Articolo metodologico

Un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante e isolamento della lamina propria per la profilazione delle cellule immunitarie

DOI:

10.3791/69233

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19 settembre 2025

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo delinea un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante (NEC) e il successivo isolamento delle cellule immunitarie della lamina propria dall'intestino tenue murino neonatale.

Abstract

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L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una grave malattia infiammatoria dell'intestino neonatale, che colpisce principalmente i neonati pretermine. La NEC è caratterizzata da danno epiteliale, disbiosi microbica e una risposta immunitaria disregolata, che spesso provoca necrosi intestinale e infiammazione sistemica. I modelli murini sperimentali che ricapitolano gli aspetti chiave della malattia umana sono stati essenziali per far progredire la nostra comprensione dei meccanismi che guidano la malattia e informano lo sviluppo terapeutico. Questo protocollo descrive un modello murino neonatale ben consolidato di enterocolite necrotizzante (NEC) che utilizza l'alimentazione artificiale, l'ipossia intermittente, la somministrazione orale di lipopolisaccaride (LPS) e batteri enterici coltivati da un neonato con NEC. Questa combinazione induce in modo affidabile caratteristiche istologiche, trascrizionali e immunologiche coerenti con la NEC nei neonati umani ed è stata fondamentale in molteplici scoperte chiave nel campo. Inoltre, questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule immunitarie dalla lamina propria dell'intestino tenue di topi neonati. L'isolamento cellulare della lamina propria consente la profilazione dettagliata delle cellule immunitarie tramite citometria a flusso, facilitando l'analisi delle popolazioni cellulari innate e adattative all'interno dell'intestino.

Introduzione

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L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una grave malattia infiammatoria dell'intestino che colpisce quasi esclusivamente i neonati prematuri. Circa il 7%-8% dei neonati con peso alla nascita molto basso (<1500 g) sarà affetto da NEC e i tassi di mortalità associati alla malattia possono avvicinarsi al 50% nei neonati che richiedono un intervento chirurgico1. La patogenesi della NEC rimane non completamente compresa; tuttavia, le prove attuali suggeriscono che la NEC derivi dalla confluenza di molteplici fattori, tra cui una barriera intestinale immatura, una segnalazione immunitaria disregolata e un microbioma disbiotico 2,3,4. La convergenza di questi fattori può avviare ed esacerbare le risposte infiammatorie nell'intestino, in particolare attraverso l'attivazione del recettore toll-like 4 (TLR4), con conseguente danno epiteliale e vari tipi di morte cellulare, tra cui apoptosi e necrosi 5,6. Lo scopo di questo protocollo è quello di presentare un modello murino riproducibile e fisiologicamente rilevante di NEC che ricapitola l'infiammazione intestinale e la pneumatosi intestinale (gas all'interno della parete intestinale) osservate nei neonati umani, consentendo un'indagine meccanicistica sulla patogenesi della malattia. Inoltre, questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule immunitarie dalla lamina propria intestinale tenue di topi neonati, consentendo ai ricercatori di eseguire la profilazione delle cellule immunitarie tramite citometria a flusso.

Rispetto ai modelli animali più grandi, come i ratti neonatali o i suinetti 7,8, i modelli murini neonatali offrono diversi vantaggi distinti, tra cui un costo inferiore, un maggiore accesso agli animali transgenici e la possibilità di eseguire esperimenti su coorti più ampie. I modelli murini di NEC utilizzano principalmente una combinazione di alimentazione artificiale, stress da freddo e ipossia per simulare la complessa fisiopatologia della NEC osservata nei pazienti umani 7,8,9. Tuttavia, molti modelli murini di NEC sono limitati dalla loro dipendenza da ampi fattori di stress microbico o da alterazioni artificiali del microbiota, che possono compromettere la loro rilevanza clinica. Al contrario, il modello descritto in questo protocollo supera queste limitazioni integrando diversi fattori chiave implicati nella patogenesi della NEC nei neonati umani 10,11. In particolare, questo modello combina lo stress ipossico, che è stato implicato nell'interruzione dell'integrità della barriera intestinale 3,12, con la somministrazione orale di latte artificiale integrato con lipopolisaccaride (LPS), un ligando TLR4 ben caratterizzato che induce l'infiammazione intestinale, nonché un microbioma disbiotico clinicamente rilevante con batteri enterici coltivati da un paziente con NEC totalis, La forma più grave della malattia, caratterizzata da pan-necrosi intestinale10,13. Integrando questi fattori di stress clinicamente rilevanti e specifici per la malattia, il nostro modello riflette accuratamente le caratteristiche cliniche e molecolari della NEC. Inoltre, per fornire ai ricercatori un quadro di riferimento per interrogare i meccanismi immuno-mediati alla base della patogenesi della NEC, questo protocollo delinea l'isolamento delle cellule della lamina propria dall'intestino tenue murino neonatale per l'analisi della citometria a flusso. Come sito principale dell'attività immunitaria della mucosa intestinale, la lamina propria contiene un repertorio dinamico di cellule immunitarie residenti e infiltranti che svolgono un ruolo centrale nell'infiammazione associata a NEC14. La citometria a flusso fornisce una piattaforma robusta e scalabile per la caratterizzazione di queste popolazioni di cellule immunitarie ad alta risoluzione, consentendo un'analisi dettagliata dei fenotipi cellulari, la quantificazione delle risposte immunitarie e l'identificazione delle firme immunologiche implicate nella patogenesi NEC15.

