Articolo metodologico

Formulazione di dosi di traccianti di vitamina A da somministrare a soggetti umani tramite la tecnica di diluizione degli isotopi del retinolo

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DOI:

10.3791/69240

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31 marzo 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

In questo articolo

Sommario

La preparazione della vitamina A stabile marcata con isotopi, necessaria per la tecnica di diluizione degli isotopi del retinolo, deve conformarsi agli standard di sicurezza alimentare. Il protocollo mostra la preparazione del dosaggio in olio vegetale a concentrazioni adatte al sistema di somministrazione scelto e alla piattaforma analitica applicata.

Abstract

La tecnica di diluizione isotopica del retinolo (RID) si basa sull'amministrazione di traccianti di vitamina A marcati isotopicamente a soggetti umani. Qui presentiamo un metodo per guidare i team di ricerca su come preparare tracciatori isotopici stabili della vitamina A sia per studi di ricerca che per indagini di popolazione. L'articolo fornisce una panoramica della preparazione, dell'approvvigionamento dei materiali, delle attrezzature necessarie e delle procedure per garantire che i traccianti siano sicuri per il consumo umano. I traccianti isotopici stabili della vitamina A possono essere ottenuti commercialmente e solitamente marcati con deuterio [2H] o carbonio-13 [13C] con purezza isomerica > 95% e arricchimento isotopico >99%. La preparazione dei traccianti isotopici stabili della vitamina A consiste nel dissolvere il tracciante in olio vegetale commestibile tramite sonicazione e calore. I traccianti devono essere preparati a una concentrazione ben entro i limiti volumetrici del sistema di somministrazione. Infine, il tracciante viene allicitato in fiale di vetro ambrato sterili e le concentrazioni del tracciante vengono confermate spettrofotometricamente.

Introduzione

Per consentire un monitoraggio efficace dei programmi di intervento che mirano a ridurre la carenza di vitamina A, il metodo di diluizione isotopica del retinolo (RID) è stato applicato con successo per fornire informazioni sulle riserve totali di vitamina A corporea (TBS) in vari gruppidi popolazione 1,2,3,4. Sebbene i test di retinolosiero 5, proteina legame del retinolo sirico (RBP) 6,7,8 e risposta alla dose relativamodificata (MRDR) 9 siano spesso impiegati per confermare la carenza di vitamina A, il RID è l'unico metodo che quantifica accuratamente le riserve totali di vitamina A corporea su tutto lo spettro — dalla carenza subclinica allatossicità 3,10. Somministrando una dose nota di vitamina A marcata e misurandone la diluizione nel plasma dopo l'equilibrio, il metodo RID fornisce stime precise delle riserve di TBS e di vitamina Aepatica 11,12. È importante sottolineare che il metodo RID rimane affidabile anche nelle popolazioni con infiammazione, rendendolo indispensabile per valutare l'efficacia dell'intervento e per valutare i rischi di tossicità in programmi di integrazione e fortificazionesovrapposti 13,14.

Per eseguire il metodo RID, la vitamina A etichettata isotopicamente deve essere somministrata come dose orale di estere retinile, che nella maggior parte dei casi è acetato di retinile disciolto in olio vegetale commestibile. La maggior parte dei laboratori ottiene vitamina A marcata con isotopi da fornitoricommerciali 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Quasi tutti i traccianti isotopici della vitamina A disponibili in commercio sono etichettati con isotopi stabili di carbonio-13 [13C] o deuterio [2H] (Tabella 1). La scelta della dose isotopica applicata dipende dallo strumento analitico utilizzato per determinare la concentrazione sierica o plasmatica del retinolo marcato con massa. Mentre la cromatografia gassosa-spettrometria di massa (GC-MS) e la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) possono analizzare sia [13C] che [2H]22,23,24,25,26,27, la cromatografia gassografica-combustion-isotopi spettrometria di massa (GC-C-IRMS) può solo analizzare i traccianti di retinolo marcati [13C] 4,25,28. I limiti di rilevamento dello strumento analitico scelto, del gruppo target (bambini o adulti) e della durata dell'indagine determineranno la dimensione della dose daapplicare 3,25,29. Ad oggi, le dosi di isotopi applicate sono variate da 0,3 - 4,3 mg di retinolo equivalente (RE; equivalente a 1 - 15 μmol RE) nei bambini3, 4, 30 e da 0,6 a 10,0 mg di RE (equivalente a 2 - 35 μmol RE) negliadulti 2, 3,31, con studi più recenti che hanno applicato dosi più basse tra 0,3 e 0,6 mg di RE (1 - 3 μmol RE) per i bambini e 0,6 - 2,0 mg di RE (2 - 7 μmol RE) negli adulti. Sebbene fossero sollevati timori che un'alta massa di vitamina A nella dose potesse alterare la cinetica sottostante della vitamina A, un'analisi recente con modellazione compartimentale ha confermato che dosi isotopiche fino a 7 μmol RE per i bambini o 14 μmol RE per gli adulti non dovrebbero influire sull'accuratezza delle previsioniTBS 29. Qui dimostreremo come preparare un tracciante marcato con isotopi per l'applicazione orale nel metodo RIT, tenendo conto delle preoccupazioni sulla sicurezza alimentare e dell'ottenimento di concentrazioni di dose accurate. La preparazione della dose isotopica è fondamentale per il metodo RIM.

