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Articolo metodologico

Organoidi intestinali umani a seme cellulare singola per la ricerca sugli organoidi

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DOI:

10.3791/69265

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6 febbraio 2026

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1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali derivati dal paziente con seme cellulare singole, fornendo colture standardizzate che riducono l'eterogeneità e migliorano la riproducibilità per i test a valle e le applicazioni di medicina di precisione.

Abstract

Gli sviluppi recenti nella tecnologia degli organoidi hanno permesso la creazione di organoidi intestinali derivati dal paziente (PDIO) che riproducono le caratteristiche strutturali, funzionali, genetiche ed epigenetiche dei loro tessuti originali. Tuttavia, gli organoidi convenzionali derivati dal passaggio inevitabilmente producono popolazioni eterogenee in dimensioni e numero, portando a risultati incoerenti anche in condizioni identiche. Per affrontare questo problema, è stato istituito un approccio standardizzato, qui chiamato "PDIO a singola cellula". In questo metodo, i PDIO maturi sono stati dissociati enzimaticamente in singole cellule e seminati a un numero definito in singoli pozzi di una piastra a 96 pozzi. Questo seeding controllato normalizzava la dimensione e il numero di PDIO. Rispetto agli organoidi derivati dal passaggio, i PDIO a seme cellulare singola hanno mostrato una ridotta variabilità tra pozzi nel numero di organoidi e nella variabilità intra-pozzo nelle dimensioni degli organoidi, il che consente di determinare l'efficienza generativa e migliora la riproducibilità degli saggi di viabilidade. Inoltre, questa piattaforma è compatibile con l'analisi a valle, inclusa l'analisi trascrittomica e la profilazione dell'espressione proteica. Collettivamente, questo approccio può migliorare la coerenza sperimentale e fornire una base pratica per studi riproducibili basati su PDIO.

Introduzione

L'intestino umano è un ecosistema altamente complesso definito da interazioni finemente calibrate tra microbiota intestinale, epitelio intestinale e sistemaimmunitario 1. Questi componenti mantengono l'omeostasi intestinale attraverso reti di segnalazione strettamente regolate. Ad esempio, il microbiota intestinale, composto da oltre dieci trilioni di organismi microbici, interagisce con le cellule immunitarie per modulare l'attività del sistema immunitario e mantiene un ambiente intestinaleequilibrato 2. L'epitelio intestinale è determinante nel mediare questo sistema immunitario microbiota-sistemaincrociato 3,4. Le cellule staminali intestinali (ISC), il principale motore del rinnovamento epiteliale, si rigenerano e differenziano continuamente in tipi cellulari specializzati, incluse le linee cellulari secretorie (cellule di Paneth, cellule goblet, cellule enteroendocrine e cellule Tuft), enterociti assorbenti e cellule microfold 5,6. Insieme, queste cellule formano una barriera fisica vitale e un'interfaccia funzionale che protegge l'ospite dagli stimoli infiammatori.

Negli ultimi anni, i PDIO sono emersi come una potente piattaforma nella ricercatraslazionale 7. Queste colture tridimensionali (3D) sono create da ISC isolati dai tessuti del paziente e mantenuti in una matrice extracellulare come la matrice extracellulare (ECM), insieme a fattori di crescita definiti che riproducono la nicchiaISC 8,9. In particolare, i PDIO mantengono le caratteristiche genetiche ed epigenetiche del tessuto donatore, permettendo un'espansione prolungata e sperimentazioni riproducibili. Da quando Sato et al. hanno sviluppato per la prima volta i PDIO daISCs 10 del recettore G accoppiato proteico ricco di leucina contenente ripetizioni contenente leucina (Lgr5⁺), studi successivi hanno identificato fattori di crescita essenziali per la generazione e differenziazione dei PDIO, portando a protocoli ampiamente adottati nei laboratori 11,12,13. Tuttavia, i contesti sperimentali utilizzati per trattare i PDIO con farmaci candidati variano notevolmente tra gli studi e spesso sono descritti in modoinsufficiente: 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45, 46, 47. Inoltre, i PDIO sono tipicamente attraversati da interruzioni meccaniche, causando eterogeneità nelle dimensioni dell'organoide, nella morfologia e nell'organizzazione spaziale. Questa variabilità complica la valutazione accurata della reattività al farmaco e dei meccanismi molecolari sottostanti. Per affrontare questa limitazione, studi recenti hanno sviluppato PDIO derivati da cellule singole a sospensione o da cellule singoleordinate 45,48,49,50,51,52,53,54.

