I dosaggi immunologici a fluorescenza multiplex stanno diventando un punto di riferimento per i test sierologici. La loro applicazione, tuttavia, è limitata dalla complessità e dai lunghi processi di accoppiamento perlina-analita. Questo rapporto presenta un protocollo di accoppiamento di microsfere multiplex semi-automatizzato e riproducibile che è paragonabile al metodo standard, riducendo notevolmente il tempo necessario per ottenere i risultati.
Articolo metodologico
Un test sierologico multiplex per il rilevamento delle risposte anticorpali agli arbovirus
In questo articolo
Sommario
Abstract
I virus trasmessi dagli artropodi (arbovirus) sono un gruppo di agenti patogeni trasmessi dalle zanzare distribuiti a livello globale. Dall'epidemia del virus Zika (ZIKV) nelle Americhe nel 2016 che ha portato queste infezioni alla consapevolezza pubblica, gli arbovirus continuano a imporre un notevole onere per la salute pubblica. La loro comparsa in regioni precedentemente non endemiche è motivo di preoccupazione per la salute pubblica. La sorveglianza e il controllo delle infezioni arbovirali è una priorità attuale per l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), che nel 2024 ha lanciato un piano strategico globale per combattere le malattie arbovirali. La tecnologia multiplex® ha rivoluzionato il campo della sorveglianza sierologica, consentendo la misurazione simultanea di più anticorpi richiedendo un volume minimo di campione. Sulla base dell'esperienza nello sviluppo di test sierologici multiplex, è stato sviluppato un test multiplex basato su microsfere per la rilevazione di anticorpi contro gli antigeni degli arbovirus. Il test comprende più antigeni specifici per gli arbovirus comuni, tra cui i virus della dengue (DENV), della febbre gialla (YFV), Zika e della chikungunya (CHIKV). È stato utilizzato un metodo semi-automatico per legare in modo covalente gli antigeni a microsfere. Questo nuovo protocollo è altamente efficace e consente l'accoppiamento di un massimo di 96 antigeni in un singolo esperimento, garantendo al contempo risultati riproducibili. I dati sull'intensità della fluorescenza mediana (MFI) sono stati acquisiti utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza di facile utilizzo. Se applicato a campioni di siero umano provenienti da paesi endemici, prevediamo che questo test costituirà un potente strumento per gli sforzi di sierosorveglianza.
Introduzione
Gli arbovirus sono responsabili collettivamente di migliaia di decessi ogni anno. Questi virus vengono trasmessi all'uomo tramite artropodi infetti, principalmente zanzare e zecche. La gravità delle infezioni arbovirali è varia e varia da un'infezione asintomatica a una malattia grave che può portare alla morte. Nel 2024, l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha registrato oltre 10.000 decessi causati dai quattro sierotipi del virus dengue (DENV)da soli 1. Lo stesso anno, il virus ha infettato oltre 14 milioni di persone, inclusi 50.000 casigravi1. Sebbene il DENV sia l'arbovirus più importante, il gruppo comprende altri agenti patogeni potenzialmente letali che sono stati responsabili di molteplici focolai in tutto il mondo. Una recente revisione sommaria delle infezioni arbovirali in Africa ha rilevato che questi virus, tra cui DENV, virus della febbre gialla (YFV), virus della chikungunya (CHIKV), virus della febbre emorragica Crimea-Congo (CCHFV), virus della febbre della Rift Valley (RVFV), virus del Nilo occidentale (WNV) e virus Zika (ZIKV), hanno causato almeno 29 focolai in tutto il continente nel 20232. Nel 2022, un rapporto pubblicato dall'Ufficio regionale dell'OMS per l'Africa ha evidenziato gli attuali limiti nella sorveglianza degli arbovirus in tutta la regione, sottolineando l'urgente necessità di sviluppare metodi per la sorveglianza e il controllo degli arbovirus3.
La diagnosi clinica delle infezioni arbovirali è difficile a causa delle somiglianze nei sintomi, come febbre, artralgia e malessere generale, che sono comuni ad altri patogeni presenti nelle regioni endemiche4. Inoltre, a causa della co-circolazione e potenzialmente della co-infezione dei virus, la distinzione del patogeno eziologico è difficile5. La conferma di laboratorio è fondamentale per la diagnosi differenziale. Esistono diversi metodi per il rilevamento di arborvirus in campioni umani. I metodi diretti, tra cui i test diagnostici molecolari, il rilevamento dell'antigene virale e l'isolamento virale, rilevano la presenza dell'agente patogeno, mentre i metodi indiretti, come la diagnosi sierologica, misurano la risposta immunitaria all'infezione virale6.
È stata sviluppata una pletora di metodi per il rilevamento delle risposte anticorpali agli arbovirus. Questi includono saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), fissazione del complemento, inibizione dell'emoagglutinazione e saggi immunologici a microsfera 6,7. Questo rapporto presenta un test immunologico basato su microsfere a fluorescenza multiplex (FMIA) per il rilevamento delle risposte anticorpali agli antigeni degli arbovirus. I saggi basati su microsfere8 sono ampiamente utilizzati in sierologia e offrono diversi vantaggi, tra cui la capacità di rilevare più analiti in un'unica reazione con un volume minimo di campione. Microsfere otticamente codificate (perle di polistirene magnetico) rivestite con antigeni ricombinanti di interesse vengono utilizzate in un test immunologico sierologico indiretto. Le microsfere accoppiate vengono quindi incubate con campioni e gli anticorpi antigene-specifici vengono rilevati utilizzando un anticorpo secondario anti-IgG umano coniugato a un reporter di fluorofori di ficoeritrina (PE). Sono disponibili diversi analizzatori per il rilevamento della fluorescenza emessa, che viene riportata come MFI.