Protocollo

Lo Studio 1 è stato approvato dal National Research Ethics Service, North-East Sunderland Committee (REC 09/H0904/20) prima della registrazione presso la UK Clinical Research Network (UKCRN: 7413). Lo Studio 2 è stato approvato dal Research Ethics Board dell'Università delle Filippine, Manila (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), dall'Institutional Review Board dell'UC di Davis (IRB ID: 903681-2) e registrato presso ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Lo Studio 2 faceva parte del progetto GloVitAS finanziato dalla Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1115464: Valutazione del rischio di tossicità da vitamina A dovuto all'arricchimento alimentare su larga scala e ad altri interventi). Georg Lietz è stato il ricercatore principale del progetto GloVitAS e ha supervisionato l'implementazione dello studio sul campo. Una panoramica del protocollo di studio è fornita nella Figura 1.

1. Criteri di inclusione ed esclusione

  1. Per lo studio 1, i criteri forniti erano: Criteri di inclusione: includere volontari maschi e femmine sani con un'età compresa tra 18 e 45 anni. Criteri di esclusione: Escludere volontari con gravidanza, fumo, ipertensione, diabete, BMI >30, malattie epatiche/renali/gastrointestinali, disturbi metabolici lipidici e assunzione di multivitaminici (contenenti vitamine A, C, E) o integratori di β-carotene 3 mesi prima dell'inizio dello studio.
  2. Per lo studio 2, i criteri indicati erano: Criteri di inclusione: includere bambini di 12 a 18 mesi che sono rimasti nell'area di studio per tutta la durata dello studio. Criteri di esclusione: Escludere se i bambini non hanno ricevuto un'integrazione ad alto dosaggio di vitamina A e vivevano in aree non esposte a alimenti arricchiti con vitamina A nei mercati locali.

2. Determinazione della quantità totale di tracciante isotopico stabile per RID

  1. Decidi la quantità di tracciante isotopico stabile che ogni soggetto dovrebbe ricevere tenendo conto della purezza isomerica. Si raccomanda l'uso di isotopi stabili della vitamina A con purezza all-trans >95%, poiché l'attività biologica e le vie metaboliche differiscono significativamente tra gli isomeri geometrici. Calcola il livello di dose in base agli equivalenti del retinolo (RE). Un esempio di come questo calcolo viene fornito nella Tabella 2.
  2. Moltiplica il livello di dose per il numero totale di soggetti. Numero totale base di soggetti nei calcoli di potenza per la dimensione del campione richiesta, ma aumenta in base all'attrito previsto (vedi ad esempio la Tabella 2 ). Aumentare la quantità totale di tracciante necessaria tenendo conto delle perdite per pipetaggio fino al 20%.
    NOTA: Di norma, la preparazione isotopica deve includere un eccesso, poiché non è possibile recuperare tutto il materiale dalla fiala. Le perdite si verificano ulteriormente a causa della viscosità dell'olio che rimane all'esterno della punta della pipetta. Per ottenere volumi accurati della dose durante la somministrazione, è necessario rimuovere l'olio in eccesso sulla punta esterna della pipetta. Gli operatori possono minimizzare le perdite da pipetto se la punta della pipetta non viene immersa troppo in profondità nell'olio.

