvere di Huaihua. L'elaborazione dei dati verrà eseguita utilizzando il software Compound Discoverer per valutare e confrontare le due modalità nelle seguenti dimensioni: (1) numero totale di composti identificati; (2) qualità degli spettri MS/MS acquisiti; (3) riproducibilità delle aree di picco e tempi di ritenzione di composti rappresentativi; e 4) sensibilità di rilevamento per componenti attivi a bassa abbondanza. Ci si aspetta che questa ricerca fornisca solide prove sperimentali e supporto dei dati per la selezione di modalità di scansione con spettrometria di massa ad alta risoluzione negli studi di sistemi TCM complessi, esplorando il potenziale per i vantaggi complementari di DDA e DIA per raggiungere un "equilibrio tra ampiezza e profondità" e far avanzare la modernizzazione della MTC.

Durante l'esperimento, per quanto riguarda l'impostazione dei parametri della finestra della variabile segmentata nella modalità di acquisizione DIA, si consiglia di impostarla a 30 m/z. Allo stesso tempo, l'effetto di raccolta degli ioni positivi e negativi separatamente è migliore.

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Protocollo

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I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della soluzione di prova Huaihua Powder

  1. In conformità con le norme di lavorazione del "Fiore di Sophora saltato in padella" nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese (Parte I), prelevare una quantità adeguata del materiale floreale originale di Sophora, rimuovere le impurità e i rami, setacciare la cenere e i detriti, metterli in una padella calda e saltare in padella a fuoco basso (100 °C) fino a quando non diventa giallo scuro. Sfornare e raffreddare.
  2. Preparare i prodotti trasformati delle foglie di Platycladus orientalis secondo le "Regole generali 0213 per la preparazione" nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese (Parte IV). Prendi una quantità adeguata delle foglie originali di Platycladus orientalis , rimuovi le impurità, mettile in una padella calda e soffriggi a fuoco basso (100 ºC) fino a quando non ingialliscono. Sfornare e raffreddare.
  3. Preparare i prodotti trasformati di Zhike secondo il metodo per "crusca saltata in padella Fructus Aurantii" nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese (Parte I). Prelevare una quantità adeguata di materia prima Zhike, rimuovere le impurità, riscaldare a 100 °C e cospargere una quantità adeguata di crusca di frumento in un rapporto di 1:10 (materiali ed eccipienti).
    1. Una volta che il fumo sale, aggiungi le fette di Zhike crude e soffriggi velocemente. Quando la superficie diventa gialla o giallo scuro, togliete, setacciate la crusca, raffreddate e mettete da parte.
  4. Preparare la polvere di Huaihua secondo la prescrizione del rapporto di peso 1:1:1:1 della Formulologia Medica Cinese (New Century 3rd Edition). Pesare accuratamente 1 g di ogni polvere di erbe (setacciata con un setaccio n. 5).
    1. Unire le polveri in un mortaio e mescolare secondo il "metodo di triturazione e miscelazione" per le polveri della medicina tradizionale cinese: macinare delicatamente e costantemente in una direzione per 10 minuti.
    2. Considerare la polvere miscelata uniformemente quando non si osservano striature, agglomerati o variazioni di colore visibili, ottenendo un aspetto omogeneo in tutta la miscela. Preparare il campione finale di polvere di Huaihua utilizzando questo metodo.
  5. Valutare l'uniformità della miscelazione utilizzando un protocollo di ispezione visiva standardizzato. Esaminare la miscela di polvere in condizioni di illuminazione costante su uno sfondo bianco.
    NOTA: Considerare la miscela omogenea solo se soddisfa tutti i seguenti criteri: colore uniforme dappertutto senza striature o chiazze visibili dei singoli componenti; consistenza consistente senza divergenze grossolane o fini; nessuna variazione evidente nella tonalità di colore quando campionato da più punti; e nessun grumo granulare aggregato rilevabile a un'attenta ispezione. Esegui questa valutazione da due analisti indipendenti per garantire la coerenza.
  6. Pesare accuratamente 0,1 g del campione di polvere di Huaihua ben miscelato. Trasferire il campione in un matraccio tarato da 10 mL. Aggiungere 8 ml di metanolo.
  7. Eseguire l'estrazione ad ultrasuoni per 60 minuti con una potenza di 500 W e una frequenza di 40 kHz. Raffreddare a temperatura ambiente. Aumentare il volume fino al segno con metanolo.
    1. Agitare bene per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/mL di estratto di polvere di Huaihua. Filtrare attraverso una membrana microporosa (PVDF) da 0,22 μm. Trasferire il filtrato in una fiala campione per il test.
      NOTA: Durante l'esperimento, il liquido di scarto organico e altri reagenti tossici e nocivi correlati sono stati classificati ed etichettati. E ogni 2 settimane, il personale dell'Ufficio di Gestione Patrimoniale e Sperimentale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu lo trasporta in un istituto qualificato per il riciclaggio e la lavorazione unificati.