Il principio del saggio è dettagliato in Angeloni et al.8. In breve, gli antigeni di interesse sono legati chimicamente a microsfere codificate a colori. Per questo, le perle vengono inizialmente trattate con 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimmide (EDC) e N-idrossisulfosuccinimide (sulfo-NHS), che attivano il gruppo carbossilico sulla superficie delle perle, creando un composto reattivo all'ammina. Questo composto intermedio semi-stabile viene quindi miscelato con la proteina di interesse, per cui le frazioni amminiche della proteina sono legate covalentemente alle perline, generando microsfere stabili rivestite con la proteina di interesse sulla superficie. Le perle legate all'antigene vengono incubate con campioni, consentendo agli anticorpi di legarsi ad antigeni specifici. Gli anticorpi legati all'antigene vengono rilevati utilizzando un anticorpo secondario anti-immunoglobulina coniugato a un colorante fluorescente. Utilizziamo anticorpi secondari marcati con PE. Le MFI sono misurate utilizzando un light imager (i dettagli dello strumento sono forniti nella Tabella dei Materiali). Lo strumento utilizza due luci LED, un LED rosso e un LED verde, che eccitano separatamente i coloranti interni delle perle e una fluorescenza reporter sulla superficie delle perle9. I filtri vengono quindi utilizzati per classificare le perle in base al colore e per quantificare la fluorescenza emessa dagli analiti.
Abbiamo precedentemente applicato la tecnologia per il rilevamento delle risposte anticorpali al SARS-CoV-210 e alle malattie prevenibili con il vaccino11 e abbiamo dimostrato che i saggi multiplex costituiscono uno strumento inestimabile per gli studi di sieroprevalenza e sorveglianza. L'obiettivo di questo progetto è quello di estendere l'uso della FMIA alla rilevazione di risposte anticorpali a più antigeni appartenenti agli arbovirus con l'obiettivo di applicare il test allo screening di campioni provenienti dalla regione africana.
I saggi multiplex di arbovirus che utilizzano la tecnologia multiplex sono stati descritti altrove utilizzando diversi bersagli antigenici come la proteina 1 non strutturale (NS1)12,13 o il dominio dell'inviluppo III (EDIII)14. Viene presentato un test a 50 plex, che include 26 antigeni di arbovirus (tra cui NS1, EDIII, particelle simili a virus (VLP) e molti altri antigeni per testare i patogeni che co-circolano nella regione. Il test consentirà di valutare l'intensità di trasmissione di questi agenti patogeni. Un riassunto degli antigeni ricombinanti utilizzati per lo sviluppo del test è fornito nella Tabella 1. Il protocollo presentato in questo rapporto è stato sviluppato a complemento di un ampio studio di sviluppo del metodo incentrato sull'ottimizzazione del rilevamento degli arbovirus.
Ordinariamente, l'accoppiamento (o fissazione) degli antigeni alle microsfere viene effettuato in singole provette8 (accoppiamento manuale). Questo processo richiede molto tempo, è ingombrante ed è soggetto a errori di riproducibilità. Questo articolo riporta un protocollo che utilizza uno strumento automatizzato per eseguire i passaggi successivi coinvolti nel legame chimico degli antigeni alle sfere. In questo manoscritto, riportiamo i passi intrapresi per la validazione del nuovo protocollo. La validazione del nuovo protocollo è stata eseguita confrontando le risposte IgG misurate con una FMIA a 50 plessi utilizzando perle accoppiate ad antigene preparate con il metodo manuale o il protocollo automatizzato. Un'ulteriore convalida del metodo è stata eseguita analizzando campioni di siero umano provenienti da coorti africane e francesi.
Il protocollo di accoppiamento automatico delle microsfere è veloce e consente l'accoppiamento simultaneo di un massimo di 96 analiti in un'unica corsa. Ancora più importante, i risultati sono paragonabili a quelli ottenuti utilizzando il protocollo manuale stabilito, con una ridotta variazione da lotto a lotto.