3. Determinare la quantità di olio vegetale necessaria per sciogliere il tracciante isotopico stabile

  1. Decidi quale olio vegetale usare e il volume della dose per soggetto (Tabella 2). Determina la quantità di olio aggiunto dal sistema di somministrazione utilizzato durante il dosaggio dei soggetti.
    NOTA: Usiamo olio di girasole per l'alto contenuto di vitamina E, che favorisce la stabilità della preparazione di vitaminaA 32,33. Tuttavia, altri oli vegetali sono stati utilizzati da altri gruppi per soddisfare le norme alimentari locali. Poiché il RID si basa sulla corretta somministrazione di tracce stabili marcati con isotopi, si raccomanda l'uso di una pipetta a spostamento positivo per l'applicazione del dosaggio preparata in olio commestibile. La maggior parte degli studi recenti ha utilizzato volumi fino a 250 μL, in particolare se la dose viene somministrata aibambini 1,7,23.
  2. Calcola la concentrazione di dose del tracciante isotopico stabile nell'olio vegetale [mg/mL]. Determina il volume totale di olio vegetale necessario. Calcola il peso dell'olio richiesto, basandosi sul volume calcolato e sulla densità relativa dell'olio vegetale (vedi Tabella 2 per un esempio).
    NOTA: Per accuratezza, si raccomanda di pesare l'olio per la preparazione stabile del tracciante isotopico. Una volta calcolato il volume totale di olio necessario, si può ordinare il tracciante stabile marcato con isotopi. È importante richiedere che il tracciante isotopico venga spedito in una bottiglia di volume sufficiente che consenta al team di ricerca di pesare direttamente l'olio vegetale nella bottiglia contenente il tracciatore etichettato con isotopici.

4. Preparazione di tracciante stabili marcati da isotopi in aree dedicate alla preparazione degli alimenti

  1. Apri con cura il coperchio della bottiglia ambrata contenente la quantità totale predeterminata del tracciante isotopico stabile e mettila su una bilancia analitica, che poi viene fissata a zero.
  2. Aggiungere l'olio a goccia fino a raggiungere il peso desiderato (con una precisione di ± 0,1 g) utilizzando una siringa sterile da 10 mL.
    NOTA: Poiché alcuni cristalli di acetato di retinil possono rimanere intrappolati all'interno del tappo della bottiglia ambrata, la bottiglia deve essere aperta con molta attenzione. Dopo aver aggiunto l'olio vegetale nella bottiglia ambrata, il tappo viene riposizionato con cura sulla bottiglia, che viene poi scosso a mano per risospendere eventuali cristalli di acetato di retinile rimasti all'interno del tappo.
  3. Inserire la bottiglia in un bagno d'acqua sonico con potenza ultrasonica: 14 W/L e frequenza di esercizio: 44 kHz. Riempi con acqua fino a superare il livello di olio nella bottiglia, ma sotto il livello del coperchio, per evitare che l'acqua entri accidentalmente nella preparazione.
  4. Sonica la bottiglia per 15 minuti prima di mescolare con cura a mano, seguita da una sonicazione per altri 15 minuti. Bisogna prestare attenzione che la temperatura del bagno d'acqua sonicante non superi i 50 °C.
    NOTA: Utilizzando olio di girasole per la preparazione, abbiamo riscontrato che l'isomerizzazione in retinoidi cis non avviene quando la dose è esposta a 50 °C per 30 minuti (vedi Figura 2). Tuttavia, i preparati dovrebbero essere analizzati da HPLC per valutare l'entità dell'isomerizzazione termica.
  5. Metti la bottiglia in un bagno-maria riscaldato a 50 °C per 30 minuti per sciogliere completamente i microcristalli.
  6. Preleva un campione di olio da 20 μL per verificare la presenza di microcristalli sotto un microscopio lucinico a ingrandimento 200x in laboratorio. Se sono presenti microcristalli, ripetere la procedura di sonicazione e riscaldamento.
  7. Una volta ottenuta la completa dissoluzione, si tratta di ridurre la preparazione totale dell'olio in fiale sterili di vetro ambrato da 2 - 4 mL. Utilizzare pipette a spostamento positivo per questa procedura per evitare contaminazioni incrociate.
    NOTA: Il volume di tracciante isotopico stabile aggiunto alle fiale di vetro ambrato può essere guidato dal tasso di reclutamento giornaliero, ad esempio, se vengono reclutati 5 soggetti al giorno e il volume di dose è di 150 μL, la fiala deve contenere un volume sufficiente per supportare 5 dosi più le perdite di pipettatura: 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Determinare la concentrazione isotopica stabile in triplice. Riservare 200 μL di olio vegetale puro (utilizzato per la preparazione di un blank spettrofotometrico) e 200 - 350 μL della dose isotopica stabile in fiale ambrate separate da 2 mL durante la preparazione del tracer marcato con isotopo stabile.
    1. Se la concentrazione di dose è ≤ 0,5 mg di RE, riservare 350 μL dell'isotopo stabile in una fiala ambrata separata da 2 mL. Per concentrazioni di dose > 0,5 mg di RE, riservare 200 μL della dose isotopica stabile in una fiala ambrata separata da 2 mL.
  9. Coprire le fiale con un gas inerte (Ar) per ritardare la potenziale ossidazione del tracciatore marcato con isotopi, chiudere ermeticamente e conservare in una criobox etichettata con concentrazione isotopica, volume di dose (determinata successivamente), data di preparazione e nome del progetto. Conserva la criocassetta in un congelatore alimentare a -20 °C fino alla spedizione. In queste condizioni, la dose di tracciante è stabile per almeno 2 anni.

