Le ricostruzioni vascolari nei riceventi, tra cui la vena cava inferiore sopraepatica (SHIVC), la vena porta e la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC), sono le procedure chiave per il successo del trapianto di fegato ortotopico di topo. Forniamo qui tecniche di sutura e suggerimenti per la ricostruzione SHIVC e IHIVC nel modello di trapianto di fegato di topo.
Articolo metodologico
Tecniche di sutura per la ricostruzione vascolare nel trapianto di fegato ortotopico di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca traslazionale che utilizza modelli animali è essenziale per affrontare le questioni cliniche nei trapianti di organi. Sebbene il trapianto ortotopico di fegato (LT) di topo sia uno strumento utile per studiare i meccanismi della rigenerazione epatica, il danno da ischemia-riperfusione e le risposte immunitarie dopo LT, le sfide tecniche in questa procedura ne limitano la fattibilità. Gli aspetti chiave per il successo della LT ortotopica di topo sono la ricostruzione vascolare nei riceventi, tra cui la vena cava inferiore sopraepatica (SHIVC), la vena porta (PV) e la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC). Oltre alle difficoltà tecniche nella ricostruzione di questi vasi, la limitazione del tempo della fase anepatica entro i 20 minuti rende questa procedura più impegnativa. Sebbene la tecnica della cuffia possa essere utilizzata per la ricostruzione della PV, è necessaria una tecnica di sutura sicura e rapida per ricostruire la SHIVC durante la fase anepatica. Per la ricostruzione IHIVC, sebbene siano applicabili sia la tecnica della cuffia che quella della sutura, la tecnica della sutura porta a un tempo operatorio più breve nella chirurgia del donatore e nella preparazione del tavolo posteriore e può mantenere un lume vascolare più ampio rispetto alla tecnica della cuffia. Nel presente documento forniamo linee guida per la ricostruzione SHIVC e IHIVC utilizzando una tecnica di sutura per facilitare la LT ortotopica del topo.
Introduzione
Con i progressi delle tecniche chirurgiche, dei farmaci immunosoppressori e della medicina di terapia intensiva, il trapianto di organi si è affermato come terapia standard per le malattie d'organo allo stadio terminale. Il trapianto di fegato (LT) è attualmente l'unico trattamento curativo per la malattia epatica allo stadio terminale e alcune neoplasie epatiche. La ricerca traslazionale che utilizza modelli animali è essenziale per affrontare i problemi clinici nella LT. Poiché vari animali geneticamente modificati sono disponibili in modelli murini, la LT ortotopica murina è uno strumento importante per esplorare le intuizioni meccanicistiche sulla rigenerazione epatica, il danno da ischemia-riperfusione e le risposte immunitarie dopo LT1. Tuttavia, poiché le sfide tecniche in questa procedura ne limitano la fattibilità, i gruppi di ricerca che lavorano su questo modello sono limitatia 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La LT ortotopica di topo è stata descritta per la prima volta da Qian et al. nel 19912. La procedura chirurgica, sviluppata applicando tecniche LT ortotopiche nei ratti, comprende tre fasi: chirurgia del donatore, preparazione del trapianto di fegato sul retro e operazione del ricevente6. Le parti tecnicamente impegnative della LT di topo sono la ricostruzione biliare e vascolare nei riceventi, tra cui la vena cava inferiore sopraepatica (SHIVC), la vena porta (PV) e la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC). Oltre alle tecniche chirurgiche, la fase anepatica dal clampaggio al rilascio del flusso PV dovrebbe essere entro 20 minuti per il successo del LT ortotopico di topo 2,6,11. Inoltre, nella nostra esperienza, il tempo totale di riperfusione dal clampaggio PV al rilascio di IHIVC dovrebbe essere entro 30 minuti per ottenere una sopravvivenza a lungo termine nel topo LT. Ciò è coerente con il precedente rapporto per LT di ratto che descriveva il tempo preferibile di stato emodinamico sistemico instabile entro circa 30 minutie 12. Pertanto, le difficoltà tecniche e i limiti di tempo nel mouse LT rendono questa procedura più impegnativa.