Protocollo
È stata ottenuta un'adeguata approvazione etica per l'uso di campioni umani. I campioni erano residui anonimizzati di studi precedenti. Il protocollo per l'uso di campioni ORPAL "standard pool" è stato approvato dal National Ethics Board of Suriname (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Opinion Number VG 25-17). L'uso di campioni provenienti dal Madagascar è stato approvato nell'ambito del progetto PvSTATEM dal Comitato Etico della London School of Hygiene & Tropical Medicine (28541) e dal Madagascar Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale (135MSANP/SG/AMM/CERBM), mentre l'uso di campioni senegalesi è stato approvato nell'ambito del progetto Dielmo e Ndiop in corso dal Comitato Etico per la Ricerca Sanitaria Nazionale Senegalese (CNERS Sénégal). L'approvazione per misurare gli anticorpi contro le NTD in questi campioni è stata concessa dal CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). I campioni francesi non endemici sono stati ricavati da test medici di routine all'interno di laboratori ospedalieri francesi ed elaborati in conformità con le normative e le linee guida esistenti della Commissione francese per la protezione dei dati (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés). Campioni di siero umano sono stati ottenuti da soggetti provenienti da regioni con alta prevalenza di arbovirus e da una popolazione francese naïve. I campioni di siero sono stati inattivati a caldo prima dell'uso mediante incubazione a 56 °C per 30 minuti. Se i campioni non sono disattivati, manipolarli sotto una cabina di sicurezza. La maggior parte degli antigeni ricombinanti sono stati ottenuti commercialmente, ad eccezione delle proteine ricombinanti EDIII, che sono state sintetizzate internamente. Per l'acquisizione dei dati è stato utilizzato uno strumento analizzatore basato sull'imaging9 . I reagenti e le attrezzature utilizzate sono riportati nella Tabella dei Materiali.
1. Determinare le concentrazioni ottimali di antigene per l'accoppiamento
NOTA: Per prevenire il fotosbiancamento, ridurre al minimo l'esposizione delle microsfere alla luce durante la procedura. Prima dell'accoppiamento di massa, ottimizzare le concentrazioni di accoppiamento per ciascun antigene utilizzando un protocollo di accoppiamento manuale. Il protocollo è stato adattato da Angeloni et al.8. I tamponi e le soluzioni sono descritti in dettaglio nella Tabella supplementare 1.
- Selezionare le regioni del cordone da utilizzare per l'accoppiamento. Vortice completo per 20 s. Sonicare il tubo per un minimo di 60 s.
- Trasferire 200 μl (2,5 M di perline) di perline in una provetta da 1,5 mL.
- Lavare le perle con 200 μL, 100 mM di fosfato di sodio monobasico/0,125x Triton.
- Posizionare il tubo su un separatore magnetico per 60 s. Rimuovere con cura il surnatante senza toccare le perline.
- Aggiungere tampone fosfato di sodio monobasico. Lasciare agire sulla rastrelliera magnetica per 60 s. Rimuovere il surnatante.
- Attivare le microsfere con un tampone contenente 80 μl di 100 mM di fosfato di sodio monobasico, 0,125x Triton, 10 μl di sulfo-NHS e 10 μl di EDC.
- Aggiungere il fosfato di sodio monobasico -sulfo-NHS -EDC ai tubi. Incubare al buio per 20 minuti a temperatura ambiente su un rullo.
- Lavare le perle in 250 μL di PBS (1x) e 0,125x Triton. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Legare gli antigeni.
- Preparare le diverse concentrazioni (diluizioni seriali) di antigeni in un volume totale di 1 mL, 1x PBS e 0,125x Triton. Testare almeno due concentrazioni di antigeni.
- Aggiungere soluzioni di antigene alle perle attivate. Incubare al buio 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C su un rullo.
- Lavare le perle accoppiate in 500 μL PBS-TBN e 0,125x Triton. Ripetere il lavaggio tre volte.
- Risospendere le perle accoppiate in 1 mL di PBS-TBN e 0,125x Triton.
NOTA: Conservare le perle accoppiate a 4 °C per almeno 24 ore prima dell'uso. Le perle accoppiate hanno mostrato variabilità nelle MFI quando testate immediatamente dopo l'accoppiamento rispetto ai test dopo 24 ore. - Selezionare una concentrazione ottimale da utilizzare nel successivo accoppiamento su larga scala. Utilizzare diverse perle accoppiate per il test immunologico su un pool standard. Selezionare la concentrazione più bassa alla quale è stata ottenuta una curva standard lineare.
NOTA: Un esempio di linearità della risposta anticorpale a un pool standard è fornito nella sezione dei risultati, Figura 1.
2. Accoppiamento automatico del tallone su larga scala
- Prepara le perline Pro Magnetic COOH.
- Calcola le perle richieste: utilizzando 500 perline/campione, 2,5 milioni di perline sono sufficienti per 5000 campioni.
- Preparare le regioni del cordone da utilizzare per l'accoppiamento come descritto in precedenza.
- Trasferire il volume desiderato di perle nei pozzetti assegnati. Per 2,5 milioni sono stati utilizzati 200 μL di perle (la concentrazione standard di Luminex è 1,25e7 perle/mL).
- Preparare gli antigeni. Questo è un passaggio fondamentale per garantire quantità accurate di antigeni.
- Calcolare le quantità di antigene necessarie, a seguito dell'ottimizzazione. Le concentrazioni utilizzate per ciascun antigene sono descritte in dettaglio nella Tabella 1.
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, miscelare accuratamente un volume adeguato di antigeni di interesse con 1x PBS /0,125x Triton per un totale di 1 mL.
- Preparare le piastre con i reagenti. Preparare le piastre a 96 pozzetti profondi come segue. I volumi sono per pozzetto e calcolati per l'accoppiamento di 2,5 milioni di perline.
- Piastra 1 (pettini di punta): caricare i pettini di punta.
- Piastra 2 (perline): aggiungere 8 μl di Triton 0,125x e 200 μl delle regioni di interesse delle perline.