5. Determinazione della concentrazione stabile di tracciatori isotopici in laboratorio

  1. Diluire il tracciante isotopico stabile in 3 fiaschette volumetriche con n-esano. Riempi le fiaschette volumetriche con n-esano fino a 1 cm sotto la linea di calibrazione prima di aggiungere la dose tracciante.
    1. Determinare la diluizione del tracciante isotopico stabile in base alla dose del tracciante. Se la dose del tracciante isotopico stabile è ≤ 0,5 mg di RE, diluire 100 μL della dose dell'isotopo stabile in una fiaschetta volumetrica da 50 mL con n-esano. Se la concentrazione di dose è compresa tra 0,5 e 2 mg di RE, allora 50 μL della dose isotopica stabile in una fiaschetta volumetrica da 50 mL con n-esano. Se la concentrazione di dose è >2 mg di RE, allora 50 μL della dose isotopica stabile in una fiaschetta volumetrica da 100 mL con n-esano.
    2. Erogare direttamente 50 o 100 μL di olio nell'esano e la fiaschetta realizzata con un volume di 50 o 100 mL con aggiunta di esano utilizzando una pipetta Pasteur in vetro. Inverti la fiaschetta 10 volte per mescolare l'olio con l'esano.
      ATTENZIONE: L'esano deve essere maneggiato in un armadietto fumi, indossando i DPI appropriati. L'esano di scarto viene raccolto in un contenitore dedicato per lo smaltimento specializzato da un appaltatore autorizzato.
  2. Preparare la fiaschetta spettrofotometrica a vuoto pipettando lo stesso volume di olio vegetale del tracciante isotopico stabile (50 o 100 μL) e distribuendolo in esano. Assicurarsi che la diluizione applicata (50 o 100 mL) sia la stessa del tracciatore isotopico stabile. Inverti la fiaschetta 10 volte per mescolare l'olio con l'esano.
    NOTA: Per pipettare sia tracciante isotopici stabili sia olio puro, si utilizza una pipetta a spostamento positivo da 100 μL. Per garantire che i volumi siano precisi a pipettare, è fondamentale che la punta venga pulita verso il basso usando carta priva di pelucchi per rimuovere residui di tracciante/olio dall'esterno della punta. Bisogna fare attenzione quando si pulisce la punta della pipetta sostitutiva diretta affinché la carta non entri in contatto con l'apertura della punta, poiché l'olio verrà prelevato dall'interno della punta.
  3. Misurare le concentrazioni stabili di tracciatori isotopici in una cuvetta di quarzo usando uno spettrofotometro impostato a una lunghezza d'onda di 325 nm, utilizzando l'olio vegetale nell'esano come blank spettrofotometrico (vedi Tabella 3 per un esempio).
    1. Inizia le misurazioni usando l'olio vegetale nell'esano come blank spettrofotometrico. Pulisci la cuvetta UV al quarzo tra una misura e l'altra, risciacquandola 3 volte con n-esano. Dopo che tutti i campioni sono stati misurati, pulisci attentamente la cuvetta usando n-esano puro.
  4. Determinare la concentrazione del tracciante isotopico stabile utilizzando le letture medie di AU e applicare il coefficiente molare specifico per isotopi utilizzando la legge di Beer-Lambert. Da questo, calcola il volume del tracciatore isotopico stabile preparato necessario per dose (vedi esempio nei risultati rappresentativi qui sotto e nella Tabella 3).