In questo articolo, come uno dei metodi complementari e pratici, vengono introdotti i "PDIO a singola cella" per generare PDIO standardizzati da una sospensione a singola cella utilizzando ECM convenzionali e supporti, consentendo saggi accurati e riproducibili. In breve, singole cellule isolate dai PDIO maturi sono state incorporate nell'ECM a densità cellulari definite, e le colture risultanti sono state monitorate per 2 settimane mentre numero, dimensione e morfologia venivano quantificati. Poiché ogni cupola ECM è incorporata con un ingresso cellulare noto, il conteggio degli organoidi per pozzo è costante, permettendo di calcolare l'efficienza di generazione come una lettura della capacità rigenerativa in ciascuna lineaorganoide 49,54. Sebbene il Matrigel a forma di cupola produca eterogeneità dimensionale a causa del gradiente spaziale della concentrazione di Wnt3a derivante dalla sua instabilità intrinseca e dalla diffusionelimitata 55, la variabilità dimensionale tra pozzi nei PDIO con seme cellulare singola è nettamente inferiore rispetto agli organoidi derivati dal passaggio49,54. Tuttavia, questo approccio presenta ancora limitazioni pratiche. Senza la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, alcuni organoidi possono essere generati da doppietti o triplete, risultando in un'eterogeneità biologica intrinseca all'interno dei PDIO. Inoltre, il numero ottimale di singole cellule deve essere determinato empiricamente per ciascuna linea organoide a causa delle diverse efficienze generative. Infine, i PDIO completamente differenziati con seme cellulare singolo sono stati sottoposti ad analisi a valle, inclusi PCR quantitativo per trascrizione inversa (qRT-PCR), Western blot e immunoistochimica.

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Protocollo

Tutti i materiali e i reagenti necessari per l'esperimento sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di reagenti e materiali

  1. Preriscaldare la piastra di coltura degli organoidi in un incubatore a 37 °C per più di 90 minuti.
    NOTA: Preriscaldare la piastra di coltura aiuterà a solidificare l'ECM e a mantenere la forma della cupola. 90 min è il tempo minimo richiesto per la polimerizzazione ECM. È fortemente consigliato preriscaldare la piastra per più di 12 ore.
  2. Utilizzare il mezzo organoide di crescita (EXP) integrato con penicillina-streptomicina (PS) allo 0,5% come mezzo di coltura organoide.
  3. Per la differenziazione di PDIO a seme cellulare singole, si utilizza un mezzo di differenziazione (DIF) composto da un mezzo basale integrato con fattori di crescita (Tabella 1). Il mezzo basale è composto da DMEM/F12 avanzato integrato con 0,5% di PS, 0,25% solfato di gentamicina e 1% di glutamina, insieme ai seguenti fattori di crescita: Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 μg/mL), Wnt3a (100 ng/mL), fattore di crescita epidermica (EGF; 50 ng/mL), N-acetil-L-cisteina (1 mM), [Leu15]-gastrina I umana (10 nM), A 83-01 (500 nM), fattore di crescita simile all'insulina 1 (IGF-I; 200 ng/mL), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF; 100 ng/mL) e integratore di B-27 (1x) (Tabella 1).
    NOTA: PS e gentamicina sono biohazardi e devono essere gestiti con guanti e protezione oculare.
  4. Prepara appena la soluzione di recupero cellulare (CRS), il tampone di lavaggio (DMEM ad alto livello di glucosio con 1% di BSA), 1 mM Y-27632, EXP e DIF, e lascia in freddo fino all'uso.
    NOTA: Lascia che EXP e DIF si equilibrino a temperatura ambiente per almeno 20 minuti prima di aggiungere alle piastre di coltura preriscaldate.
  5. Scongela l'ECM sul ghiaccio e assicurati che sia sempre mantenuto freddo.
    NOTA: L'ECM richiede lo scongelamento su ghiaccio e deve essere sempre mantenuto freddo per prevenire una polimerizzazione prematura.
  6. Bilanciare il reagente enzimatico di dissociazione alla temperatura ambiente. Preriscalda il reagente in un bagno d'acqua a 37 °C prima dell'applicazione.
    NOTA: Il reagente enzimatico dissociativo è un irritante e deve essere gestito con l'attrezzatura di protezione personale appropriata.