Sebbene la tecnica della cuffia possa essere utilizzata per la ricostruzione PV, è necessaria una tecnica di sutura per ricostruire lo SHIVC durante la fase anepatica. Pertanto, una tecnica di sutura sicura e rapida è essenziale per l'anastomosi SHIVC. Sebbene sia la tecnica della cuffia che quella della sutura siano applicabili per la ricostruzione IHIVC, la maggior parte degli studi precedenti ha impiegato una tecnica della cuffia 5,6,7,11,13. Tuttavia, l'uso di una tecnica di cuffia nella ricostruzione IHIVC porta a un tempo operatorio più lungo nelle operazioni di donatore e back-table. Inoltre, l'inserimento di un bracciale può essere più difficile della sutura per i principianti a causa del breve margine della vena cava inferiore (IVC) ricevente13.
Nel presente documento forniamo le linee guida per una ricostruzione di successo di SHIVC e IHIVC utilizzando una tecnica di sutura in LT ortotopica di topo.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la sperimentazione animale dell'Università di Kyoto ed eseguiti in conformità con le linee guida per la protezione degli animali dell'Università di Kyoto. Gli interventi chirurgici sui topi sono stati eseguiti in anestesia generale utilizzando l'inalazione di isoflurano. Il vaporizzatore è stato impostato al 3% di isoflurano con 1 L/min di ossigeno per indurre l'anestesia. Dopo la laparotomia, l'isoflurano è stato ridotto all'1% per mantenere l'anestesia. Gli strumenti microchirurgici utilizzati in questo protocollo, compresi quelli utilizzati nel nostro protocollo di ricostruzione vascolare13 precedentemente pubblicato, sono elencati nella Tabella dei materiali. Era necessario un microscopio per eseguire l'LT13 ortotopico del topo. Un termoforo è stato utilizzato per mantenere la temperatura corporea del mouse13.
1. Animali
- Utilizzare un mouse del peso di 25-30 g.
NOTA: Sebbene possano essere utilizzati topi di peso compreso tra 20 e 35 g, i topi da circa 25 g sono adatti sia per i donatori che per i riceventi. Poiché l'età e la steatosi epatica influenzano gli esiti della LT, devono essere selezionati topi appropriati per ogni scopo degli esperimenti.
2. Dissezione dell'IHIVC nel fegato del donatore
- Isolare l'IHIVC dal tessuto circostante. Se necessario, sigillare le vene lombari con un elettrocauterizzatore.
- Rimuovere il grasso dall'IHIVC per esporre la parete del vaso.
- Sezionare l'IHIVC sopra l'arteria renale destra e la vena (Figura 1).
NOTA: Se si utilizza la tecnica di sutura per la ricostruzione IHIVC, la dissezione della vena renale destra nel sito donatore non è necessaria. La chirurgia del donatore di solito richiede meno di 30 minuti quando si applica la tecnica di sutura per la ricostruzione IHIVC.
3. Dissezione della SHIVC nel fegato del donatore
- Dopo la perfusione della soluzione di accumulo dal PV, tagliare le pareti anteriore e posteriore dello SHIVC (Figura 1).
NOTA: L'isolamento della parete posteriore SHIVC dal diaframma crus è fondamentale per ottenere un margine sufficiente per la ricostruzione.
4. Preparazione del tavolo posteriore dell'innesto di fegato
- Fissare un bracciale al PV, come descritto in precedenza13.
- Fissare un clamp clip all'IHIVC.
- Capovolgere il fegato ed esporre il moncone di SHIVC.
- Posizionare una sutura di stazionamento con nylon 10-0 su entrambi i bordi dello SHIVC e tenerli con morsetti bulldog.
NOTA: La preparazione del tavolo posteriore richiede circa 10 minuti senza un attacco del bracciale all'IHIVC.
5. Ricostruzione dello SHIVC nel ricevente
- Circonda lo SHIVC con seta 4-0 per ritrarre il fegato verso il basso.
- Ridurre la concentrazione di isoflurano allo 0,3-0,5% prima della fase anepatica.
- Bloccare l'IHIVC sopra la vena renale destra utilizzando una microserraffina.
- Bloccare il PV utilizzando una pinza Pean13.
- Bloccare lo SHIVC con il diaframma utilizzando un morsetto bulldog mentre si ritrae il fegato verso il basso.