Risultati

Calcolo della dimensione totale della dose del tracciatore isotopico
Per uno studio su un campione di 100 soggetti, è stata calcolata la quantità totale di [13C10]acetato di retinile per identificare la quantità di [13C10]acetato di retinile da sintetizzare (Tabella 2). La quantità si basa sui calcoli di potenza per la dimensione richiesta dei campioni (n = 100), l'attrito atteso (n=15; 15% di attrito), le perdite per pipettamento (20%) e la concentrazione di acetato di retinile [13C10] per dose (0,4 mg RE; in base alla sensibilità dello spettrometro di massa applicato, alla durata dell'esperimento e al gruppo d'età dei soggetti). La quantità totale di RE necessaria (55,2 mg RE) viene poi convertita nel peso richiesto per [13C10] acetato di retinil (63 mg).

Per calcolare il volume di olio di girasole necessario per dissolvere [13C10]acetato di retinile alla concentrazione desiderata, abbiamo impostato inizialmente il volume di somministrazione della dose a 150 μL/dose (0,15 mL/dose). Successivamente, si calcola la concentrazione di [13C10]acetato di retinile in 1 mL di olio di girasole (Tabella 2). Dividendo il peso richiesto per [13C10]acetato di retinile (63 mg) per la dose richiesta si ottiene il volume totale di olio di girasole necessario. Infine, il peso dell'olio di girasole viene determinato utilizzando la densità relativa dell'olio di girasole.

La dose target precisa di [13C10]acetato di retinile nell'olio è stata confermata misurando le concentrazioni stabili dei tracciatori isotopici utilizzando uno spettrofotometro basato sulla legge di Beer-Lambert (Tabella 3). Considerando la diluizione del tracciante isotopico stabile durante la misurazione (fattore di diluizione di 500) si ottiene una concentrazione di 2,58 μmol/μL [13C10]acetato di retinile nell'olio. Il volume finale del tracciante isotopico stabile preparato necessario per una dose di 0,4 mg di RE è stato quindi determinato in 155 μL (Tabella 3).

Verifica della potenziale isomerizzazione della dose tracciante
La purezza isomerica della dose di tracciante ottenuta è stata determinata verificando la presenza di isomerizzazione cis tramite Cromatografia Liquida ad Alte Prestazioni (HPLC; Figura 2). Per fare ciò, un campione dalla soluzione tracciante diluita del passaggio 5.1.2 è stato essiccato sotto gas azotato e il residuo è stato ridisciolto in etanolo al 100% per l'iniezione. L'analisi HPLC di 3 campioni ripetuti è stata effettuata utilizzando il metodo di Liu et al.34 per verificare eventuali isomerizzazioni cis-isomerizzazioni (vedi Figura 2). La purezza della dose del tracciante dovrebbe essere monitorata durante tutto lo studio per assicurarsi che la dose non si degradi.

Effetto delle concentrazioni della dose tracciante su una frazione della dose nel tempo
L'applicazione di diversi livelli di dose porterà nel tempo a una frazione variabile della dose ingerita, il che potrebbe influire sulla capacità della piattaforma analitica di rilevare [13C10]retinolo in tutti i soggetti nei momenti temporali richiesti. L'applicazione di una dose di 1 mg o 0,4 mg di [13C10]acetato di retinile in olio in adulti (Figura 3A) o bambini (Figura 3B) ha indicato una frazione più alta della dose dopo la somministrazione di 1 mg rispetto a 0,4 mg di [13C10]acetato di retinile e ha confermato la capacità del LC-MS/MS applicato di rilevare [13C10Retinolo nei soggetti fino a 28 giorni dopo la dose. Ciò conferma che le informazioni sulla frazione di dose in diversi momenti temporali sono fondamentali per decidere se il livello di dose applicato sia sufficientemente alto da ottenere un segnale superiore al livello di rilevamento per la piattaforma analitica applicata, e che tali informazioni dovrebbero idealmente essere ottenute durante uno studio pilota con campioni rappresentativi.