2. Scongelamento e recupero dei PDIO criopreservati

  1. Recupera il tubo crioviale contenente organoidi dal serbatoio di azoto liquido. Allenta leggermente il tappo del tubo e scongela in un bagno d'acqua a 37 °C per 60-90 secondi.
    NOTA: Trasferisci immediatamente il tubo nel ghiaccio dopo lo scongelamento.
  2. Pre-inhumidi una punta di pipetta a largo diametro con buffer di lavaggio e trasferisci gli organoidi dal tubo crioviale in un tubo da 50 mL.
  3. Risciacquare il cryovial con 1 mL di tampone per il lavaggio e trasferire il contenuto residuo nel tubo da 50 mL. Ripeti questo passo di risciacquo due volte.
  4. Centrifuga a 290 × g per 7 minuti a 4 °C. Assicurati che si formi un pellet visibile sul fondo del tubo.
  5. Aspira il soprandante.
  6. Risospendere in ECM usando una punta di pipetta pre-bagnata a largo cilindro.
  7. Puntare l'ECM su una piastra preriscaldata a 24 pozzi e incubare a 37 °C per 10 minuti.
    NOTA: Usa 30 μL di ECM per pozzo.
  8. Aggiungi EXP e circonda i pozzi con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) o acqua distillata.
    NOTA: Usa 500 μL di EXP per pozzo. La coltura in EXP è stata integrata con 10 μM Y-27632 per i primi 3 giorni, poi è passata a EXP senza Y-27632.

3. Passaggio dei PDIO

  1. Aspira l'EXP spesa.
  2. Pre-bagna una punta di pipetta a largo diametro con tampone di lavaggio, aggiungi 1 mL di reagente di dissociazione cellulare per staccare l'ECM e trasferisci il contenuto in un tubo da 15 mL.
  3. Incuba il tubo su un dondolo per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare a 300 × g per 7 minuti a 4 °C.
  5. Esprimi il sovrandante e aggiungi 1 mL di buffer per il lavaggio. Sospezioni 20 volte.
  6. Aggiungi un altro 1 mL di buffer per il lavaggio, risospendi 20 volte e trasferisci su un tubo da 50 mL.
  7. Centrifuga a 300 × g per 7 minuti a 4 °C.
  8. Aspira il soprandante.
  9. Risospendere in ECM usando una punta di pipetta pre-bagnata a largo cilindro.
  10. Puntare l'ECM su una piastra preriscaldata a 24 pozzi e incubare a 37 °C per 10 minuti.
    NOTA: Usa 30 μL di ECM per pozzo.
  11. Aggiungi EXP e circonda i pozzi con acqua sterile 1x PBS o distillata.
    NOTA: Usa 500 μL di EXP per pozzo. La coltura in EXP è stata integrata con 10 μM Y-27632 per i primi 3 giorni, poi è passata a EXP senza Y-27632.

4. Cultura PDIO a seme di singola cellula

  1. Aspira l'EXP spesa.
    NOTA: I rifiuti contenenti antibiotici (ad esempio, mezzi esplosi con PS o gentamicina) devono essere autoclavati prima dello smaltimento.
  2. Lava con 1 mL di sterile 1x PBS.
  3. Pre-bagna una punta a pipetta a largo diametro con tampone di lavaggio, aggiungi 300 μL di CRS per staccare l'ECM e trasferisci il contenuto in un tubo da 50 mL.
  4. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C (Figura 1A).
  5. Aspira il surnadante, aggiungi 3 mL di buffer per il lavaggio e risospendi 20 volte.
    NOTA: Questo passaggio disturba meccanicamente gli organoidi.
  6. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C (Figura 1B).
  7. Aspirare il soprantantante e aggiungere 5 mL di reagente enzimatico dissociativo preriscaldato contenente 10 μM Y-27632. Fai roteare 2-3 volte e incuba in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti, scuotendo il tubo ogni 5 minuti.
    NOTA: Gli aggregati di detriti compaiono tipicamente entro 10 minuti dall'incubazione. Limita il trattamento totale del reagente enzimatico di dissociazione a meno di 20 minuti. Non superare i 25 minuti, poiché la sovradigestione compromette notevolmente la resa e la vitalità delle singole cellule.
  8. Aggiungi 10 mL di DMEM ad alto livello di glucosio.
  9. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C (Figura 1C).
  10. Aspira il soprandanzante e aggiungi 1 mL di buffer per il lavaggio. Sospezioni 20 volte.
    NOTA: I rifiuti contenenti reagenti enzimatici, che contengono reagenti enzimatici, devono essere raccolti separatamente e inattivati con candeggina allo 0,5-1% per almeno 30 minuti prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza.
  11. Filtrare attraverso un filtro di cellule da 40 μm in un nuovo tubo da 50 mL (Figura 1D).
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per isolare le singole cellule dagli organoidi maturi. Un filtratore a celle da 40 μm dovrebbe essere utilizzato per isolare singole cellule.
  12. Contare le cellule usando il blu di tripano. Trasferisci il volume calcolato su una valvola da 1,5 mL.
    NOTA: Placcare 3.000-4.000 celle per pozzo in una piastra preriscaldata da 96 pozzi.
  13. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C (Figura 1E).
  14. Rimuovi il soprandanante usando una pipetta.
  15. Risospendere le celle in ECM (100-500 cellule/μL) utilizzando una punta di pipetta pre-bagnata a largo diametro.
  16. Infila l'ECM in una piastra preriscaldata da 96 pozzi e incuba a 37 °C per 10 minuti.
    NOTA: Usa 10 μL di ECM per pozzo.
  17. Aggiungi DIF ai pozzi. Circonda i pozzi con acqua sterile 1x PBS o distillata.
    NOTA: Usa 150 μL di DIF per pozzo. La coltura in DIF è stata integrata con 10 μM di Y-27632 per 3 giorni, poi è passata a DIF senza Y-27632. Cambia il medium ogni 3 giorni e mantieni per un totale di 10 giorni.