- Piastra 3 (Wash1): aggiungere 200 μl di 100 mM di fosfato di sodio monobasico / 0,125x Triton.
- Piastra 4 (attivazione): aggiungere 80 μl di 100 mM di fosfato di sodio monobasico / 0,125x Triton + 10 μl di sulfo-NHS + 10 μl di EDC.
- Piastra 5 (Wash2): aggiungere 250 μl di 1x PBS /0,125x Triton.
- Piastra 6 (accoppiamento): trasferire 1 mL di soluzione antigenica nel pozzetto assegnato.
- Piastra 7 (Wash3): aggiungere 500 μl di PBS-TBN/0,125x Triton.
- Piastra 8 (piastra finale, contiene perline accoppiate): aggiungere 1 mL di PBS-TBN + 0,125x Triton.
- Impostare l'esecuzione del ciclo di accoppiamento nel processore automatizzato.
- Seguire le istruzioni del produttore per accendere la macchina e impostare il protocollo. Il software necessario è scaricabile sul PC15. I parametri specifici dell'esecuzione sono descritti in dettaglio nella Tabella 2 supplementare.
- Caricare le piastre nella fessura assegnata sulla macchina. Seleziona il protocollo. Avviare il ciclo. Il tempo stimato per completare il programma è di 2:50 h.
- Fine del ciclo
- Seguire le istruzioni del produttore per spegnere la macchina. Scaricare le piastre come indicato. Controllare visivamente che la piastra 8 contenga le perline (pellet marrone). Inoltre, un report di esecuzione viene esportato dagli strumenti.
- Trasferire le perle accoppiate dalla piastra 8 alle singole provette da 1,5 mL per la conservazione. Conservare le perle accoppiate a 4 °C fino al momento dell'uso.
- Conta le perline.
NOTA: È stato utilizzato un contatore di celle. Per il conteggio manuale con un ematocitometro, fare riferimento al manuale del ricettario Luminex8.- Perline accuratamente accoppiate a vortice. Trasferire 10 μl in una camera di conteggio delle cellule. Seguire le istruzioni del produttore per leggere il conteggio delle microsfere per mL.
- Controllare l'aggregazione visualizzando l'immagine sul contatore di celle. Vedere la Figura 1 supplementare per un'immagine rappresentativa delle perle non aggregate.
- Se sono presenti aggregati, agitare accuratamente e sonicare per almeno 5 minuti. Ripetere il conteggio
NOTA: Dopo il conteggio delle microsfere, l'efficienza dell'accoppiamento è stata valutata eseguendo un test immunologico delle perle accoppiate su un pool standard per valutare la linearità della risposta anticorpale.
Tabella 1: Pannello di antigeni inclusi nel 50-plex. Il test include più antigeni per il rilevamento di infezioni arbovirali e agenti patogeni co-circolanti. Vengono fornite le quantità di antigeni utilizzate per l'accoppiamento di 1,25 milioni di perline. Clicca qui per scaricare questa tabella.
3. Dosaggio immunologico multiplex
NOTA: I passaggi dettagliati del protocollo per la misurazione dell'MFI sono forniti nel rispettivo manuale9. Per ridurre al minimo l'esposizione delle perle alla luce e il rischio di fotosbiancamento, tutte le soluzioni e i campioni vengono preparati prima di estrarre le perle dal frigorifero.
- Impostare il layout della piastra. Sono state utilizzate piastre da 96 pozzetti che includevano diluizioni seriali di una piscina standard e di un bianco (solo tampone) nella prima fila.
- Diluire i campioni e lo standard in tampone PBT in una piastra separata non legante. Per i campioni è stata utilizzata una diluizione 1:200 (concentrazione finale di 1:400). Per la curva standard, sono state utilizzate una diluizione 1:50 del pool di siero standard (con conseguente concentrazione finale di 1:100) e dieci diluizioni seriali 2 volte.
- Determinare la quantità di microsfere accoppiate da utilizzare in un volume totale di 50 μL/pozzetto. Sono state utilizzate 500 perle di ciascuna perlina per pozzetto e regolate in volume con tampone PBT.
- Agitare accuratamente la miscela di perle accoppiate per 30 s. Sonicare per almeno 60 s.
- Calcolare il volume di ciascuna perla accoppiata da aggiungere alla premiscela multiplex per garantire un numero uguale di microsfere per ogni analita. I volumi delle perle sono stati calcolati come segue: Volume delle perle per pozzetto = numero di perle per pozzetto/conteggio delle perle.
NOTA: Un esempio per il calcolo delle microsfere e dei volumi tampone necessari per la premiscela è illustrato nella Tabella supplementare 3. - Trasferire volumi adeguati di perlina di antigene in una provetta da centrifuga.
- Regolare il volume con PBT.
- Mescolare accuratamente la premiscela.
- Distribuire 50 μl di premiscela sulla micropiastra per imaging (ad es. ps, piastre f-bottom).
- Aggiungere 50 μl dei campioni diluiti alle microsfere.
- Mescolare su uno shaker per 30 minuti a temperatura ambiente, 700 giri/min.
- Lavare le piastre tre volte come segue (lavaggio manuale).