- Tagliare la parete anteriore dello SHIVC, quindi tagliare la parete posteriore (Figura 1).
NOTA: L'isolamento della parete posteriore dello SHIVC dal diaframma crus nel ricevente e nei donatori è fondamentale per ottenere un margine sufficiente per la ricostruzione. - Dopo aver sezionato PV e IHIVC vicino al fegato del ricevente, rimuovere il fegato dal ricevente (Figura 1).
- Inserire l'innesto di fegato preparato nella cavità addominale del ricevente e posizionare il fegato in modo appropriato.
- Posizionare e legare una sutura di sostegno all'estremità destra dello SHIVC e tenerla con una pinza bulldog per tirare la sutura verso il lato ventrale del ricevente (Figura 2A).
NOTA: Il lato destro dello SHIVC si trova in profondità nella cavità addominale. Estrarre il lato destro dello SHIVC in modo che la parete posteriore sia posizionata davanti. - Posizionare e legare una sutura di sostegno all'estremità sinistra dello SHIVC.
- Iniziare la sutura continua con un metodo intraluminale sulla parete posteriore dello SHIVC dal lato sinistro (Figura 2A).
- Quando si raggiunge l'estremità destra della parete posteriore dello SHIVC, ruotare il tavolo operatorio di 90° in senso antiorario.
NOTA: Ruotare il tavolo operatorio di 90° in senso orario per i chirurghi mancini. In alternativa, i chirurghi possono suturare la parete anteriore dalla parte anteriore verso la parte posteriore senza rotazione. - Continuare la sutura con una sutura sovrapposta sulla parete anteriore dello SHIVC dal lato destro (Figura 2A).
NOTA: Sono necessari circa sei-otto punti di sutura per la parete posteriore e otto-dieci punti di sutura per la parete anteriore. La sutura all'estremità sinistra della parete anteriore è importante per prevenire il sanguinamento. - Dopo aver lavato l'aria nello SHIVC, legare la sutura continua con la sutura di permanenza sul lato sinistro dello SHIVC.
- Ruotare il tavolo operatorio di 90° in senso orario per ripristinare la posizione del ricevente nella posizione originale.
- Dopo la ricostruzione e la riperfusione del PV, sbloccare lo SHIVC.
NOTA: Ci vogliono 10-15 minuti per la ricostruzione SHIVC. Poiché il tempo di clampaggio PV può influenzare gli esiti LT, il tempo anepatico (dal clampaggio PV allo sbloccaggio PV) deve essere fissato per un massimo di 20 minuti in base all'abilità del chirurgo. Dopo la riperfusione fotovoltaica, l'isoflurano viene ripristinato all'1% per mantenere l'anestesia.
6. Ricostruzione dell'IHIVC nel ricevente
- Posizionare e legare le suture di stazionamento con nylon 10-0 su entrambe le estremità dell'IHIVC.
- Tenere le suture di stazionamento con le pinze per bulldog per tirare verso entrambi i lati, in modo che il moncone IHIVC diventi largo e dritto.
- Iniziare la sutura continua con un metodo intraluminale sul lato sinistro della parete posteriore (Figura 2B).
- Dopo aver raggiunto il lato destro, continuare a suturare più e più volte sulla parete anteriore dal lato destro del ricevente (Figura 2B).
NOTA: La rotazione del tavolo operatorio non è necessaria per la ricostruzione IHIVC. Sono sufficienti circa sei-otto punti di sutura per ciascuna parete posteriore e anteriore. - Sciacquare l'aria nell'IHIVC.
- Sganciare le clip IHIVC dal lato dell'innesto e quindi dal lato ricevente.
NOTA: La legatura della sutura continua con la sutura di permanenza sul lato sinistro dell'IHIVC non è necessaria. Ci vogliono 8-10 minuti per la ricostruzione IHIVC. Il tempo totale di riperfusione dal clampaggio PV al rilascio IHIVC dovrebbe essere entro 30 minuti.
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Risultati
Un ricevente di topo si è ripreso dall'anestesia entro 30 minuti quando è stata eseguita con successo la ricostruzione vascolare utilizzando un normale innesto epatico senza un tempo ischemico freddo prolungato. Una percentuale di successo del >90% può essere considerata qualificata per questa procedura. Abbiamo esaminato le curve di apprendimento in un chirurgo per i tassi di recupero post-LT (recupero dall'anestesia), il tempo anepatico (dal clampaggio al rilascio del flusso PV) e il tempo totale di riperfusione (da...
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Discussione
Questo articolo ha documentato le tecniche dettagliate per la ricostruzione di SHIVC e IHIVC con una tecnica di sutura in LT ortotopica di topo. La ricostruzione vascolare, in particolare l'anastomosi SHIVC, che richiede una tecnica di sutura durante la fase anepatica, è un'abilità cruciale per il successo della LT di topo. Oltre alla tecnica di sutura sicura e protetta, è necessaria una sutura rapida per mantenere la fase anepatica entro 20 minuti per ottenere risultati riproducibili ne...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Japan Society for the Promotion of Science (numero di sovvenzione: 24K19356).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10-0 Micro sutura | Società di strumenti chirurgici | T4A10N07 | |
| Catetere endovenoso da 16 G | TERUMO | SR-FF2032 | Bracciale IHIVC |
| Catetere endovenoso da 20 G | TERUMO | SR-FF1651 | Polsino PV |
| 8-0 treccia di seta | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 seta |
| Soluzione per celle frigorifere Belzer UW | Astellas | Liquido per la conservazione degli organi | |
| Morsetto Bulldog | B BRAUN | FB329R | Morsetto Bulldog |
| Morsetti Bulldog | Natsume Seisakusho | C-42-S-2 | Per il bloccaggio SHIVC |
| C57BL/6 mouse | Servizio Oriental Bio | ||
| Forcipe | Strumenti per la scienza | 11231-30 | |
| Soluzione per inalazione di isoflurano | Viatris | Anestetico | |
| Punte micro smussate 0,1 mm x 0,06 mm | Strumenti per la scienza | 11253-20 | Micropinze diritte |
| Micro forbici | Strumenti medici Muranaka | 451-609-13 | |
| Micro serrefine | Strumenti per la scienza | 18055-03 | Per il serraggio IHIVC |
| Micro serrefine | Strumenti per la scienza | 18055-04 | Per il bloccaggio FV |
| Applicatore a morsetto Micro Serrefine con blocco | Strumenti per la scienza | 18056-14 | Applicatore di clip per vasi |
| Micro Serrefines | Strumenti per la scienza | 18055-4 | Clip per vaso |
| Micro foeceps di sutura | Esculap | FD281R | |
| Applicatore a morsetto micro-serrefine | Strumenti per la scienza | 18056-14 | |
| Porta aghi | Esculap | FD231R | |
| N.11 Lame di ricambio | Rasoio di sicurezza FEATHER | 11 | Lame |
| Forbice oftalmica, manico rotondo | B BRAUN | FD103R | Microforbice |
| Contenitore in plastica di forma rettangolare | Daiso | 10 cm di lunghezza, 15 cm di larghezza e 6 cm di altezza | |
| Punte SuperGrip | Strumenti per la scienza | 00649-11 | Micropinze curve |
| SZX7 | Olimpo | SZX7 | Microscopio |
| Forbici Vannas | Strumenti di precisione mondiali | 501232 | |
| Clip vascolare | BEAR Medic Corporation | TKF-1-30 | Per il clampaggio IHIVC sull'innesto epatico |
Riferimenti
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Tian, Y., Rudiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Klein, I., Gassel, H. J., Thiede, A., Crispe, I. N., Steger, U. A microsurgical approach to hepatic and extrahepatic antigen presentation and its effects on the migration pattern of activated CD8(+) T cells. Microsurgery. 27 (4), 289-294 (2007).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Kojima, H., et al. T cell CEACAM1-TIM-3 crosstalk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248.e9 (2023).
- Tanaka, K., et al. Recipient toll-like receptor 4 determines the outcome of ischemia-reperfusion injury in steatotic liver transplantation in mice. Am J Transplant. 25 (6), 1168-1179 (2025).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Hori, T., et al. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World J Gastroenterol. 16 (25), 3120-3132 (2010).
- Tanaka, K., et al. Vascular reconstruction with the cuff technique in mouse orthotopic liver transplantation. J Vis Exp. (202), e66215(2023).
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