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Risultati

Per generare PDIO a seme cellulare singola, sono state prelevate biopsie da pizzicare mucosa dell'ileo terminale e del colon ascendente durante una colonscopia di sorveglianza con pinze biopsiche standard da 2,8 mm, sotto l'ambito del NYU Grossman School of Medicine Institutional Review Board (Profilazione Immunitaria Mucosal in Patients with Inflammatory Bowel Disease; S12-01137). Successivamente, sono stati generati PDIO con seme cellulare singola dissociando 6.000 cellule isolate da P...

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Discussione

I PDIO offrono un'enorme promessa per la modellazione di precisione delle malattie, lo screening farmacologico e la medicina rigenerativa, poiché preservano fedelmente il panorama genetico ed epigenetico dei singoli pazienti. Tuttavia, le loro applicazioni pratiche sono spesso ostacolate da difficoltà nella standardizzazione della generazione e caratterizzazione degli organoidi. Per superare queste sfide, un approccio che utilizza PDIO derivati da sospensione a cellula singola o a cellul...

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Dichiarazioni

Jordan E. Axelrad ha ricevuto finanziamenti di ricerca da BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen e Takeda; onorarie di consulenza, onorari o commissioni di consiglio consultivo da AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda e Vedanta. K.C. è un inventore del brevetto statunitense 10.722.600 e dei brevetti provvisori 62/935.035 e 63/157.225.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970 e RS-2025-02214844, Kyung Ku Jang); una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project tramite il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) finanziata dal Ministero della Salute e del Welfare della Repubblica di Corea (RS-2024-00406488, Kyung Ku Jang); DK093668 dei National Institutes of Health (NIH) (Ken Cadwell); K23DK124570 (Jordan E. Axelrad); Fondazione Crohn & Colitis (Jordan E. Axelrad). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
[Leu15]-Gastrin I umanoSigma-AldrichG91450-0,1 mg
Valvola conica da 15 mLSPL50015
PBS 20X, pH 7,4BiosesangP2007-7.4
Tubo conico da 50 mLSPL50050
A 83-01Tocris2939-10 mg
DMEM/F-12 avanzatoGibco12634010
Axygen 1000 & micro; Punte a L, a canna larga, trasparenti, non steriliAssigenoT-1005-WB-C
Axygen 200 & micro; Punte a L, a canna larga, trasparenti, non steriliAssigenoT-205-WB-C
Integratore di B-27 (50X) senza sieroGibco17504044
Albumina sierica bovinaRoche10735078001
Micropiastre di polistirene trasparente a 96 pozzi di CorningCorning3599
Soluzione di recupero cellulare di CorningCorning354253
Matrice ECM di Corning (Matrigel di Corning) Corning356231
Piastre multiple well trattate con TC trasparenti Costar a 24 pozziCorning3526
DMEM con glucosio alto con glutammina stabile e piruvato di sodioBiowestL0103-500
GentamicinaGibco15750060
Reagente di dissociazione cellulare delicataStemcell100-0485
Proteina ricombinante FGF-basica umana (FGF-2/bFGF) (154 aa)Gibco100-18B-100UG
IGF-I umano, proteina ricombinante libera dagli animaliGibcoAF-100-11-500UG
Proteina umana di NogginAcrobiosistemaNON-H5219-1mg
Proteina umana R-Spondin 1 / RSPO1 (21-146)AcrobiosistemaRS6-H4220-1mg
Mezzo di crescita organoide IntestiCult (Umano)Stemcell6010
L-glutamina 100XBiowestX0550-100
Proteina ricombinante EGF del topoGibco315-09-100UG
N-acetil-L-cisteinaSigma-AldrichA9165-5 g
Soluzione di penicillina e streptomicina 100XBiowestl0022-100
Surrogato umano ricombinante Wnt3aAcrobiosistemaWNE-W5253-50ug
TrypLE (reagente enzimatico di dissociazione) esprime enzima (1X), nessun fenolo rosso e nbsp;Gibco12604013
Y-27632 dicloruroTocris1254-10MG

Riferimenti

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