- Posizionare la piastra su una gratella magnetica per 60 s a temperatura ambiente. Tenere saldamente la piastra sulla griglia e gettare il surnatante.
- Aggiungere 100 μl di tampone PBT. Lasciare agire sulla rastrelliera magnetica per 60 s. Ripetere i lavaggi
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare una rondella per piastre16 . La lavatrice è stata impostata come segue: 1 ciclo di ammollo, seguito da 3 cicli (aspirazione, erogazione e ammollo) e un ciclo finale di aspirazione.
- Scartare il surnatante e aggiungere 50 μl di anticorpo secondario diluito.
- Seguire le istruzioni del fornitore per preparare una soluzione madre dell'anticorpo secondario. È stata utilizzata una soluzione di diluizione 1/120 di anticorpo secondario. I volumi degli anticorpi secondari sono stati calcolati come segue: volume degli anticorpi secondari = volume totale/fattore di diluizione.
- Miscelare l'anticorpo secondario con un volume adeguato di tampone PBT. Mescola accuratamente. Aggiungere 50 μl di anticorpo secondario diluito alle perle lavate.
- Incubare su uno shaker per 15 minuti a temperatura ambiente, 700 giri/min.
- Eseguire tre lavaggi come descritto in precedenza.
- Risospendere le perle in tampone PBT da 150 μl.
- Incubare su uno shaker per 5 minuti a temperatura ambiente, 700 giri/min. Seguire le istruzioni del produttore per configurare gli strumenti9.
NOTA: È stato utilizzato il software xPONENT17 fornito con lo strumento imager. Le impostazioni per la lettura della fluorescenza sono state impostate come segue: il volume di raccolta è stato impostato su 50 μL, con una misura minima di 50 sfere, senza riscaldatore XY e il tipo di analisi è stato nullo.
4. Analisi dei dati
- Esegui la convalida
- Verificare che sia stato raggiunto il numero minimo di perline. Si raccomandano almeno 35 perle per pozzetto per ottenere un MFI8 statisticamente valido.
- Controllare che i valori MFI del campione di controllo in bianco e negativo siano minimi.
- Controllare i valori MFI per gli standard tracciando una curva standard. Questi sono superiori al campione bianco e/o al campione di controllo negativo.
- Analisi dei dati di esempio
- Esporta i dati come file CSV e analizzali esternamente utilizzando il software R.
Risultati
Per illustrare il processo seguito per la convalida del protocollo, abbiamo selezionato tre antigeni che rappresentano tre famiglie di arbovirus: Flavivirus (proteina DENV1 NS1), Alphavirus (proteina CHIKV VLP) e Bunyavirus (RVFV NP). Gli antigeni sono stati testati su un pool standard di una popolazione pre-esposta (ORPAL), sieri di popolazione francese (non esposta) e due coorti provenienti dall'Africa (Senegal e Madagascar).
Linearità della diluizione della risposta anticorpale
La concentrazione di antigeni da utilizzare per l'accoppiamento delle microsfere è stata determinata utilizzando diluizioni seriali del pool ORPAL. La concentrazione ottimale è stata selezionata come la concentrazione più bassa alla quale è stata ottenuta una curva standard lineare (dati non mostrati). La Figura 1 mostra la linearità degli antigeni dell'arbovirus selezionati alla concentrazione ottimale per ciascun antigene. Per il controllo di qualità dell'accoppiamento, ogni lotto di perle accoppiate è stato testato per la linearità di diluizione sul pool standard ORPAL utilizzando la concentrazione preselezionata.
Comparabilità con il test standard di accoppiamento manuale
Per valutare la comparabilità dei dati ottenuti utilizzando il nuovo protocollo automatizzato con l'accoppiamento manuale consolidato, abbiamo confrontato le curve standard generate dai risultati ottenuti con l'accoppiamento manuale rispetto a quelle automatizzate. La Figura 2 mostra la linearità parallela per entrambi i saggi. I valori di MFI variano in base all'antigene.
Variazione del lotto di accoppiamento del tallone
La variazione del lotto di accoppiamento, in quanto è stata valutata la riproducibilità dei test dello stesso lotto di accoppiamento, è stata valutata utilizzando il grafico18 di Levey-Jennings. Gli antigeni rappresentativi e le perle accoppiate a BSA di controllo sono stati utilizzati e testati sul pool standard ORPAL. La Figura 3 mostra le IFM provenienti da 19 piastre diverse, testate in giorni diversi per ciascun antigene. Le MFI risultanti rientrano nell'intervallo della media ± 3 SD per i tre antigeni e il controllo.
Effetto del multiplexing sulle MFI
Per valutare ulteriormente le prestazioni del test, abbiamo testato se il multiplexing di diversi antigeni influenzasse la risposta anticorpale misurata. La risposta è stata confrontata con un singolo antigene (o una microsfera a plesso singolo) utilizzando il pool standard ORPAL. La Figura 4 mostra una forte correlazione (R = 0,99, p < 2,2e-16) tra i risultati ottenuti quando le MFI sono state misurate su singoli antigeni o da una premiscela contenente 50 antigeni.