2. Condizioni di rilevamento per UPLC-Q-Orbitrap HRMS

  1. Impostazioni dei parametri del sistema cromatografico
    1. Utilizzare una colonna C18 (3,0 mm × 100 mm, 2,6 μm). Mantenere la temperatura della colonna a 30 °C. Utilizzare la fase mobile A (0,1% di acido formico in acqua) e la fase mobile B (acetonitrile).
    2. Programmare la pendenza come segue: 0-10 min, 5%-20% B; 10-25 minuti, 20%-50% B; 25-40 min, 50%-95% B; 40-45 min, 95% B. Impostare la portata su 0,3 mL/min. Iniettare 5 μl del campione.
  2. Eseguire lo studio della spettrometria di massa con le seguenti impostazioni dei parametri.
    NOTA: Sorgente ionica: Ionizzazione Elettrospray Riscaldata (H-ESI); Modalità di scansione: in modalità di acquisizione DDA, acquisire contemporaneamente ioni positivi e negativi; in modalità di acquisizione DIA, acquisire separatamente ioni positivi e negativi; Parametri della sorgente ionica: Tensione di spruzzo +3,5 kV (ioni positivi)/-2,8 kV (ioni negativi); velocità del flusso d'aria della guaina 40 arb; velocità del flusso d'aria ausiliario 10 arb; velocità del gas di soffiaggio 1 arb; Temperatura del tubo di trasmissione ionica: 320 °C; Temperatura di evaporazione: 350 °C; Livello RF S-Lens: 55%.
    1. Costruzione e ottimizzazione del metodo di acquisizione dipendente dai dati (DDA)
      1. Per la scansione MS completa (Full MS), scegliere le seguenti impostazioni:
        NOTA: Risoluzione: 35.000; Campo di scansione: 100-1000 m/z; Bersaglio per il controllo automatico del guadagno (AGC): 3e6; Tempo massimo di iniezione (Max IT): 100 ms.
      2. Per Scansione MS/MS dipendente dai dati (dd-MS2), scegliere le seguenti impostazioni:
        1. Per la selezione degli ioni molecolari, mantenere la soglia di intensità di 5e4. Escludere gli ioni non caricati e i picchi isotopici (abilitare l'esclusione isotopica). Applicare l'esclusione dinamica con un tempo di esclusione di 15 s e una tolleranza di massa di ±10 ppm per evitare la selezione ripetuta di ioni ad alta intensità.
        2. Per le impostazioni di frammentazione, mantenere quanto segue: Finestra di isolamento: 1,0 m/z; Metodo di frammentazione: dissociazione da collisione ad alta energia (HCD); Energia di collisione normalizzata (NCE): 20, 40, 60 V; Risoluzione secondaria: 17.500; Obiettivo AGC: 1e5; IT massimo: 50 ms; Strategia TopN: selezionare i primi 3 ioni molecolari con la più alta intensità di frammentazione in ogni ciclo di scansione.
    2. Costruzione e ottimizzazione del Metodo DIA
      1. Per la scansione MS completa, utilizzare gli stessi parametri del metodo DDA.
      2. Per la scansione MS/MS indipendente dai dati (DIA-MS/MS), stabilire una strategia di finestra di isolamento delle variabili segmentate.
      3. Definire l'intervallo target come 100-1000 m/z. Dividi le finestre in base alla distribuzione dell'abbondanza ionica nell'intero intervallo m/z utilizzando spettri DDA di alta qualità in condizioni cromatografiche ottimizzate. Imposta finestre variabili per bilanciare l'abbondanza totale di ioni tra i segmenti, evitando saturazione o insufficienza.
      4. Ottimizza a 30 finestre per bilanciare la copertura e il tempo di ciclo.
        NOTA: Impostazioni di frammentazione - Metodo di frammentazione: HCD; NCE: 20, 40, 60 V; Deliberazione: 17.500; Obiettivo AGC: 1e6; Massima IT: Auto; Finestra variabile segmentata: 30 m/z.; Numero di loop: 30.
      5. Stabilire l'elenco di inclusione in base al peso molecolare centrale di ciascun segmento della finestra di isolamento, ad esempio m/z 115, 145, 175, 205 ... 925, 955, 985.
    3. Processo di acquisizione dati
      1. Equilibrazione del sistema: Equilibrare la colonna cromatografica con la fase mobile per almeno 5 minuti.
      2. Esecuzione del campione pre-esperimento: preparare la soluzione di test in polvere di Huaihua secondo la procedura di preparazione. Iniettare 5 campioni consecutivi. Valutare la stabilità del sistema (tempo di ritenzione RSD < 2 %, intensità totale della corrente ionica RSD < 5 %).
      3. Blank running: iniettare la soluzione di metanolo in bianco per la sottrazione di fondo.
      4. Campione di polvere di Huaihua in esecuzione: analizza ogni campione per iniezione in ordine casuale. Eseguire tutti i campioni in modo indipendente per ogni modalità di scansione (DDA, DIA).
    4. Elaborazione dati
      1. Identificazione dei composti
        1. Importa i dati grezzi acquisiti dalla spettrometria di massa nel software Compound Discoverer. Stabilire un flusso di lavoro di identificazione per i componenti sconosciuti. Esegui l'elaborazione dei picchi e l'allineamento dei picchi. Abbina gli spettri MS/MS misurati con il database MS/MS online mzCloud e il database MS/MS locale mzVault.
        2. Applicare i seguenti parametri di filtraggio: soglia dell'area di picco 105, deviazione di massa ± 5 ppm per ioni primari e secondari e punteggio di corrispondenza ≥80. Confronta gli ioni filtrati con le informazioni sui composti provenienti da database, standard di riferimento e letteratura pertinente per identificare i componenti chimici.
        3. Operazione specifica nel software Compound Discoverer: creare un nuovo processo di analisi e selezionare l'ID Prodotto Naturale/Prodotto Naturale Sconosciuto con il flusso di lavoro Stats Online e Local Database Searchers .
        4. Garantire l'inclusione del nodo Detect Compounds per l'identificazione e l'estrazione dei picchi. Aggiungere i database Cerca mzCloud e Cerca mzVault al flusso di lavoro.
        5. Aggiungere il file di dati grezzi e impostare i parametri di filtraggio (soglia dell'area di picco 105, deviazione di massa ± 5 ppm sia per gli ioni primari che per quelli secondari). Fare clic su Esegui per eseguire l'analisi.
      2. Analisi comparativa degli indicatori correlati
        1. Quantità di identificazione: confrontare il numero totale di composti identificati in modalità ionica positiva e negativa per entrambe le modalità DDA e DIA. Costruisci mappe di distribuzione ionica per ogni modalità.
        2. Studio di riproducibilità: confrontare le differenze nel tempo di ritenzione (RT) e nell'area di picco (AA) di composti rappresentativi con elevata abbondanza (rutina, quercitrina), media abbondanza (neoesperidina, naringina) e bassa abbondanza (psoralenolo, acido trimetilcolchicinico) tra le modalità DDA e DIA (n = 5).
        3. Qualità dello spettro MS/MS: Valutare la qualità degli spettri ionici dei frammenti MS/MS del pulegone, un composto chiave nel Q-Marker, in modalità DDA e DIA.
        4. Rilevamento di componenti a bassa abbondanza: confrontare il rilevamento di frammenti MS/MS di composti rappresentativi a bassa abbondanza (carvone, adenosina) in modalità DDA e DIA5.