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Figura 1: Diagramma di flusso per la preparazione delle dosi traccianti di vitamina A. Fasi chiave per eseguire la preparazione della dose isotopica stabile, tra cui la determinazione delle quantità necessarie, la concentrazione della dose tracciante ottenuta e la conferma della purezza della dose. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Cromagramma HPLC della dose tracciante per indagare l'isomerizzazione dell'acetato di retinile. La potenziale isomerizzazione di [13C10] acetato di retinile dopo (A) sonicazione e (B) riscaldamento a 50 °C per 30 minuti ciascuno è stata valutata utilizzando l'analisi HPLC della dose isotopica dopo ogni passaggio. L'analisi è stata effettuata su un HPLC con rilevamento di array di diodi utilizzando il metodo di Liu et al.34. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Media osservata della frazione plasmatica di retinolo della dose nel tempo dopo l'ingestione di [13C10] acetato di retinile. Frazione della dose da (A) 45 adulti britannicidi 16 anni e (B) 112 bambini filippini1 a cui è stata somministrata rispettivamente una dose di 1 mg o 0,4 mg [13C10]acetato di retinile. Frazione di dose = {plasma [13C]concentrazione di retinolo (μmol/L) X volume plasmatico stimato (L) / [13C]dose (μmol). I dati mostrati come media geometrica ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Isotopo stabileFornitore/Produttore
[D4]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[D6]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[D8]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C3]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C8]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C10]-acetato di retinileBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory

Tabella 1: Traccianti stabili di isotopi della vitamina A disponibili in commercio. Elenco dei traccianti di acetato di retinile etichettati con 13C e 2H di diversi fornitori.

Parametri
Dimensione del campione [n]:100
Attrito [n] (%):15 (15%)
Perdite per pipetto:20%
MW [13C10]acetato di retinile:338,5 μg/μmol
MW [13C10]retinolo:296,46 μg/μmol
Dimensione della dose:0,4 mg di RE di [13C10]acetato di retinile per volontario
Calcolo
Quantità totale di RE richiesta:= dimensione della dose in mg RE x dimensione del campione x attrito x perdite da pipetamento
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Quantità totale di [13C10]acetato di retinile necessaria:= mg RE x MW [13C10]acetato di retinile / MW [13C10]retinolo
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C10] acetato di retinile
Concentrazione dosificata di [13C10]acetato di retinile nell'olio:[13C10]acetato di retinile [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10]acetato di retinile / MW [13C10]retinolo) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Volume totale di olio di girasole richiesto:= Peso totale [13 C 10] acetato di retinile/concentrazione di dose nell'olio
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml olio
Peso di olio di girasole necessario:= Volume totale di olio di girasole x densità relativa di olio di girasole
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g di olio di girasole

Tabella 2: Esempio di calcoli della dimensione della dose dei traccianti di isotopi stabili. Indicazione dei parametri e calcoli per determinare la dose del tracciante e le quantità di olio vegetale.

Parametri
Coefficiente molare di estinzione (E1%1 cm) di [13C10]acetato di retinile in esano:52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Fattore di diluizione:500 (100μL di preparazione dell'olio in 50mL di esano)
Assorbenza media misurata:0.917
MW [13C10]retinolo:296,46 μg/μmol
Calcolo
Concentrazione (mol/L) di [13C10]acetato di retinile nell'esano:Concentrazione (mol/L) = Assorbimento / E1%1cm x Lunghezza della cuvetta (1cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Conversione della concentrazione in μmol/μL:Concentrazione (mol/L) = Concentrazione (μmol/μL)
1,739 x 10-5 mol/L equivale a 1,739 x 10-5 μmol/μL
Correzione per diluimento:1,739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8,697 x 10-3 μmol/μL nell'olio
Peso per μL (μg/μL):= [13C10]acetato di retinile μmol/μL in olio x MW [13C10]retinolo
= 8,697 x 10-3 μmol/μL x 296,45 μg/μmol = 2,58 μg/μL
Volume per dose:= Volume (μL/ 400 μg dose) = 400μg / 2,58 μg/μL = 155 μL

Tabella 3: Determinazione della concentrazione stabile di dosaggio tracciante degli isotopi. Parametri e calcoli necessari per determinare le concentrazioni di dosi traccianti e i volumi necessari per la dosazione orale.

Discussione

I traccianti isotopici stabili utilizzati negli studi umani sono generalmente considerati sicuri, senza effetti biologici o fisiologici avversi segnalati alle concentrazioniapplicate 25,35. Tuttavia, poiché il tracciante isotopico stabile deve essere somministrato per via orale, è essenziale che la dose del tracciante rispetti gli standard di sicurezza alimentare. Questo può essere ottenuto richiedendo ai fornitori e ai produttori di vitamina A marcata con isotopi stabili di effettuare test di sicurezza alimentare sugli isotopiforniti 7,20,24. Allo stesso modo, è imperativo che la preparazione e lo stoccaggio degli isotopi vengano effettuati solo in aree dedicate alla preparazione degli alimenti. Inoltre, tutte le attrezzature utilizzate per preparare isotopi stabili devono essere dedicate esclusivamente alla preparazione degli isotopi e conservate nelle aree destinate alla preparazione degli alimenti.

Gli isotopi marcati con acetato di retinile sono stati precedentemente sciolti usando etanolo, poi essiccati sotto gas azoto prima di essere dissolti in oliovegetale 36. Qui presentiamo un metodo che permette di dissolvere il tracciante marcato con isotopi in olio vegetale utilizzando una combinazione di sonicazione e calore. Sebbene questo metodo sia più facile da eseguire in un'area di preparazione alimentare, bisogna prestare attenzione quando si applica calore per dissolvere il tracciante nell'olio vegetale. L'all-trans-retinolo viene isomerizzato in 13-cis-retinolo durante il trattamento termico, che accelera con temperaturepiù elevate 37. L'isomerizzazione del retinolo aumenta ulteriormente con l'esposizione alla luce32. Inoltre, la stabilità del retinolo è influenzata dalla proprietà di ossidazione lipidica dell'oliovegetale 32,38. Poiché il contenuto di α-tocoferolo nell'olio vegetale ha un impatto positivo sulla ritenzione di vitaminaA 32, e l'olio di girasole ha uno dei conti più alti di α-tocoferolo33, abbiamo scelto di utilizzare l'olio di girasole nella preparazione delle dosi traccianti. La decisione di applicare un calore fino a 50°C per dissolvere il tracciante si basava sull'applicazione di calore per dissolvere i cristalli di retinolo nei prodotti cosmetici senza perdite significative39. Sebbene non abbiamo osservato una degradazione significativa dell'acetato di retinile secondo il protocollo descritto, è fondamentale verificare l'isomerizzazione cis della dose tracciante subito dopo il trattamento termico (Figura 2). Raccomandiamo inoltre che la stabilità della dose di tracciante venga monitorata durante tutto lo studio per confermare la concentrazione applicata di tracciante.

Il tracciante deve essere preparato a una concentrazione ben entro i limiti volumetrici del sistema di somministrazione utilizzato per somministrare la dose richiesta. Poiché il RID si basa sulla corretta somministrazione di tracce stabili marcati con isotopi, si raccomanda l'uso di una pipetta a spostamento positivo per l'applicazione del dosaggio. Sebbene in passato siano state applicate dosi fino a 1 mL suadulti 16, 20, 40, è più facile applicare volumi compresi tra 100 e 250 μL, poiché questi volumi hanno dimostrato di essere ben tollerati da neonati ebambini 1. In alternativa, le dosi possono essere somministrate anche incapsula 17, ma è essenziale selezionare capsule specificamente progettate per prevenire perdite di olio e garantire l'accettabilità all'interno della popolazione studiata. Infine, i livelli di dose applicata dipendono dal gruppo d'età della popolazionetarget 29, dalla capacità della piattaforma analitica applicata di rilevare bassi livelli3 e dalle riserve totali corporee della popolazione target, con una frazione plasmmatica inferiore della dose a stocchi corporei totali piùalti 1.

Come indicato nell'esempio sopra, [13C10]acetato di retinile a una concentrazione di 2,58 μg/μL nell'olio di girasole fornirà una dose di tracciante di 0,4 mg di RE in 155 μL di olio di girasole, che può essere somministrata con precisione utilizzando una pipetta a spostamento positivo da 250 μL. Per ottenere concentrazioni che rientrino nei limiti volumetrici del sistema di somministrazione, è fondamentale che l'olio vegetale scelto per solubilizzare il tracciante venga pesato accuratamente utilizzando una bilancia analitica (accurata fino a 0,1 g) nella bottiglia contenente il tracciante isotopico stabile. Ad esempio, se si prepara un totale di 63 mg [13C10] acetato di retinile a una concentrazione di 3,04 mg/mL nell'olio di girasole, e la densità specifica dell'olio di girasole è di 0,92 g/mL a 25 ◦C, allora è necessario pesare 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) di olio nella bottiglia contenente il tracciante. Sebbene la concentrazione finale del tracciante isotopico stabile venga confermata tramite una lettura di uno spettrofotometro, una pesatura accurata del tracciante isotopico e dell'olio applicato garantirà che le concentrazioni ottenute siano vicine al volume di somministrazione scelto per ogni dose.

È consigliabile aliquotare le preparazioni di olio in base al fabbisogno giornaliero previsto per assicurarsi che tutte le dosi presenti in una fiala vengano utilizzate entro 2 settimane dall'apertura della fiala. È meglio conservare le preparazioni dell'olio su impacche di ghiaccio nel campo durante l'uso e ricongelarle il prima possibile dopo il dosaggio. Sebbene le preparazioni in olio non siano influenzate dai ripetuti cicli di congelamento e scongelamento, devono sempre essere protette dalla luce e congelate quando non vengono utilizzate.

In sintesi, questo protocollo dettaglia la preparazione precisa e il controllo di qualità delle dosi traccianti per il metodo RID, garantendo dosaggi accurati, stabilità e sicurezza. Il metodo calcola i requisiti dei tracciatori, ottimizza la solubilizzazione nell'olio vegetale e verifica purezza e concentrazione utilizzando spettrofotometria e HPLC. Linee guida rigorose per la manipolazione e lo stoccaggio garantiscono un'integrità affidabile del tracciante per valutazioni accurate basate sugli isotopi.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Il supporto a questo lavoro è stato fornito dalla Bill & Melinda Gates Foundation (Numero di progetto: OPP1115464) e dall'Agenzia Internazionale per l'Energia Atomica (AIEA) a Vienna (Numero di progetto E4.30.30).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiale di vetro ambrato da 2 ml per l'allicitazione delle dosiFisher11573690A seconda della dimensione del campione dello studio e del numero di volontari che vengono somministrati quotidianamente, potrebbe essere più efficiente utilizzare fiale ambrate più grandi, ad esempio da 4 ml,
Fiaschette volumetriche da 100mlFisher11323644Fiaschetta volumetrica certificata Pyrex Borosilicato di Classe A
Fiaschette volumetriche da 50 mlFisher11313644Fiaschetta volumetrica certificata Pyrex Borosilicato di Classe A
Bilance analitiche  Fisher13592970
Pistoni capillari (punte per pipetta) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistoni capillari CP1000ST 2x91GilsonF148180
Pistoni capillari CP250ST 6x96GilsonF148714
Criocassetta di cartoneStarlabA9623-8181
Quarzo UV Hellma cuvetteSLSCEL1600
Esano 95% N-Esano per HPLC Certificato HPLCFisherH/0406/17
Coperchi per fiale di vetro ambrato da 2mlFisher11573542
Microman E M1000E Pipette (spostamento positivo)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipette (spostamento positivo)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (spostamento positivo)GilsonFD10005
MicroscopioNikonEclipse E400
Vetri di vetro per microscopio  Sigma41122601
Bagno d'acqua sonicanteVWRUSC100T
SpettrofotometroThermo Fisher ScientificA51119600C
Tracciatore stabile di acetato di retinile marcato da isotopiBuchem BVN/APer il metodo RID può essere utilizzata una gamma di isotopi stabili. Un elenco di diversi isotopi commercialmente disponibili è riportato nella Tabella 1.  
Vasca maria non mescolataSLSSLS1176
Olio vegetaleQualsiasi supermercatoN/AÈ importante utilizzare olio vegetale fresco con sufficiente durata per preparare dosi isotopiche.
Pipetta pasticceria in vetro splugata Volac 150mmSLSPIP4150

Riferimenti

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