Risposte anticorpali da campioni di siero umano nelle popolazioni africane
Per valutare l'applicabilità del test a campioni provenienti da diverse coorti, abbiamo confrontato le risposte anticorpali in campioni di siero umano provenienti da popolazioni africane, che hanno un'alta probabilità di esposizione agli arbovirus, con quelli di una coorte francese che presumibilmente ha un'esposizione inferiore a questi virus. In totale, sono stati testati 1.596 campioni per il Madagascar, 1.428 per il Senegal e 84 per la coorte francese. La Figura 5 presenta i grafici di densità per le diverse coorti. Per la coorte senegalese, si osserva una chiara distribuzione bimodale dei dati per le risposte a CHIKV VLP, suggerendo due risposte distinte a CHIKV nella popolazione. Una sottile coda bimodale è stata osservata anche per DENV1, NS1 e RVFV NP nella coorte del Senegal, mentre non vi è alcuna differenza tra le coorti francesi e del Madagascar.
Figura 1: Linearità della risposta anticorpale testata su pool standard ORPAL. Gli antigeni selezionati dell'arbovirus sono mostrati come esempio. Le intensità di fluorescenza mediana (MFI) sono mostrate sull'asse y (scala logaritmica) e la diluizione seriale del pool standard sull'asse x. Tutti gli antigeni del pannello sono stati pre-testati nel pool standard prima del test di massa sui campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Linearità parallela della risposta anticorpale mediante metodi di accoppiamento. Log delle MFI (asse y) di antigeni rappresentativi (facet) testati su diluizioni seriali del pool standard ORPAL (asse x). I colori rappresentano diversi metodi di accoppiamento: automazione (rosso, verde, blu) e manuale (viola). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Variazione da piastra a piastra. Levey_Jennings grafici per il bead accoppiato BSA (controllo), DENV1 NS1, CHIKV VLP e RVFV sono mostrati per il pool standard ORPAL a una concentrazione di 1:400. I risultati rappresentano 19 targhe eseguite in giorni diversi. Le IFM sono presentate sull'asse y, il numero di test è sull'asse x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Correlazione della risposta anticorpale al test mono e multiplex. Il pool standard è stato diluito a una concentrazione finale di 1:400 e testato su una premiscela contenente gli antigeni 50-plex in parallelo con perle rivestite di antigene singolo. Per l'analisi è stata utilizzata la correlazione di Pearson. Tre antigeni rappresentativi sono mostrati come esempio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Applicazione del test sulla coorte di campioni endemici e non endemici. Il test è stato testato su campioni provenienti dal Madagascar (verde), dal Senegal (blu) e dalla Francia (rosso). I campioni sono stati diluiti a una concentrazione finale di 1:400. L'asse X rappresenta le MFI normalizzate (nMFI), calcolate come rapporto tra l'MFI campione e l'MFI standard del pool alla stessa concentrazione (1:400). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Esempio di immagine rappresentativa dell'aggregazione delle perline. Il pannello (A) mostra le perline non aggregate e il pannello (B) mostra gli aggregati di perline. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 1: Tabella dei tamponi. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 2: Impostazioni del protocollo di accoppiamento delle perline KingFisher Apex. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 3: Esempio per il calcolo dei volumi delle perle per la premiscela. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
L'uso della FMIA ha cambiato il panorama dei test sierologici. Il punto di forza dei test risiede nella capacità di valutare le risposte anticorpali a più antigeni in un'unica reazione, riducendo il tempo necessario per ottenere i risultati e diminuendo il costo dei test. Ciò è particolarmente importante nella sorveglianza sierologica. L'uso di routine dei test FMIA è, tuttavia, ostacolato dalla fase di accoppiamento manuale delle microsfere, che richiede molto tempo e laboriosa gestione, di singoli antigeni per reazione. Questo rapporto presenta un metodo automatizzato per l'accoppiamento chimico di antigeni a perline. L'automazione consente l'accoppiamento simultaneo di un massimo di 96 antigeni in un'unica corsa, riducendo notevolmente il tempo necessario per l'accoppiamento dell'antigene ad alto rendimento.
La Figura 1 mostra che gli antigeni sono stati legati con successo alle perline. I risultati mostrano anche un forte parallelismo tra il nuovo protocollo automatizzato e il protocollo manuale consolidato (Figura 2), indicando un'accuratezza non inferiore nel rilevare le risposte IgG agli antigeni valutati. I risultati della variazione del lotto di accoppiamento tra piastre (Figura 3) e di accoppiamento a cordone (Figura 2) mostrano la comparabilità dei dati quando si utilizza il metodo automatizzato per l'accoppiamento. L'elevata correlazione tra MFI multiplex e singleplex (Figura 4) mostra che il multiplexing di un numero elevato di antigeni non influisce sulla risposta anticorpale all'insieme di singoli antigeni utilizzati in questo test.