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Risultati

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Identificazione globale dei composti

I cromatogrammi a corrente ionica totale della polvere di Huaihua nelle due modalità di acquisizione sono mostrati nella Figura 2, con differenze complessive minime. Nella modalità di acquisizione DDA, sono stati identificati un totale di 14.958 composti sia in modalità di ioni positivi che negativi, mentre 9.489 composti sono stati identificati ...

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Discussione

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In questo studio, vale la pena ricordare in particolare che abbiamo scoperto che nella modalità di acquisizione DIA, l'impostazione del valore della finestra della variabile segmentata non dovrebbe essere troppo grande. Abbiamo tentato di impostarlo a 300mz e 100mz, ma l'effetto spettrale finale era scarso. Dopo ripetute esplorazioni e tentativi, abbiamo finalmente scelto la finestra di acquisizione di 30mz come la più adatta. Pertanto, l'impostazione della finestra di acquisizione ha un...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dal Fondo per i giovani della Fondazione provinciale per le scienze naturali del Sichuan (n. 2025ZNSFSC1823); il progetto di piantina per l'innovazione scientifica e tecnologica della provincia del Sichuan (MZGC20230055); e il programma di promozione della ricerca sui talenti della disciplina "Xinglin Scholars" dell'Università di Chengdu per il progetto speciale (MPRC2022017) per i talenti dell'infanzia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetonitrileThermo Fisher/Purezza cromatografica
Software Compound Discoverer 3.3Thermo Fisher/Elaborazione dati di spettrometria di massa e identificazione dei composti
Fructus aurantiiSichuan Neijiang220709Le erbe nella prescrizione di Huaihua Powder
Foglie di Platycladus orientalisShandong Linyi240619Le erbe nella prescrizione di Huaihua Powder
Chiodo di schizonepetaJiangsu Taizhou240601Le erbe nella prescrizione di Huaihua Powder
Fiore di SophoraSichuan Guangan241017Le erbe nella prescrizione di Huaihua Powder
Macchina per pulizia ad ultrasuoniJietuo Ultrasonic Cleaning Equipment Co., LTD240HTEstrazione dei componenti della polvere di Huaihua
UPLC-Q-Orbitrap HRMSThermo Fisher/Spettrometro di massa ad alta risoluzione
AcquaAzienda Watson/Acqua ultrapura

Riferimenti

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