Il modello di NEC murino delineato in questo protocollo integra i modelli in vitro consentendo lo studio delle interazioni ospite-microbioma, delle risposte immunitarie e della segnalazione infiammatoria all'interno del complesso ambiente dell'intestino neonatale. Riproduce aspetti chiave della patogenesi della NEC che non possono essere modellati in vitro, rendendolo uno strumento prezioso per chiarire i meccanismi della malattia e valutare le strategie terapeutiche. Sebbene le differenze specie-specifiche rimangano un limite, questo modello offre una piattaforma solida e accessibile per far progredire la nostra comprensione della NEC e accelerare lo sviluppo di interventi mirati.

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Protocollo

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Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida etiche fornite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord presso la Chapel Hill School of Medicine. I topi sono stati allevati, mantenuti e alloggiati secondo le procedure descritte nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio nell'ambito di una proposta di studio approvata dall'IACUC (protocollo n. 24-114) dell'Università della Carolina del Nord presso la Chapel Hill School of Medicine. I topi C57BL/6J sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti descritti in questo studio. I cuccioli sono stati avviati nel modello al 4° giorno postnatale, con un peso compreso tra 1,8 e 2,3 g; Sono stati esclusi gli animali al di fuori di questa fascia di peso. Le coorti sperimentali avevano una distribuzione equilibrata per sesso, con maschi e femmine che comprendevano ciascuno circa il 50% degli animali trattati. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Modello NEC murino

NOTA: Il ceppo batterico enterico viene prodotto ottenendo il contenuto enterico da un neonato che aveva la forma più grave di NEC, NEC totalis 13,16. I contenuti enterici vengono coltivati per una notte a 1 x g per 16 ore a 37 °C, centrifugati a 3000 x g per 10 minuti a 4 °C e risospesi in glicerolo al 50%. Aliquote da 20 μL vengono pipettate in crioviali e conservate a -80 °C per la conservazione a lungo termine. I tempi di coltura selezionati in questo protocollo sono stati scelti per l'efficienza del flusso di lavoro. Questi punti temporali possono essere regolati secondo necessità per adattarsi ai programmi dei singoli laboratori senza influire sul modello complessivo. Inoltre, questo protocollo è stato ottimizzato per una capacità massima di 40 mouse, ma può essere scalato in base alle esigenze.

  1. Preparazione della coltura batterica
    1. Il giorno 0 dell'esperimento alle 15:00, aggiungere un'aliquota di 20 μL di batteri enterici coltivati da un neonato con NEC totalis a una provetta di coltura da 15 mL contenente 2 mL di brodo Luria-Bertani (LB). Incubare la coltura batterica con il coperchio della provetta in posizione ventilata in un agitatore orbitale a 37 °C, 1 x g, per una notte per 16 ore, e incubare contemporaneamente una provetta di coltura contenente solo 2 mL di brodo LB come controllo per valutare eventuali contaminazioni da LB.
      1. Confermare visivamente la coltura notturna confrontando la torbidità tra la coltura batterica e il controllo chiaro, solo LB; Procedere solo se la coltura batterica appare torbida e il controllo rimane chiaro.
    2. Il giorno 1 dell'esperimento, alle 07:00, aliquotare 125 μL della coltura notturna inoculata in un pallone di coltura cellulare T75 con un coperchio ventilato contenente 25 mL di brodo LB. Preparare quattro matracci T75 in totale e incubarli in posizione verticale in un agitatore orbitale a 37°C, 1 x g, per 2 ore per espandere la coltura batterica.
      NOTA: Le colture notturne vengono preparate nei giorni sperimentali 0, 1 e 2 del modello NEC.
  2. Assegnazione dei cuccioli in gruppi sperimentali
    1. Il giorno sperimentale 1 alle 07:00, pesare i cuccioli del giorno 4 dopo la nascita.
      NOTA: L'intervallo di peso ottimale è compreso tra 1,8 e 2,3 g e i valori anomali devono essere rimossi dall'esperimento.
    2. Raggruppa i topi sperimentali in coorti alimentate con latte artificiale e coorti alimentate con madre e calcola il peso medio dei topi alimentati con latte artificiale. Separare i topi alimentati con latte artificiale dalla madre e metterli in una nuova gabbia alloggiata in un'incubatrice per neonati preriscaldata a 37 °C. Tenete i cuccioli nutriti con la madre nella gabbia originale con la madre.
      NOTA: I topi neonatali sono particolarmente sensibili alle variazioni della temperatura ambiente. Per mantenere una regolazione costante della temperatura dopo la separazione dalla madre, i cuccioli alimentati con latte artificiale vengono tenuti in un'incubatrice per neonati a temperatura controllata impostata a 37 °C. Questo approccio è coerente con i protocolli NEC stabiliti che preservano la temperatura fisiologica senza l'uso di ulteriori interventi termici 11,17,18,19.
    3. Ripetere i giorni 2 e 3 sperimentali, pesando i topi alimentati con formula e calcolando il peso medio prima del punto di alimentazione delle 07:00 ogni giorno.
  3. Misurazione della densità ottica (OD) della coltura batterica
    1. Dopo 2 ore di incubazione a 37 °C e 1 x g, rimuovere i quattro matracci T75 con coltura espansa dall'agitatore orbitale nei giorni sperimentali 1, 2 e 3. Unire il contenuto dei quattro matracci T75, mescolare bene e pipettare 1 mL di coltura batterica in una cuvetta.
      1. Preparare una soluzione in bianco aggiungendo 1 ml di brodo sterile LB a una cuvetta. Misurare la densità ottica della coltura batterica a 600 nm (OD600nm) con uno spettrofotometro.
        NOTA: Il diametro esterno targetdi 600 nm è compreso tra 0,6 ± 0,02. Se l'OD600nm della coltura batterica è inferiore al valore target, continuare l'incubazione come descritto al punto 1.3.1. fino al raggiungimento dell'obiettivo OD600nm di 0,6 ± 0,02. Se l'OD600nm è superiore a 0,6, diluire la coltura batterica con brodo LB sterile.
    2. Trasferire 80 mL di coltura batterica in due provette da centrifuga da 50 mL e centrifugare a 3000 x g per 10 min a 4 °C. Confermare l'esito positivo della coltura verificando la presenza di un pellet visibile sul fondo di ogni provetta.
  4. Preparazione della formula
    1. Inizia la preparazione del latte artificiale alle 09:00 nei giorni sperimentali 1, 2 e 3. Combinare 16 ml di latte artificiale per neonati e 8 ml di latte per cuccioli in un rapporto 2:1 in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml.
    2. Rimuovere il surnatante dalle due provette da centrifuga da 50 mL contenenti coltura batterica pellettata (passaggio 1.3.2).
    3. Risospendere accuratamente ciascuna delle due pastiglie in 2 mL della miscela di formula e trasferire la risospensione nella miscela di formula per ottenere 24 mL di formula NEC.
      NOTA: La concentrazione batterica finale nella formula NEC deve essere compresa tra 4 e 5 x 109 CFU/mL.
    4. Etichettare sei provette da centrifuga da 50 ml per ciascuno dei sei punti temporali di alimentazione (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Pipettare 4 mL della formula NEC in ciascuna provetta marcata.
    6. Preparare sei aliquote monouso di LPS (5 mg/mL) e conservare in microprovette a basso legame a -20°C. Aggiungere LPS (vedere la NOTA per la concentrazione) alla formula NEC immediatamente prima della somministrazione in ogni momento.
      NOTA: La quantità di LPS aggiunta alla formula NEC si basa sul peso corporeo medio dei cuccioli alimentati con latte artificiale calcolato alle 07:00 di ogni giorno, utilizzando un dosaggio di 5 μg di LPS per grammo di peso corporeo dei cuccioli. La concentrazione finale di LPS varia con il peso corporeo. Ad esempio, con un volume di alimentazione di 80 μL e un peso medio della coorte di cuccioli di 2 grammi, la concentrazione di LPS nella formula sarebbe di 0,125 mg/mL.
  5. Alimentazione
    NOTA: Il giorno 1 dell'esperimento, i topi da inserire nel modello NEC vengono digiunati per 3 ore dopo la separazione dalla loro madre. La prima alimentazione con formula NEC è alle 10:00 e continua ogni 3 ore fino alle 22:00. Nei giorni sperimentali 2 e 3, i topi vengono nutriti alle 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 e 22:00. I topi non vengono nutriti il giorno 4 sperimentale.
    1. Immediatamente prima di nutrire i topi, scongelare e agitare un'aliquota di LPS per 15 s. Aggiungere la quantità appropriata di LPS in base al peso medio dei topi alla provetta preparata da 4 mL di formula NEC (vedere il passaggio 1.4.6 per il calcolo) e mescolare accuratamente mediante pipettaggio.
    2. Riempire una siringa da 1 ml con la formula NEC e collegare una linea di catetere centrale neonatale inserito perifericamente (PICC). Assicurarsi che non vi siano bolle o aria nella siringa o nella linea PICC.
    3. Somministrare la formula NEC ai cuccioli tramite sonda orale con la linea PICC.
      1. Trattieni delicatamente ogni cucciolo per la pelle flaccida alla base del collo e tieni il topo in posizione verticale. Usando una pinza, guidare l'estremità distale della linea PICC nell'orofaringe e nell'esofago, posizionando la punta della linea PICC all'interno dello stomaco.
        NOTA: La distanza di inserimento della linea PICC è uguale alla distanza tra l'angolo della bocca e la parte superiore della macchia di latte nello stomaco. Il punto di inserimento ottimale deve quindi essere chiaramente contrassegnato sulla linea PICC utilizzando un pennarello indelebile.
      2. Se si avverte una resistenza significativa durante l'inserimento della linea PICC, rimuovere la linea PICC, riposizionarla e ritentare con cautela l'inserimento.
      3. Erogare lentamente 8 μl di formula NEC nello stomaco, monitorando attentamente il cucciolo durante la poppata per rilevare eventuali segni di aspirazione. Osservare la comparsa di una macchia bianca di latte per confermare il successo del parto gastrico.
      4. Rimuovere la linea PICC. Osserva il cucciolo per qualsiasi respiro affannoso o vomito. Se il cucciolo rigurgita la formula, tampona la bocca e il naso con una salvietta da laboratorio a basso contenuto di lanugine.
    4. Ripetere questo processo ad ogni momento di alimentazione.
    5. Due volte al giorno, sottoporre i cuccioli a ipossia per 10 minuti immediatamente dopo gli orari di alimentazione delle 13:00 e delle 19:00.
      1. Dopo due poppate al giorno, metti i cuccioli in una camera di ipossia collegata a un serbatoio di gas contenente il 95% di azoto e il 5% di ossigeno. Aprire la valvola del serbatoio e monitorare i livelli di ossigeno all'interno della camera di ipossia sigillata utilizzando un monitor portatile. Una volta che la camera dell'ipossia raggiunge il 5%± lo 0,5% di ossigeno, mantenere i cuccioli a questo livello di ossigeno per 10 minuti.
        NOTA: La portata deve essere ottimizzata per diminuire dal 20% al 5% di ossigeno a una velocità costante e controllata per un periodo di 2 minuti.
    6. Guarda i cuccioli di topo tra una poppata e l'altra per eventuali segni di difficoltà respiratoria, scolorimento pallido o apnea. Se questi segni sono presenti, rimuovere il cucciolo colpito dalla camera dell'ipossia, osservare attentamente il recupero e, se necessario, sopprimere i cuccioli in conformità con la politica IACUC.
    7. Continuare l'alimentazione orale con sonda gastrica e l'esposizione all'ipossia nei punti temporali programmati per l'intera durata di 72 ore del modello NEC.
      NOTA: Se il giorno 1 dell'esperimento inizia lunedì alle 10:00, l'endpoint di 72 ore si verificherà alle 10:00 di giovedì. Questo è designato come giorno 4 del modello. I topi non vengono nutriti alle 07:00 del giorno 4 del modello e vengono soppressi in questo ultimo punto delle 10:00 per la raccolta dei tessuti.
  6. Eutanasia degli animali e raccolta dei tessuti
    1. La mattina del giorno 4 del modello, pesare e registrare il sesso di ogni cucciolo, quindi eseguire l'eutanasia in conformità con le linee guida IACUC.
    2. Dopo l'eutanasia, raccogliere il sangue da ogni cucciolo in una provetta di separazione del siero contenente un attivatore di coaguli e un gel.
    3. Centrifugare a 16.000 x g per 20 minuti a 4 °C per separare il siero. Pipettare il siero in provette da 1,7 ml etichettate e conservare a -80 °C.
    4. Praticare un'incisione di 1-2 cm sulla linea mediana attraverso la parete addominale e il peritoneo per esporre il tratto gastrointestinale. Ispezionare l'intestino esposto per verificare la presenza di caratteristiche distintive della NEC, tra cui distensione, eritema, accumulo di gas all'interno della parete intestinale (pneumatosi intestinale) e bolle d'aria visibili.
    5. Identificare e resecare il duodeno attraverso il retto distale. Mettere il fazzoletto in una capsula di Petri con ghiaccio. Utilizzare soluzione salina con tampone con fosfato ghiacciato (PBS) per sciacquare l'intestino.
    6. Identificare il cieco e tagliarlo prossimalmente per separare il cieco e il colon dall'intestino tenue. Sezionare i pezzi partendo dall'ileo distale e procedendo verso il digiuno. Posizionare un pezzo di 1 cm in una provetta contenente tampone di lisi dell'RNA e perle di ossido di zirconio da 1,5 mm sul ghiaccio per l'analisi trascrizionale.
      1. Sciacquare un pezzo di 1,5 cm con una siringa contenente PBS attaccata a un ago smussato da 24 G, quindi inserirlo in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA). Congelare a scatto un pezzo di intestino di 1 cm e conservarlo a -80 °C per l'analisi delle proteine. Congelare a scatto un pezzo di intestino di 1 cm e conservarlo a -80 °C per eventuali test aggiuntivi.
    7. Processare il tessuto raccolto nel tampone di lisi dell'RNA in un battitore di microsfere (5,50 m/s, 1,0 min., ciclo = 1,0, pausa di pausa: 10 s, 4 °C) per omogeneizzare il tessuto, quindi conservare a -80 °C.
  7. Fissazione tissutale
    1. Posizionare i pezzi di tessuto raccolti in PFA al 4% su un bilanciere a 4 °C per fissarli per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il 4% di PFA da ciascuna provetta e sostituirla con 1 ml di PBS per lavare il fazzoletto. Rimettere i tubi sul bilanciere a 4 °C per 15 minuti. Ripetere il lavaggio PBS una volta.
      1. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 mL di etanolo al 50% a ciascuna provetta e rimettere le provette sul bilanciere a 4 °C per 15 minuti. Rimuovere l'etanolo al 50% e aggiungere 1 mL di etanolo al 70% e conservare a 4 °C fino a quando il tessuto non può essere trasformato in blocchi istologici di paraffina.
        NOTA: Se necessario, possono essere raccolti ulteriori segmenti intestinali o campioni di feci per ulteriori analisi.

2. Isolamento delle cellule immunitarie della lamina propria

NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per l'isolamento di cellule della lamina propria da topi neonatali a circa una settimana di età. Se sono necessari campioni di riferimento per la citometria a flusso spettrale, possono essere utilizzati i soggetti svezzati (3-4ª settimana postnatale). Per i campioni in fase di svezzamento, raddoppiare tutti i volumi di reagenti specificati nel protocollo.

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare 1x soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca2+ e Mg2+ (HBSS W/O) contenente acido 10mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato (HEPES) e conservare a temperatura ambiente.
    2. Preparare il tampone di smistamento cellulare attivato fluorescente (FACS) sciogliendo il 5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS + 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e conservare a 4 °C.
    3. Il giorno prima di eseguire l'isolamento delle cellule della lamina propria, preparare la soluzione di pre-digestione aggiungendo 5 mM di EDTA, 5% di siero fetale bovino (FBS) e 1 mM di ditiotreitolo (DTT) a HBSS W/O.
    4. Preparare la soluzione digestiva immediatamente prima di eseguire l'isolamento cellulare della lamina propria integrando il terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con il 10% di FBS e mg/mL di collagenasi IV.
      NOTA: HBSS W/O può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente. Il tampone FACS deve essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C. La predigestione e le soluzioni di digestione devono essere preparate fresche immediatamente prima di eseguire l'isolamento della lamina propria e conservate in ghiaccio.
  2. Raccolta e preparazione del tessuto intestinale per la digestione
    1. Individua il cieco e il transetto prossimalmente per rimuovere il cieco e il colon. Asportare 2-3 cm di intestino tenue distale (ileo) e metterlo su HBSS W/O ghiacciato in una capsula di Petri (riprendendo dal passaggio 1.6.5).
    2. Utilizzando un ago smussato da 24 G collegato a una siringa, sciacquare completamente il lume intestinale con HBSS W/O ghiacciato stabilizzando il tessuto con una pinza. Confermare visivamente che il lume intestinale è privo di feci dopo il lavaggio.
    3. Rimuovere con cautela il tessuto connettivo rimanente dal segmento intestinale utilizzando una pinza fine o una forbice.
    4. Tagliare l'intestino longitudinalmente per aprirlo, quindi sezionarlo trasversalmente in segmenti di 1-1 cm.
  3. Lamina propria dissociazione
    1. Trasferire i segmenti intestinali in una provetta da centrifuga da 1 mL contenente 1 mL di soluzione di pre-digestione raffreddata con ghiaccio.
    2. Incubare il campione a 37 °C per 20 minuti con rotazione continua per facilitare la dissociazione dei tessuti.
    3. Agitare delicatamente la provetta, quindi versare il contenuto attraverso un colino cellulare da 10 μm posizionato su una provetta da centrifuga da 5 mL.
      NOTA: Il filtrato raccolto attraverso il filtro da 10 μm contiene linfociti intraepiteliali (IEL) e può essere utilizzato per l'analisi a valle, se lo si desidera.
    4. Trasferire i frammenti di tessuto in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di soluzione digestiva preriscaldata a 37 °C. Successivamente, incubare il campione per 40 minuti a 37 °C con rotazione continua.
    5. Trasferire l'intero campione in una provetta automatizzata per la dissociazione tissutale ed eseguire il programma di dissociazione composto da quattro cicli di rotazione di 15 s ciascuno, alternati tra le direzioni oraria e antioraria.
      NOTA: Un'alternativa a un dissociatore tissutale automatizzato consiste nel macinare manualmente il tessuto intestinale utilizzando le punte smerigliate di due vetrini da microscopio. Se si utilizza questo metodo, applicare una pressione delicata e uniforme per evitare uno stress meccanico eccessivo, in quanto ciò può ridurre significativamente la vitalità cellulare.
    6. Agitare delicatamente la sospensione cellulare, quindi centrifugare i campioni nella provetta di dissociazione tissutale a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    7. Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet, quindi risospendere le cellule in mL di tampone FACS ghiacciato.
    8. Posizionare un filtro cellulare da 10 μm su una provetta da centrifuga da 5 mL. Trasferire la sospensione di celle risospese attraverso il filtro, quindi lavare il filtro con un ulteriore mL di tampone FACS ghiacciato.
    9. Contare le cellule e valutare la vitalità utilizzando il blu di tripano o un colorante di vitalità. Centrifugare il volume necessario per la citometria a flusso a 30 × g per 5 minuti a 4 °C. Utilizzare immediatamente le cellule per le applicazioni a valle per preservare la vitalità e l'espressione dei marcatori.

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Risultati

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Il modello murino neonatale di NEC descritto in questo protocollo replica le caratteristiche chiave della malattia. L'analisi della sopravvivenza di Kaplan-Meier (Figura 1A) ha rivelato una significativa riduzione della sopravvivenza nel gruppo di trattamento NEC rispetto ai controlli alimentati con diga (9/21 vs. 8/8; p = 0,0063). L'ispezione macroscopica dell'intestino dei topi sottoposti al modello (Figura 1B) ha dim...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo integra un modello murino neonatale fisiologicamente rilevante di NEC con l'isolamento delle cellule immunitarie della lamina propria, fornendo una piattaforma completa per studiare le risposte immunitarie della mucosa durante l'infiammazione intestinale. Combinando esposizioni clinicamente rilevanti, come il microbioma enterico da casi di NEC umano, lo stress ipossico e l'alimentazione artificiale, questo modello ricapitola la patogenesi complessa e multifattoriale oss...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione a questo manoscritto.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto è stato supportato da R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, dalla Chan Zuckerberg Initiative Grant numero 2022-316749, dallo Yang Biomedical Scholar Award e dal Dipartimento di Pediatria dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Syringe per alimentazione con formula
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubator for mice
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
ParaformaldehydeThermo ScientificJ

Riferimenti

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