Per la convalida del test, sono stati testati campioni provenienti da coorti endemiche e non endemiche (Figura 5). Mentre gli studi di sieroprevalenza degli arbovirus sono ancora scarsi in Africa, i dati disponibili 19,20,21,22 suggeriscono un quadro sfumato con sieroprevalenze variabili di IgG tra e all'interno dei singoli paesi. In particolare, i dati esistenti suggeriscono una maggiore prevalenza dei tre virus (chikungunya, dengue e Rift Valley) in Senegal rispetto al Madagascar, ad esempio19. Queste prevalenze sono coerenti con l'osservazione in questo rapporto, che ha mostrato una risposta chiara e distinta ai diversi antigeni in Senegal rispetto alle altre coorti. Ciò supporta la capacità del test di distinguere i profili anticorpali in un contesto di sieroprevalenza relativamente elevata. I dati osservati per la coorte del Madagascar possono essere spiegati dalla bassa prevalenza riportata dei virus nel sito di raccolta del campione22, mentre la comparabilità dei dati con la coorte non endemica può essere parzialmente spiegata dalla piccola dimensione del campione della coorte francese. Inoltre, la variabilità riportata tra le regioni potrebbe spiegare le differenze osservate nei set di dati. È necessario uno studio approfondito per valutare la sieroprevalenza delle IgG; tuttavia, i dati presentati in questo rapporto mostrano che il test sviluppato è specifico per rilevare le risposte IgG agli antigeni dell'arbovirus valutati, distinguendo i dati dalle regioni endemiche e le risposte distinte e sfumate all'interno della stessa popolazione.
Le principali sfide tecniche includevano il raggiungimento di soluzioni di antigene omogenee nonostante il loro utilizzo in quantità molto ridotte, la garanzia di una rappresentazione equimolare delle regioni delle perle nella premiscela e la riduzione al minimo dell'aggregazione delle microsfere. Per superare la difficoltà di ottenere una soluzione omogenea nella piastra a 96 pozzetti, è stata implementata una fase in cui tutte le soluzioni antigeniche sono state accuratamente premiscelate in una provetta da 1,5 mL prima di essere distribuite nella piastra. Inoltre, è stato aggiunto un passaggio per contare le perle accoppiate e regolare i volumi per garantire che un numero uguale di regioni di perline venga aggiunto alla premiscela. È stata inclusa anche una fase di sonicazione per facilitare la miscelazione delle perle e ridurre al minimo l'aggregazione nella premiscela.
In questo studio limitato, la stabilità delle perle accoppiate e il loro impatto sulle prestazioni del saggio non sono stati valutati, poiché tutti i campioni sono stati testati entro un mese dall'accoppiamento delle microsfere. Questa valutazione esula dall'ambito della presente relazione e sarà esaminata in studi futuri. Nonostante queste limitazioni, questo rapporto presenta un metodo rapido e affidabile per rilevare le risposte anticorpali a una varietà di agenti patogeni, compresi gli arbovirus. La sorveglianza sierologica delle infezioni arbovirali è fondamentale per il controllo delle malattie e la disponibilità di un metodo rapido e riproducibile per rilevare le risposte anticorpali a questi virus rappresenta un progresso significativo negli sforzi globali per valutare le eterogeneità nella trasmissione e gli interventi mirati per mitigare l'onere di queste infezioni. Inoltre, sebbene l'obiettivo di questo rapporto sia sugli arbovirus, questo protocollo è ampiamente applicabile a un'ampia gamma di antigeni e rappresenta un progresso significativo nel campo.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano sinceramente i partecipanti allo studio e gli operatori sanitari della comunità in ciascuno dei siti dello studio. Ringraziamo inoltre tutto il personale di laboratorio e sul campo per l'impegno profuso nella raccolta dei campioni, nell'acquisizione dei dati e nelle analisi di laboratorio. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione Reconstructing the transmission intensity of arboviruses across Africa and the impact of interventions in a changing climate (xSTAR) del Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. Ai fini dell'accesso aperto, gli autori hanno applicato una licenza di copyright pubblica CC BY a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione. Si ringraziano inoltre i seguenti per il permesso di utilizzare i campioni: Rob Van Der Pluijm (Epidemiologia e analisi delle malattie infettive, Institut Pasteur, Parigi) e Maylis Douine e Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi microcentrifughe da 1,5 mL | - | Consumabili in laboratorio generale | |
| Unità filtro da 1000 mL 0,2 um | Thermo Fisher Scientifico | 567-0020 | |
| Serbatoi di 25 mL | Termoscientifica | 95128095 | |
| Tubi da 50 mLFalcon | - | Consumabili in laboratorio generale | |
| 96 piastre di pozzo profondo - KingFisher DW | Termoscientifica | 10373480 | |
| Lavatrice automatica per piastre (opzionale) | TECAN | Rondella micropiastra HydroFlex Plus | |
| FHA per la tosse tosse | Antigene nativo | BP-FHA-50 | |
| Bilanciamento | - | Attrezzatura generale di laboratorio | |
| Centrifuga da banco | - | Attrezzatura generale di laboratorio | |
| BioPlex Pro Magnetico COOH Sfera | Luminex | MC10xxx (x=regione delle perline) | |
| Albumina Sirica Bovina, BSA | Sigma | A7906 | |
| Branson Ultrasonics Sonic Ultrasonic Cleaner Model B200 | Fisher scientifico | 15-337-22 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| CCHF GP | Antigene nativo | REC31639-100 | |
| Contatore cellulare/Ematocitometro | Biorad/Merck | TC20 /Z359629 | |
| CHIKV E2 | Antigene nativo | REC31617-100 | |
| CHIKV VLP | Antigene nativo | CHIKV-VLP-100 | |
| Piastre immunitarie non sterili a fondo piatto trasparenti a 96 pozzi | Termoscientifica | 3455 | |
| CMV-particelle | Antigene nativo | CMV-HP-100 | |
| Conteggio delle vetrine, doppia camera per il contatore delle celle | Biorad | L003662 A | |
| CP23 | Antigene nativo | Production Prot | |
| CT694 | Antigene nativo | Production Prot | |
| CtxB | |||
| DENV1 EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| DENV1 NS1 | Antigene nativo | DENV1-NS1-100 | |
| DENV1 VLP | Antigene nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV2 EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| DENV2 NS1 | Antigene nativo | DENV2-NS1-100 | |
| DENV2 VLP | Antigene nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV3 EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| DENV3 NS1 | Antigene nativo | DENV3-NS1-100 | |
| DENV3 VLP | Antigene nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV4 EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| DENV4 NS1 | Antigene nativo | DENV4-NS1-100 | |
| DENV4 VLP | Antigene nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| Tossicità per difteria | Antigene nativo | DIP-TNL-100 | |
| EBV-GP125 | Antigene nativo | REC31601-100 | |
| EDC | Sigma | 03449 | |
| Etanolo al 100% | - | Laboratorio generale | |
| Sigillatura in alluminio non sterile | - | Generale | |
| Strumento di imaging a fluorescenza - Sistema MAGPIX | Luminex | MAGPIX-XPON4.1-CEIVD | |
| Calamita portatile per piastre - Separatore magnetico a 96 pozzi | Luminex | CN-0269-01 | |
| HEV-ORF2 | Antigene nativo | REC31653-100 | |
| Inaba OSP | Boston_MGH | - | |
| Pettine a punta Kingfisher DeepWell per 96 pozzi | Termoscientifica | 17170069 | |
| Leishmania K28 | Clinisciences | MBS3040095 | |
| Kit di calibrazione Luminex MAGPIX | Luminex | MPX-CAL-K25 | |
| Kit di verifica Luminex MAGPIX | Luminex | MPX-PVER-K25 | |
| Separatore a tubo magnetico | Invitrogen | DynaMag | |
| MAGPIX Drive Fluid Plus | Luminex | 40-50030 | |
| NP del morbillo | Antigene nativo | REC31796 | |
| Agitatore a microplacche | Randox | ||
| MICROPIASTRA POZZO, PS, F-BOTTOM (POZZO CAMINO) | Una Greiner-Bio | 655096 | |
| MiliQ H20 | - | Laboratorio generale | |
| Pipette multicanale 10, 300 | SARTORIUS | ||
| NIE | Antigene nativo | Production Prot | |
| Ogawa OSP | Boston_MGH | - | |
| ONNV E2 | Clinisciences | IT-022-006Ep | |
| Strumento di processore di particelle | Termoscientifica | Thermo Scientific KingFisher Flex | |
| PBS 10x PH~7.0 | EUROMEDEX | ET330 | |
| Anticorpo secondario IgG Fc anti-umano coniugato con PE | Ricerca su Jackson Immuno | 709-116-098 | |
| PfAMA1 | Produzione interna | - | |
| PfMSP1 | Antigene nativo | REC32013-100 | |
| PGP3 | Antigene nativo | Production Prot | |
| Punte per pipette (fornitore) 10 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L | - | Consumabili in laboratorio generale | |
| Pm MSP1 | Clinisciences | CUST-PRT-31102024-1B | |
| Po MSP1 | Clinisciences | CUST-PRT-31102024-1A | |
| PvMSP1 | Antigene nativo | REC31724-100 | |
| R software R4.4.1 | - | - | |
| Parco nazionale RVFV | Antigene nativo | REC31640-100 | |
| Pipette a canale singolo 10p, 20p, 200p, 1000p | Eppendorf | ||
| SNAP | Produzione interna | - | |
| S-NHS | Sigma | 56485 | |
| Azida di sodio | Sigma | S2002 | |
| Soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) | - | Candeggina generale per la casa | |
| Tossina del tetano | Antigene nativo | REC31801-100 | |
| Software Thermo Scientific BindIx versione 1.1 | ThermoFisher Scientific | - | |
| TRITON | Thermo Scientific | A16046 | |
| Rullo a tubolo | IKA | Rullo 6D -100219627 | |
| Preadolescente-20 | Sigma | P7949 | |
| USUV EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| USUV NS1 | Antigene nativo | USUV-NS1-100 | |
| Vortex | - | Attrezzatura generale di laboratorio | |
| VSP3 | Antigene nativo | Production Prot | |
| VSP5 | Antigene nativo | Production Prot | |
| WNV EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| WNV NS1 | Antigene nativo | WNV-NS1-100 | |
| Software xPONENT | Luminex | 89-30000-00-759 Rev A maggio-19 | |
| YFV EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| YFV NS1 | Antigene nativo | YFV-NS1-100 | |
| ZIKV EDIII + SNAP | Produzione interna | - | |
| ZIKV NS1 | Antigene nativo | ZIKV-NS1-100 | |
| ZIKV VLP | Antigene nativo | ZIKV-VLP-100 |
Riferimenti
- Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
- Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
- World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
- Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
- Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
- Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
- Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
- Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
- Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
- Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
- Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
- Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
- Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
- Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
- KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
- Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
- XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
- Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
- Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
- Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
- Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
- Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).
Ristampe e permessi
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso