Articolo metodologico

Imaging con cellule vive del trasporto endocitico utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura

DOI:

10.3791/69284

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17 ottobre 2025

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il trasporto endocitico e retrogrado delle proteine dalla membrana plasmatica alla rete trans-Golgi è essenziale per mantenere l'omeostasi della membrana e regolare la segnalazione. Qui, descriviamo un metodo per visualizzare e quantificare il trasporto endocitico di proteine cargo transmembrana mediante microscopia su cellule vive utilizzando nanocorpi anti-GFP derivatizzati in cellule HeLa.

Abstract

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L'endocitosi dei recettori e di altre proteine transmembrana dalla superficie cellulare agli endosomi e oltre è fondamentale per l'omeostasi, la fisiologia e la funzione. Per studiare l'assorbimento endocitico e il traffico di proteine retrograde, abbiamo messo a punto un toolkit versatile che comprende nanocorpi funzionalizzati per monitorare il trasporto dalla superficie cellulare alla rete trans-Golgi (TGN) mediante imaging su cellule fisse e vive, microscopia elettronica ed elettroforesi su gel combinata con autoradiografia. Abbiamo sviluppato nanocorpi derivatizzati che hanno come bersaglio la proteina fluorescente verde (GFP) o mCherry - leganti proteici monomerici, non reticolanti e ad alta affinità - che possono essere aggiunti a linee cellulari che esprimono proteine di membrana di interesse recanti i corrispondenti tag di fluorescenza extracellulare. Dopo il legame con reporter transmembrana marcati con GFP o mCherry, i nanocorpi vengono specificamente internalizzati e trafficati in parallelo con le vie di smistamento endogeno dei reporter. Questi nanocorpi sono stati funzionalizzati con fluorofori selezionati per tracciare il trasporto retrogrado mediante microscopia a fluorescenza e imaging dal vivo, con ascorbato perossidasi 2 (APEX2) per risolvere la localizzazione ultrastrutturale mediante microscopia elettronica e con motivi di solfatazione tirosina per valutare quantitativamente la cinetica di arrivo del TGN. In questo studio metodologico, dettagliamo il protocollo generale per l'espressione batterica e la purificazione di nanocorpi funzionalizzati, nonché la generazione di linee cellulari stabili GFP-reporter. Esemplifichiamo l'utilità di questo approccio per l'imaging di cellule vive impiegando un nanocorpo anti-GFP modificato con mCherry (VHH-mCherry) per analizzare l'assorbimento endocitico del recettore della transferrina (TfR) e del recettore del mannosio-6-fosfato cationo-dipendente (CDMPR).

Introduzione

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L'endocitosi dei recettori e di altre proteine transmembrana (TM) dalla membrana plasmatica a vari compartimenti intracellulari è importante per il mantenimento dell'omeostasi di membrana 1,2. A seguito dell'internalizzazione mediante endocitosi clatrina-dipendente o -indipendente, i carichi proteici popolano prima gli endosomi precoci da dove vengono ulteriormente smistati lungo il sistema endo-lisosomiale, riciclati nella membrana plasmatica o spediti retrogradamente alla rete trans-Golgi (TGN)3,4,5. Il riciclo dagli endosomi e/o dalla superficie cellulare al TGN fa parte del ciclo funzionale di una serie di recettori cargo transmembrana, come i recettori cationo-dipendenti e catione-indipendenti del mannosio-6-fosfato (CDMPR e CIMPR), che rilasciano idrolasi lisosomiali di nuova sintesi dal TGN agli endosomi tardivi e ai lisosomi 6,7,8, Wntless (WLS) trasporta i ligandi Wnt alla superficie cellulare9, 10,11,12, o TGN46 che scorta le proteine solubili del carico secretorio, incluso il fattore sovraregolato dal pancreas (PAUF) e altri carichi CARTS, dal TGN 13,14,15,16. Mentre tutti questi recettori cargo passano attraverso il TGN per la raccolta di nuove proteine clienti, il recettore della transferrina (TfR) che internalizza la transferrina legata al ferro è escluso dal ritorno di Golgi 17,18,19,20,21.

Per studiare il traffico endocitico e retrogrado, abbiamo precedentemente creato un kit di strumenti basato su nanocorpi progettato per etichettare e tracciare le proteine del carico dalla superficie cellulare ai compartimenti intracellulari17. I nanocorpi costituiscono una nuova classe di leganti proteici derivati da anticorpi omodimerici a catena pesante (hcAb) che si trovano naturalmente nei camelidi e nei pesci cartilaginei22,23. Rappresentano il dominio variabile della catena pesante (VHH) degli hcAb e offrono numerosi vantaggi rispetto agli anticorpi convenzionali (ad esempio, IgG): sono monomerici, piccoli (~15 kDa), altamente solubili, mancano di legami disolfuro, possono essere espressi battericamente e sono suscettibili di selezione per il legame ad alta affinità24. Per migliorare la versatilità e l'ampia applicabilità di questo kit di strumenti per nanocorpi, abbiamo impiegato nanocorpi anti-GFP funzionalizzati per marcare in superficie e tracciare le proteine marcate con tag GFP sui loro domini extracellulari o lumenali. Attraverso la coniugazione ricombinante di nanocorpi con sequenze di mCherry, ascorbato perossidasi 2 (APEX2) o tirosina solfatazione, il traffico retrogrado di proteine di carico transmembrana in buona fede può essere analizzato mediante microscopia a fluorescenza fissa e su cellule vive, microscopia elettronica o saggi biochimici utilizzando l'autoradiografia. Dato che la solfatazione della tirosina, catalizzata dalle tirosilproteine sulfotransferasi TPST1 e TPST2, è una modificazione post-traduzionale confinata al trans-Golgi/TGN, questa strategia consente la valutazione diretta della dinamica e della cinetica di trasporto dalla superficie cellulare al compartimento del Golgi 25,26,27. Più recentemente, abbiamo ampliato questo repertorio di leganti proteici funzionalizzati per includere nanocorpi anti-mCherry derivatizzati. Questi reagenti si sono dimostrati fondamentali per la dissezione delle vie di trasporto dipendenti dai macchinari delle MPR, in particolare del CDMPR17,28, al TGN attraverso analisi biochimiche.

Mentre lo studio precedente si è concentrato principalmente sull'applicazione di nanocorpi modificati con sequenze di solfatazione tirosina per valutare biochimicamente l'arrivo di TGN mediante autoradiografia19, questo articolo descrive la generazione di nanocorpi funzionalizzati marcati in fluorescenza (VHH-mCherry) e linee cellulari reporter per l'imaging di cellule vive del traffico endocitico. In combinazione con un'ulteriore proteina reporter fluorescente residente nel Golgi, questo protocollo può essere ulteriormente adattato per fungere da robusto flusso di lavoro per l'analisi quantitativa dell'imaging su cellule vive del trasporto da endosoma a TGN di proteine cargo selezionate.

Prima di applicare questo protocollo, i ricercatori dovrebbero assicurarsi che la proteina bersaglio sia espressa come un costrutto di fusione marcato con GFP, tipicamente generato da approcci di clonazione molecolare standard. I nanocorpi funzionalizzati possono essere facilmente prodotti nei batteri con rese sufficienti per esperimenti di marcatura superficiale, con concentrazioni di lavoro nell'intervallo nanomolare basso adatte per la maggior parte dei saggi di imaging di cellule vive. Gli utenti devono inoltre considerare che la cinetica di trasporto può variare tra le proteine del carico, richiedendo una regolazione della durata della marcatura o della frequenza di imaging per una visualizzazione ottimale del traffico endocitico o endosoma-TGN.

Protocollo

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1. Trasformazione batterica con VHH-mCherry

NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per l'espressione, la purificazione e l'analisi di nanocorpi anti-GFP funzionalizzati, come precedentemente descritto17. Le fasi seguenti sono adattate per VHH-mCherry e sono coerenti con la precedente relazione metodologica19.

  1. Scongelare i batteri chemiocompetenti (50-100 μL) adatti all'espressione proteica (ad esempio, cellule di Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) mettendoli su ghiaccio.
    NOTA: Preparare cellule batteriche chemiocompetenti seguendo i protocolli standard di laboratorio. A tale scopo possono essere utilizzate le celle BL21 (DE3) disponibili in commercio di NEB.
  2. Aggiungere 50 ng di un plasmide che codifica per il costrutto funzionalizzato VHH-mCherry (Addgene #109421). Per garantire un'efficiente biotinilazione sito-specifica del reporter del nanocorpo durante l'espressione batterica, co-trasformarsi con un eccesso triplo (150 ng) di un plasmide codificante per la biotina ligasi batterica BirA (Addgene #109424). Muovi delicatamente il tubo 4x-5x per mescolare le cellule e il DNA plasmidico.
    NOTA: La co-trasformazione con il plasmide codificante BirA non è necessaria se non è richiesta la biotinilazione da parte del peptide accettore della biotina (BAP).
  3. Incubare la miscela con ghiaccio per 30 minuti. Evitare l'agitazione durante questa fase.
  4. Shock termico delle cellule batteriche ponendole per esattamente 20 s a 42 °C in un bagno d'acqua o in un blocco riscaldante.
  5. Aggiungere 1 mL di terreno di brodo Luria (LB) a temperatura ambiente (RT) e incubare i batteri trasformati in un thermoshaker (250-500 giri/min) per 1 ora a 37 °C per consentire l'espressione fenotipica dei geni di resistenza agli antibiotici.
    NOTA: Per preparare 1 L LB di terreno, aggiungere 5 g di estratto di lievito, 10 g di triptone, 10 g di NaCl e aumentare il volume con acqua, quindi sterilizzare in autoclave.
  6. Pellettare i batteri mediante centrifugazione a 11.000 x g per 1 minuto e risospendere il pellet in 100 μL di terreno LB fresco. Miscelare accuratamente mediante pipettaggio.
  7. Placcare i batteri sospesi su piastre LB preriscaldate contenenti gli antibiotici appropriati (ad esempio, con 50 μg/mL di kanamicina; se co-trasformati con BirA, includere anche 50 μg/mL di carbenicillina, vedere il passaggio 1.2).
  8. Incubare le piastre LB integrate con antibiotici capovolte a 37 °C per 13-15 ore.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le piastre con colonie cresciute possono essere conservate a 4 °C e sigillate con una pellicola permeabile per evitare l'essiccazione.

2. Coltura batterica liquida e induzione dell'espressione di VHH-mCherry

  1. Selezionare una singola colonia batterica dalla piastra di trasformazione e inocularela in un pallone di Erlenmeyer contenente 20 ml di terreno LB integrato con antibiotici. Incubare la coltura in un'incubatrice vibrante per 13-15 ore a 37 °C (vedere anche la fase 1.7 relativa agli antibiotici di selezione).
  2. Il giorno seguente, diluire la coltura batterica da 20 mL per una notte in un pallone fresco contenente 1 L di terreno LB con gli antibiotici di selezione corrispondenti.
  3. Continuare a incubare a 37 °C fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,6-0,7.
    NOTA: Lasciare raffreddare la coltura a RT o a 16 °C prima dell'induzione dell'espressione proteica.
  4. Indurre l'espressione di VHH-mCherry (e BirA, se co-espressa) aggiungendo 1 mL di 1 M isopropil-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) per ottenere una concentrazione finale di 1 mM dell'induttore (diluizione 1:1000). Se è stata eseguita la co-trasformazione con il plasmide di espressione BirA, integrare anche la coltura con 10 mL di una soluzione madre di D-biotina da 20 mM, ottenendo una concentrazione finale di 200 μM di D-biotina nel terreno di crescita. Ciò facilita la biotinilazione in vivo dell'epitopo accettore di biotina (BAP) presente nel costrutto VHH-mCherry.
    NOTA: Preparare il brodo di D-biotina in ddH2O e solubilizzarlo mediante aggiunta graduale di 500 mM NaH2PO4.
  5. Incubare la coltura da 1 L indotta da IPTG per 13-15 ore a 16 °C per promuovere il ripiegamento e la resa ottimali delle proteine.
    NOTA: Le condizioni di espressione per i costrutti di nanocorpi di nuova concezione con altri tag fluorescenti possono richiedere un'ottimizzazione empirica da parte dello sperimentatore.
  6. Trasferire la coltura in un flacone da centrifugazione da 1 litro e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 x g a 4 °C per 45 minuti. Gettare il surnatante nell'apposito rifiuto organico liquido e procedere con le fasi di purificazione.
    NOTA: A questo punto il protocollo può essere messo in pausa conservando il pellet batterico a -80 °C. Il pellet VHH-mCherry appare tipicamente rosa, indicando il corretto ripiegamento della proteina di fusione fluorescente.

3. Purificazione basata su IMAC di VHH-mCherry

  1. Se necessario, scongelare il pellet batterico congelato su ghiaccio (vedere anche il passaggio 2.6).
  2. Aggiungere 30 mL di tampone legante ghiacciato (20 mM di imidazolo in 1x PBS) al pellet di cellule batteriche e risospendere accuratamente pipettando su e giù. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 50 ml etichettata.
  3. Integrare le cellule risospese con 200 μg/mL di lisozima, 20 μg/mL di DNasi I, 1 mM di MgCl2 e 1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF). Incubare la miscela per 10 minuti a RT, seguiti da 1 ora a 4 °C su un rotatore end-over-end.
    NOTA: Il PMSF è tossico. Preparare e maneggiare le soluzioni madre in una cappa per aspiranti chimici indossando guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi; smaltire i rifiuti contenenti PMSF in contenitori per rifiuti organici alogenati. Per gli esperimenti, è stata utilizzata una soluzione madre 0,1 M e ulteriormente diluita.
  4. Disgregare meccanicamente le cellule batteriche utilizzando un sonicatore a punta inserito direttamente nella sospensione. Applicare tre impulsi di sonicazione costanti di 1 minuto, consentendo un intervallo di raffreddamento di 1 minuto tra ciascun impulso con le impostazioni specificate del sonicatore (dimensione della punta della sonda: 6 mm, punta solida; Ampiezza 40%; Ciclo di lavoro (modalità a impulsi): 1 s ON/1 s OFF)
  5. Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 15.000 x g a 4 °C per 45 minuti per pellettare i detriti cellulari batterici e i batteri intatti.
    NOTA: Il lisato può essere trasferito in un flacone da centrifuga o aliquotato in provette da 5 mL per la centrifugazione da banco.
  6. Trasferire con cura il surnatante risultante in una nuova provetta da 50 ml e gettare il pellet nei rifiuti organici appropriati.
  7. Mantenere il lisato chiarificato sul ghiaccio durante la preparazione per la cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC). Per l'isolamento di nanocorpi marcati con istidina, utilizzare colonne di purificazione His-tag preconfezionate e monouso ottimizzate per il funzionamento a flusso gravitazionale.
  8. Fissare le colonne Ni-NTA (acido nichel-nitrilotriacetico) su un supporto metallico o su un supporto per colonna appropriato.
    1. Svuotare il tampone di conservazione dalle colonne ed equilibrare con 10 mL di tampone legante (20 mM di imidazolo in 1x PBS).
    2. Lasciare passare il tampone per gravità; Scartare il flusso di flusso come rifiuto organico.
  9. Applicare gradualmente il lisato batterico eliminato (~30 mL) sulla colonna. Lascialo fluire per gravità e scarta il flusso.
  10. Lavare la colonna con due volumi consecutivi da 10 mL di tampone legante (20 mM di imidazolo in 1x PBS).
  11. Eluire i nanocorpi legati con 2 mL di tampone di eluizione (500 mM di imidazolo in 1x PBS) in una provetta da microcentrifuga da 2 mL.
  12. Eseguire uno scambio di buffer.
    1. Equilibrare una colonna di desalinizzazione inserita in un adattatore per provette da 50 mL risciacquando 5 volte con 5 ml di 1 PBS.
    2. Lasciare che il tampone entri completamente nella resina impaccata; Scartare il flusso. Dopo il lavaggio finale con PBS, centrifugare la colonna a 1.000 x g per 2 min.
    3. Scartare il flusso. Posizionare la colonna con l'adattatore su una nuova provetta da 50 mL. Caricare 2 mL di nanocorpo funzionalizzato eluito (dal passaggio 3.11) sulla colonna di desalinizzazione bilanciata con PBS e centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e raccogliere l'eluato.
      NOTA: La dialisi può essere utilizzata in alternativa per lo scambio di tamponi.
  13. Quantificare la concentrazione della proteina VHH-mCherry purificata utilizzando un acido bicinchoninico (BCA) o il test Bradford secondo i protocolli del produttore.
    NOTA: Per un efficiente assorbimento dei nanocorpi nelle applicazioni di imaging di cellule vive, si raccomanda una concentrazione finale di 5-10 mg/mL.

4. Validazione dell'espressione e della purezza di VHH-mCherry (colorazione Coomassie)

  1. Preparare un gel di dodecil solfato-poliacrilammide di sodio al 10% (SDS-PAGE) secondo i protocolli di laboratorio stabiliti.
    NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare i gel a gradiente prefabbricati disponibili in commercio di Bio-Rad per comodità e riproducibilità.
  2. Aliquotare 20 μg di VHH-mCherry purificato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e denaturare facendo bollire nel tampone del campione a 95 °C per 5 minuti.
  3. Caricare il campione di nanocorpo denaturato sul gel di poliacrilammide SDS ed eseguire l'elettroforesi seguendo le procedure standard PAGE fino a quando il colorante di tracciamento (ad es. blu di bromofenolo) raggiunge il fondo del gel risolutivo.
  4. Procedere con la colorazione Coomassie e la decolorazione del gel.
    1. Estrarre con cautela il gel dalla cassetta e immergerlo nella soluzione colorante Coomassie (5% di un brodo Coomassie Brilliant Blue da 10 g/L in acido acetico al 10% e metanolo al 45% in ddH2O) per 20-30 minuti a RT su una piattaforma leggermente agitante. Assicurarsi che il gel sia completamente immerso nella soluzione colorante.
    2. Decolorare il gel utilizzando una soluzione decolorante (7,5% di acido acetico e 15% di metanolo in ddH2O), eseguendo 2-3 lavaggi sequenziali di 1 h ciascuno a RT. Per una riduzione ottimale dello sfondo, lasciare il gel per 13-15 ore in una soluzione decolorante fresca.
      NOTA: Il colorante in eccesso può essere assorbito efficacemente posizionando salviette di carta per uso domestico attorno al gel durante il processo di decolorazione. Le soluzioni coloranti/decoloranti contengono metanolo infiammabile e acido acetico irritante. Utilizzare in una cappa aspirante, indossare guanti e occhiali protettivi e raccogliere le soluzioni esaurite in appositi contenitori per liquidi infiammabili.
  5. Visualizza il gel utilizzando un sistema di documentazione del gel o una fotocamera a tua scelta.
    NOTA: Per un'ulteriore conferma dell'espressione dei nanocorpi, è possibile eseguire l'immunoblotting utilizzando anticorpi specifici per epitopi (vedere anche la Figura 1C).

5. Generazione di linee cellulari reporter HeLa marcate con GFP mediante trasduzione retrovirale

NOTA: Varie linee cellulari GFP reporter HeLa α Kyoto (qui chiamate semplicemente HeLa o HeLa α) sono state precedentemente generate17. Ai fini della dimostrazione del saggio di imaging su cellule vive, vengono utilizzati CDMPR o TfR marcati con GFP, come proteine cargo rappresentative. Mentre le proteine TM con topologia di tipo I sono marcate con GFP all'estremo N-terminale, le proteine TM con topologia di tipo II richiedono la fusione GFP C-terminale.

  1. I geni che codificano per EGFP-CDMPR (Addgene #182642) o TfR-EGFP (#243763) sono stati precedentemente subclonati nel vettore retrovirale pQCXIP utilizzando tecniche standard di clonazione enzimatica di restrizione17. Dopo la trasformazione in E. coli chemiocompetente, preparare DNA plasmidico di elevata purezza utilizzando kit di preparazione midi (ad esempio, da Macherey-Nagel).
    NOTA: Le cellule batteriche chemiocompetenti devono essere preparate seguendo i protocolli standard di laboratorio. NEB 5-alfa E. coli competente del NEB può essere utilizzato per la clonazione e la purificazione dei plasmidi.
  2. Per generare linee cellulari stabili GFP reporter HeLa, le particelle retrovirali vengono prodotte mediante trasfezione della linea cellulare di confezionamento Phoenix ampho. Tutto il lavoro di coltura cellulare è condotto in condizioni di flusso laminare BSL2.
    1. Il giorno prima della trasfezione, seminare 2,0-3,0 x 106 cellule di Phoenix ampho in un piatto di 10 cm in 10 ml di terreno per raggiungere una confluenza del 60%-80% entro il giorno successivo. Phoenix ampho sono mantenuti in DMEM GlutaMAX-I ad alto contenuto di glucosio con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 unità/mL di penicillina/streptomicina e 1 mM di piruvato di sodio.
    2. Il giorno della trasfezione, sostituire il terreno con 10 mL di terreno completo fresco.
    3. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, combinare 1 mL di DMEM GlutaMAX-I ad alto contenuto di glucosio senza siero e integratori con 10 μg di pQCXIP-EGFP-CDMPR o pQCXIP-TfR-EGFP e 30 μL di reagente di trasfezione FuGENE HD. Miscelare accuratamente mediante pipettaggio.
    4. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la formazione di complessi DNA-reagente.
    5. Aggiungere l'intera miscela di trasfezione goccia a goccia alla coltura dell'anfo della Fenice. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente i complessi.
    6. Incubare le cellule anfemo Phoenix trasfettate per 13-15 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: È possibile utilizzare linee cellulari di imballaggio alternative, a condizione che siano compatibili con il sistema vettoriale Retro-X Q.
  3. Il giorno seguente, scartare il terreno di trasfezione e sostituirlo con 7 ml di terreno completo fresco per aumentare la produzione virale.
  4. A 48 ore e facoltativamente 72 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante di coltura (~7 mL) contenente particelle virali utilizzando un coadiuvante per pipette. Monitorare l'espressione della GFP nelle cellule di Phoenix ampografate trasfettate utilizzando un microscopio a fluorescenza o un sistema di imaging (ad esempio, Bio-Rad ZOE).
    NOTA: Ancora una volta, le manipolazioni retrovirali richiedono il contenimento di BSL-2. Eseguire tutti i lavori in un armadio di biosicurezza certificato, indossare guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi e decontaminare le superfici con l'1% di esaquarti seguito dal 70% di etanolo prima di smaltire i rifiuti in autoclave.
  5. Filtrare il surnatante virale raccolto attraverso un filtro di 0,45 μm. Il surnatante filtrato può essere utilizzato immediatamente (vedere il passaggio 5.7) o conservato a 4 °C per un uso a breve termine o a -80 °C per una conservazione a lungo termine. Si noti che i titoli virali possono diminuire dopo il congelamento.
  6. Per stabilire cellule HeLa reporter GFP stabili, procedere con la trasduzione retrovirale utilizzando il surnatante virale filtrato. Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni BSL2.
    1. Un giorno prima della trasduzione, seminare circa 2,0-3,0 x 10cellule HeLa α in un piatto di 10 cm con 10 ml di terreno per raggiungere il 60%-80% di confluenza entro il giorno successivo. Coltura HeLa α cellule vengono coltivate in DMEM GlutaMAX-I ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina.
    2. Mescolare il surnatante virale filtrato con 15 μg/mL di polibrene (bromuro di esadimetrina) per migliorare l'efficienza dell'infezione.
      NOTA: Il polibrene è irritante: durante la preparazione dell'impasto, maneggiare con guanti e protezione per gli occhi, evitare la formazione di aerosol e smaltire le soluzioni contenenti polibrene come rifiuti chimici pericolosi.
    3. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura standard con un surnatante virale non diluito contenente polibrene, assicurandosi che l'intera superficie della capsula sia coperta.
    4. Incubare le cellule HeLa α in trasduzione per 13-15 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Per determinare il titolo virale, è possibile eseguire saggi seriali di diluizione e infezione su cellule HeLa α. La titolazione in questo caso è facoltativa, poiché i retrovirus infettano solo le cellule in divisione.
  7. Il giorno dopo la trasduzione, gettare il terreno virale nei rifiuti BSL2 e sostituirlo con 10 mL di terreno HeLa α completo fresco. Incubare per 13-15 ore a 37 °C con CO2 al 5%.
  8. Il giorno seguente, iniziare la selezione sostituendo il terreno con un terreno completo contenente 1,5 μg/mL di puromicina.
  9. Mantenere la pressione selettiva per 2-3 settimane, passando le cellule secondo necessità. Prima di trasferire le cellule geneticamente modificate in un ambiente BSL1, assicurarsi che siano prive di particelle virali competenti per la replicazione.
  10. Per ottenere una popolazione omogenea, utilizzare l'isolamento clonale mediante anelli o cilindri di clonazione o la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). La FACS può essere eseguita su cellule HeLa α trasdotte utilizzando FACSAria III o Fusion (BD Biosciences) per arricchire una popolazione con espressione uniforme di GFP in base all'intensità della fluorescenza.
    NOTA: L'espressione del reporter GFP nelle cellule HeLa α può essere ulteriormente convalidata mediante microscopia a fluorescenza a cellule fisse o immunoblotting con anticorpi anti-GFP (vedi anche Figura 2C).

6. Assorbimento di VHH-mCherry da parte di cellule in coltura per l'imaging di cellule vive

NOTA: Tutte le procedure di coltura cellulare vengono eseguite in condizioni sterili all'interno di una cappa a flusso laminare prima della microscopia su cellule vive.

  1. 6.1In regime di flusso laminare sterile, seminare circa 50.000-110.000 cellule HeLa che esprimono stabilmente CDMPR marcato GFP o costrutti reporter TfR in ciascun pozzetto di un vetrino da camera ibiTreat a μ vetrini a 4 pozzetti. Utilizzare 700 μL di terreno di coltura completo contenente antibiotici (DMEM ad alto contenuto di glucosio, senza rosso fenolo), integrati con il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM di l-glutammina e 1,5 μg/mL di puromicina.
  2. Incubare le cellule per 13-15 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 per consentire una corretta adesione e proliferazione. Le cellule dovrebbero raggiungere circa l'80% di confluenza entro il giorno successivo.
  3. Il giorno dell'imaging, poco prima dell'esperimento, sostituire delicatamente il terreno in ciascun pozzetto con 350 μl di terreno completo privo di rosso fenolo fresco.
  4. Parallelamente, preparare una soluzione di lavoro VHH-mCherry a una concentrazione finale di 2,5 μg/mL (circa 50 nM) in un terreno preriscaldato e privo di rosso fenolo. Mantenere la soluzione a 37 °C fino al momento dell'uso.
  5. Dopo aver inizializzato il sistema automatizzato di imaging di cellule vive (ad es. FEI MORE o Nikon Ti2 X-Light V3), preriscaldare la camera di incubazione del microscopio a 37 °C con il 5% di CO2 prima di trasferire la camera di microscopia ibidi sul microscopio e configurare le impostazioni di acquisizione come segue.
    1. Scegliete l'U PlanS Apo 100x NA 1.4 e aggiungete la camera di microscopia ibidi sul tavolino del microscopio.
    2. Configurare due canali con la lunghezza d'onda di eccitazione appropriata e i filtri di emissione passa banda singola per EGFP (es: 470/20 nm, em: 517/20 nm) e mCherry (es: 550/15 nm, em: 590/20 nm).
    3. Scegliere un tempo di esposizione breve e una bassa intensità di illuminazione per evitare il fotobleaching (ad esempio, 50 ms e 5% di potenza per EGFP, 160 ms e 25% per mCherry). È importante che i valori scelti siano mantenuti costanti per tutti gli esperimenti.
    4. Per condizione (=bene), memorizza le coordinate di 10 diversi campi visivi con 3-4 celle a fuoco in un elenco di punti.
    5. Immagine di ogni posizione in questo elenco di punti una sola volta con una singola istantanea. Queste sono le immagini di riferimento prima dell'aggiunta di VHH-mCherry.
    6. Per avviare l'assorbimento endocitico, aggiungere delicatamente 350 μl della soluzione preriscaldata di VHH-mCherry a ciascun pozzetto, garantendo un disturbo minimo al monostrato cellulare. Continuare l'incubazione a 37 °C con CO2 al 5%.
    7. Fotografa ripetutamente ogni punto dell'elenco dei punti in un esperimento time-lapse per 100 fotogrammi con un ritardo di 36 s tra i fotogrammi a 37 °C con il 5% di CO2.
    8. Per ridurre il fotobleaching, ordinare l'acquisizione dei canali per l'immagine prima mCherry, poi EGFP.
    9. Per aumentare la produttività, ordinare all'acquisizione di acquisire prima tutte le posizioni in sequenza e ripetere l'operazione per ogni punto temporale.

7. Analisi delle immagini della captazione endocitica di VHH-mCherry

  1. Pre-acquisizione delle immagini post-acquisizione ed estrazione dei dati nelle Fiji.
    1. Carica l'immagine time-lapse utilizzando il plug-in di importazione Bio-Formats con l'opzione di divisione dei canali attivata.
    2. Correggi la deriva laterale utilizzando il plug-in MultiStackReg. Utilizzare il canale EGFP come riferimento e applicare la trasformazione anche al canale mCherry.
    3. Per cella, disegna una regione di interesse (ROI) con lo strumento poligono (ad esempio, intorno alla regione perinucleare) e aggiungila al gestore ROI.
    4. Per entrambi i canali, misurare l'intensità media in tutte le ROI e i punti temporali utilizzando la funzione Multi misura del ROI manager e salvare la tabella risultante come file di testo.
    5. Aprire l'immagine di riferimento corrispondente e ripetere la misurazione per ogni ROI.
  2. Analisi dei dati per determinare le curve di captazione endocitica
    1. Apri il file di testo e sottrai ogni numero di fotogramma per 1 in modo che inizi da 0, quindi moltiplica ogni numero di fotogramma per il ritardo tra i fotogrammi in s (ad esempio, 36).
    2. Per ogni ROI, sottrarre l'intensità media nel canale VHH-mCherry dell'immagine di riferimento da ciascun fotogramma dell'immagine time-lapse corrispondente nel canale VHH-mCherry per rimuovere l'autofluorescenza e lo sfondo.
    3. Per ogni fotogramma e ROI, dividere l'intensità VHH-mCherry sottratta dallo sfondo per l'intensità media dei canali EGFP per tenere conto delle fluttuazioni di intensità all'interno del ROI diverse da VHH-mCherry, ad esempio dal movimento di Golgi, dalla contrazione delle celle, dalla deriva z o dalle instabilità dell'illuminazione.
    4. Normalizza la curva risultante al suo massimo.
    5. Selezionate un intervallo di fotogrammi per escludere eventuali artefatti all'inizio (ad esempio, l'aggiunta di file multimediali) o alla fine (ad esempio, deriva, sbiancamento) del time-lapse.
    6. Adatta i dati della curva con una singola funzione di decadimento esponenziale che modella un processo cinetico del primo ordine:
      figure-protocol-1
      dove I(t) è l'intensità normalizzata al tempo t, e t0 rappresenta il ritardo temporale tra l'aggiunta di VHH-mCherry e l'inizio della registrazione. A partire dalla costante di velocità k, calcolare l'emivita τ1/2 del processo come:
      figure-protocol-2
      NOTA: Quando si conduce un esperimento con più campi visivi (FOV) per punto temporale, ogni t0 corrispondente potrebbe essere leggermente diverso, ma dovrebbe aumentare a valori più alti da un FOV all'altro.
    7. Ripetere la procedura per tutti i set di dati e riportare i valori di emivita in box plot.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per studiare il traffico di proteine retrograde verso vari compartimenti intracellulari, abbiamo recentemente messo a punto uno strumento basato su nanocorpi anti-GFP per l'etichettatura e il tracciamento delle proteine di fusione ricombinanti dalla superficie cellulare17. Qui, descriviamo la produzione batterica di tali nanocorpi derivatizzati e dimostriamo la loro utilità nel monitoraggio dell'assorbimento endocitico mediante imaging di cellule vive. In combinazione con un reporter fluorescente residente nel Golgi, questo protocollo offre una solida piattaforma per studiare quantitativamente il trasporto retrogrado di proteine cargo selezionate alla rete trans-Golgi (TGN) in tempo reale.

Abbiamo generato una collezione di nanocorpi anti-GFP funzionalizzati distinti che condividono un'architettura modulare comune, utilizzando tecniche di clonaggio molecolare standard17. Sebbene l'attuale studio si concentri sulla variante fluorescente VHH-mCherry, includiamo anche ulteriori nanocorpi derivatizzati per illustrare la versatilità di questo set di strumenti ed evidenziare il loro potenziale per applicazioni future. Il nostro costrutto più elementare, VHH-std (std per standard), comprende il dominio VHH, gli epitopi T7 e HA per la rilevazione basata sugli anticorpi, un tag C-terminale esaistidina (His6) per la purificazione e una sequenza di peptide accettore di biotina (BAP) per consentire la biotinilazione enzimatica e i saggi di pulldown basati su streptavidina ad alta affinità (Figura 1A). Da questo progetto di base, sono stati sviluppati vari derivati di nanocorpi per facilitare lo studio del traffico endocitico e retrogrado attraverso l'analisi biochimica, l'imaging di cellule fisse e vive e la microscopia elettronica.

Per l'imaging del trasporto endocitico su cellule vive, abbiamo ingegnerizzato un nanocorpo fluorescente anti-GFP che incorpora un fluoroforo con spettri di eccitazione ed emissione distinti da quelli della GFP, garantendo così una separazione spettrale ottimale durante la microscopia a fluorescenza. Sulla base delle sue proprietà di ripiegamento superiori in E. coli indotta da IPTG e delle sue proprietà fotofisiche ben caratterizzate, abbiamo selezionato mCherry come tag fluorescente di scelta. Anche altri fluorofori spostati verso il rosso, come la proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP), sarebbero in linea di principio alternative adatte, ma mCherry si è dimostrato particolarmente robusto ed efficace in questo sistema.

Qual è il potenziale di altri nanocorpi funzionalizzati oltre a VHH-mCherry? Per studiare il traffico proteico dalla membrana plasmatica alla rete trans-Golgi (TGN), abbiamo sfruttato la localizzazione compartimentale specifica delle TPST, che risiedono esclusivamente nelle cisterne TGN e trans-Golgi. A tal fine, abbiamo modificato VHH-std con un motivo tandem di solfatazione tirosina (2xTS) derivato dalla proholecistochinina29 di ratto, consentendo così una lettura biochimica dell'arrivo del carico in questi compartimenti. Mentre la fusione di VHH-std con mCherry consente la visualizzazione diretta del trasporto retrogrado mediante imaging di cellule fisse o vive, la funzionalizzazione con perossidasi come APEX230 consente la localizzazione ultrastrutturale mediante microscopia elettronica, ablazione citochimica mirata o saggi di biotinilazione basati sulla prossimità. Inoltre, l'incorporazione di un sito di scissione della proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) nell'impalcatura del nanocorpo fornisce un mezzo biochimico per distinguere tra nanocorpi internalizzati e legati alla superficie (Figura 1A). In precedenza abbiamo impiegato il costrutto VHH-tev per monitorare la cinetica di riciclaggio di EGFP-CDMPR e TfR-EGFP17 legati a nanocorpi. La ricomparsa di recettori marcati con nanocorpi sulla superficie cellulare potrebbe essere facilmente rilevata applicando la proteasi TEV ricombinante per via extracellulare, con conseguente perdita specifica della cassetta dell'epitopo C-terminale del nanocorpo. Analogamente, l'inclusione di un sito di scissione TEV all'interno del nanocorpo VHH-mCherry qui presentato consente una valutazione dinamica del riciclo del reporter EGFP mediante imaging di cellule vive. La funzionalizzazione con domini proteici alternativi - come fluorofori aggiuntivi, tag enzimatici o motivi di sequenza per la modifica post-traduzionale - può essere facilmente realizzata subclonando gli inserti desiderati nella spina dorsale VHH-std dai siti di restrizione SpeI ed EcoRI. Tutti i costrutti di nanocorpi anti-GFP funzionalizzati utilizzati nello studio originale17 sono stati depositati con Addgene per la distribuzione pubblica.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, tutte le varianti di nanocorpi qui illustrate sono state purificate ad alta resa e purezza (Figura 1B). Solo la fusione di mCherry ha mostrato un minore clipping proteolitico dei domini proteici dopo la purificazione (Figura 1B, corsia 5). I due prodotti di degradazione osservati corrispondono molto probabilmente ai singoli domini VHH e mCherry, come dedotto dai loro pesi molecolari apparenti e verificato dalla rilevazione di immunoblot specifici per epitopo (Figura 1C). In assenza di BirA co-espresso, VHH-mCherry si riprende tipicamente a rese di circa 20 mg per preparazione. Sulla base della nostra esperienza, la co-espressione di BirA riducecostantemente la resa dei nanocorpi di circa 1/3-1/2. La biotinilazione è stata abbastanza completa perché i nanocorpi di una miscela 1:1 con BSA sono stati completamente recuperati dalla streptavidina-agarosio (Figura 1D).

Per valutare l'idoneità di questo kit di strumenti di nanocorpi per lo studio del trasporto endocitico, abbiamo generato linee cellulari HeLa stabili che esprimono proteine del recettore di superficie marcate con EGFP con vie di traffico intracellulare distinte. Questi includevano il TfR, che passa dalla membrana plasmatica agli endosomi precoci (smistamento e riciclaggio); TGN46, che passa tra la membrana plasmatica e il TGN attraverso gli endosomi precoci; ed entrambi gli MPR, che fanno la spola tra il TGN, la membrana plasmatica e gli endosomi precoci e tardivi17. L'EGFP è stato fuso al dominio extracellulare di ciascun recettore - in particolare, inserito tra il peptide segnale e la sequenza recettoriale per CDMPR, CIMPR e TGN46 - e al C-terminale di TfR. Questo design ha preservato i domini citoplasmatici nativi, assicurando che tutti i segnali di smistamento noti rimanessero intatti e che il tag EGFP fosse accessibile per il legame da parte dei nanocorpi anti-GFP extracellulari (Figura 1E). Per la CIMPR, il cui dominio extracellulare è insolitamente grande, è stata utilizzata una versione tronca, coerentemente con studi precedenti che dimostravano che tale troncamento preserva il normale comportamento di traffico31,32.

Le linee cellulari stabili sono state stabilite mediante trasduzione retrovirale, seguita da smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare popolazioni cellulari omogenee con livelli di espressione moderati e comparabili. Da notare che EGFP-CDMPR è apparso costantemente come una doppia banda negli immunoblots, simile alla sua controparte endogena33, indicativa di glicosilazione eterogenea. Per valutare se le proteine di fusione EGFP ricapitolano la localizzazione allo stato stazionario e i pattern di espressione delle proteine endogene, le cellule che esprimono stabilmente sono state co-coltivate con cellule HeLa parentali e analizzate mediante microscopia a fluorescenza confocale (Figura 2B). Il segnale EGFP rispecchiava fedelmente la distribuzione delle corrispondenti proteine endogene. Come previsto, CDMPR, CIMPR e le loro versioni marcate con EGFP sono localizzate prevalentemente nella regione perinucleare - riflettendo TGN e compartimenti endosomiali tardivi - con marcatura aggiuntiva negli endosomi periferici. Sia il TGN46 endogeno che quello marcato con EGFP sono stati trovati quasi esclusivamente nel TGN perinucleare, mentre TfR e TfR-EGFP hanno mostrato la caratteristica distribuzione precoce degli endosomi, con prominenti endosomi periferici di smistamento e riciclaggio perinucleare. Sebbene gli anticorpi utilizzati abbiano rilevato sia la forma endogena che quella marcata con EGFP (ad eccezione di CIMPR), l'intensità complessiva della colorazione non è risultata marcatamente aumentata nelle cellule che esprimono le proteine di fusione, suggerendo che i costrutti di EGFP non erano sostanzialmente sovraespressi. Abbiamo incluso EGFP-TGN46 e EGFP-CIMPR nella Figura 2B per un confronto diretto con EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. I protocolli utilizzati per la fissazione cellulare e l'imaging al microscopio a fluorescenza sono descritti in studi precedenti17,19.

Utilizzando VHH-mCherry, il trasporto endocitico delle proteine reporter marcate con EGFP può essere monitorato mediante imaging su cellule vive. Per questo, abbiamo usato come esempi cellule che esprimono EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. Le cellule sono state acquisite nel tempo con un microscopio fluorescente a campo largo invertito dopo l'aggiunta di VHH-mCherry al mezzo (Video 1 e Video 2). Nella Figura 3 sono mostrate le immagini fisse in vari punti temporali. L'assorbimento è stato quantificato misurando il segnale nel canale mCherry, sottraendo il fondo di autofluorescenza e normalizzando il segnale EGFP per eliminare le fluttuazioni dovute al movimento dei compartimenti marcati o a potenziali piccoli spostamenti nel piano focale. La fluorescenza di VHH-mCherry nel mezzo a 25 nM era trascurabile e non interferiva con le misurazioni. L'analisi del trasporto dei reporter dalla superficie cellulare ai loro compartimenti intracellulari, alla distribuzione allo stato stazionario, ha prodotto gli stessi risultati cinetici degli esperimenti biochimici mostrati nella Figura 2 della precedente pubblicazione17, con emivite apparenti di assorbimento di ~9 min per EGFP-CDMPR e ~4 min per TfR-EGFP, e saturazione dopo ~43 min e ~20 min, rispettivamente. Questi valori sono stati confrontabili con i valori ottenuti da esperimenti di captazione biochimica utilizzando saggi di immunoblotting17. In linea di principio, può essere analizzata anche la cinetica del trasporto retrogrado nelle regioni subcellulari di interesse, come la regione perinucleare con la più alta concentrazione di MPR. Tuttavia, la regione perinucleare contiene non solo Golgi/TGN, ma è anche arricchita in endosomi tardivi e endosomi di riciclo. La cinetica dell'assorbimento dei nanocorpi nella regione perinucleare non è sufficientemente specifica per analizzare il trasporto retrogrado verso un organello definito. Per valutare in modo più affidabile il trasporto tra membrana plasmatica e TGN, un'altra proteina fluorescente, una proteina transmembrana residente nel TGN, deve essere co-espressa stabilmente insieme alla proteina reporter GFP, in modo che non vi sia sovrapposizione spettrale delle proprietà del fluoroforo. L'utilizzo di questo marcatore aggiuntivo consente la rilevazione di VHH-mCherry importato dal reporter, analogamente alla solfatazione della tirosina mediata dai TPST, come precedentemente documentato19.

figure-results-1
Figura 1: Progettazione e produzione di nanocorpi derivatizzati per il tracciamento di proteine di superficie cellulare marcate con EGFP. (A) Panoramica schematica dei nanocorpi derivatizzati. Il costrutto standard del nanocorpo comprende un dominio VHH specifico per GFP, tag di epitopi T7 e HA, un peptide accettore di biotina (BAP) e un tag di esaistidina C-terminale (His6) per la purificazione. Ulteriori varianti di nanocorpi includono modifiche con siti tandem di solfatazione della tirosina (2xTS), la perossidasi ingegnerizzata APEX2 o la proteina fluorescente mCherry. La barra della scala indica la lunghezza dell'amminoacido (aa). (B) I nanocorpi espressi battericamente e purificati per affinità (20-50 μg) sono stati analizzati mediante gradiente SDS-PAGE e visualizzati mediante colorazione Coomassie. Gli standard di peso molecolare (in kDa) sono indicati a sinistra. Un piccolo clipping proteolitico è stato osservato solo per VHH-mCherry, probabilmente tra i domini VHH e mCherry. (C) Analisi immunoblot di preparati di nanocorpi (10 ng) utilizzando anticorpi diretti contro gli epitopi T7, HA oHis 6 , o rilevati da streptavidina-HRP (SA-HRP) per la valutazione della biotinilazione. (D) L'entità della biotinilazione dei nanocorpi è stata valutata incubando nanocorpi in un rapporto 1:1 con BSA, seguita da pulldown streptavidina-agarosio, pellettazione e lavaggio delle perle. Volumi uguali del surnatante (S) e del materiale legato a perline (B) sono stati successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione di Coomassie. Il recupero quantitativo del nanocorpo nella frazione legata alle perle indica una biotinilazione completa. La presenza di frammenti VHH e mCherry nella frazione legata suggerisce una degradazione parziale, che probabilmente si verifica durante la preparazione del campione per l'analisi SDS-PAGE. La linea bianca tra le corsie 2 e 3 indica la soppressione di due corsie non correlate. Questa cifra è stata modificata da17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Espressione e localizzazione intracellulare di recettori cargo marcati con EGFP marcati in fluorescenza. (A) Rappresentazione schematica dei costrutti di fusione di EGFP. Le sequenze derivate da proteine transmembrana secretorie sono rappresentate in nero, con peptidi segnale N-terminali e domini transmembrana interni evidenziati in giallo. La porzione EGFP è illustrata in verde. Sono stati generati costrutti a lunghezza intera per CDMPR, TfR e TGN46, mentre una variante troncata ben caratterizzata è stata utilizzata per CIMPR per preservare il normale comportamento di traffico. La barra della scala indica la lunghezza dell'amminoacido (aa). EGFP-CDMPR e TfR-EGFP sono stati descritti in precedenza17. (B) Per valutare la localizzazione subcellulare, le cellule HeLa che esprimono stabilmente le proteine di fusione EGFP sono state co-coltivate con cellule HeLa parentali e analizzate mediante microscopia a fluorescenza. La barra della scala rappresenta 10 μm. (C) Le cellule HeLa che esprimono stabilmente proteine reporter marcate con EGFP sono state lisate e gli estratti proteici sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguito da immunoblotting utilizzando anticorpi contro GFP e actina. I marcatori di peso molecolare (in kDa) sono indicati a destra. Questa cifra è stata modificata da17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Imaging su cellule vive della cinetica di captazione endocitica dei nanocorpi mediata da EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. L'imaging su cellule vive è stato eseguito in seguito all'aggiunta di 25 nM di VHH-mCherry a cellule HeLa che esprimono stabilmente (A) EGFP-CDMPR o (B) TfR-EGFP in terreno completo privo di rosso fenolo a 37 °C. Le cellule sono state visualizzate nei canali GFP e mCherry utilizzando un microscopio a fluorescenza semiautomatico a campo largo a intervalli di 36 s. Vengono mostrate immagini fisse unite rappresentative, accompagnate da viste ingrandite della regione perinucleare (ingrandimento: 2,2x) nei singoli canali sottostanti. (Barre della scala, 10 μm.) Vedere anche Video 1 e Video 2. L'analisi quantitativa della cinetica di assorbimento dei nanocorpi in (C) EGFP-CDMPR e (D) TfR-EGFP è stata eseguita utilizzando i dati di tre esperimenti indipendenti, ciascuno dei quali ha catturato circa 40 singole cellule. Per tenere conto del movimento degli organelli e della variabilità del piano focale, l'intensità della fluorescenza di mCherry è stata normalizzata (norma) al segnale GFP e tracciata come media ± SD in tutte le cellule dei tre esperimenti. Il segnale medio di assorbimento massimo è stato normalizzato a 1. La cinetica di assorbimento per ciascuna cellula è stata adattata individualmente utilizzando un modello cinetico del primo ordine. Le linee tracciate rappresentano le curve medie derivate dalla media delle costanti di velocità corrispondenti. Questa cifra è stata modificata da17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Imaging su cellule vive dell'assorbimento del nanocorpo mCherry da parte di EGFP-CDMPR. Le cellule HeLa che esprimono stabilmente EGFP-CDMPR sono state incubate a 37 °C in un terreno completo contenente 25 nM di VHH-mCherry e sottoposte a imaging in entrambi i canali di fluorescenza EGFP e mCherry a intervalli di 36 s. Il filmato è stato renderizzato a una velocità di riproduzione di 5 fotogrammi/s, corrispondente a una compressione in tempo reale di 3 minuti/s. Questo film è stato modificato da17. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Imaging su cellule vive dell'assorbimento del nanocorpo mCherry da parte di TfR-EGFP. Le cellule HeLa che esprimono stabilmente TfR-EGFP sono state incubate a 37 °C in terreno completo integrato con 25 nM di VHH-mCherry e sottoposte a imaging per EGFP e fluorescenza mCherry a intervalli di 36 s. Il filmato è stato renderizzato a 5 fotogrammi/s, che rappresenta una velocità time-lapse di 3 minuti/s. Questo film è stato modificato da17. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I nanocorpi rappresentano una classe in rapida ascesa di scaffold leganti le proteine che offrono numerosi vantaggi rispetto agli anticorpi convenzionali: sono piccoli, altamente stabili, monomerici, non reticolari, privi di legami disolfuro e possono essere selezionati per il legame ad alta affinità24. Nel nostro studio precedente, abbiamo sviluppato e applicato nanocorpi funzionalizzati prodotti dall'espressione batterica per marcare le proteine esposte in superficie e monitorare il loro traffico intracellulare verso vari compartimenti, con particolare attenzione al trasporto retrogrado verso la rete trans-Golgi (TGN)17. Abbiamo utilizzato un nanocorpo anti-GFP per garantire la versatilità, consentendo il targeting di proteine di fusione marcate con GFP extracellulare, YFP o mCeruleano, tag fluorescenti ampiamente disponibili e spesso già caratterizzati. La funzionalizzazione del nanocorpo anti-GFP con motivi di solfatazione mCherry, APEX2 o tirosina ci ha permesso di visualizzare l'assorbimento del carico mediante imaging di cellule vive e fisse, localizzare compartimenti di trasporto retrogrado a livello ultrastrutturale, eseguire ablazione mirata dei compartimenti e valutare quantitativamente la cinetica di trasporto al TGN. Una limitazione di questo approccio è il prerequisito della modificazione genetica delle linee cellulari bersaglio - sia per sovraespressione stabile che per marcatura endogena - prima che i nanocorpi anti-GFP funzionalizzati possano essere efficacemente impiegati. Tuttavia, questa strategia può essere facilmente adattata al crescente repertorio di nanocorpi diretti contro proteine bersaglio endogene non marcate generate attraverso l'immunizzazione animale o la selezione in vitro da librerie VHH sintetiche utilizzando tecnologie di visualizzazione di ribosomi o fagi34. Inoltre, negli ultimi anni sono stati sviluppati nanocorpi mirati a tag di epitopi comunemente usati, come mCherry, V5 o ALFA 35,36,37. In particolare, abbiamo recentemente utilizzato un nanocorpo anti-mCherry competente per la solfatazione per studiare il traffico retrogrado di CDMPR nelle cellule HeLa deplete di GGA2 attraverso una rapida inattivazione funzionale28. I tag di epitopi piccoli offrono il vantaggio di preservare la conformazione e la funzione nativa della proteina bersaglio, poiché è meno probabile che interferiscano con i domini strutturali critici. I nanocorpi che riconoscono questi epitopi compatti (ad esempio, ALFA, V5) possono essere integrati senza soluzione di continuità nel kit di strumenti funzionali dei nanocorpi per estenderne l'utilità nello studio dei meccanismi di traffico endocitico e retrogrado.

Nel presente studio, dimostriamo l'applicazione di VHH-mCherry in esperimenti di imaging di cellule vive. Utilizzando EGFP-CDMPR e TfR-EGFP come proteine reporter, siamo stati in grado di visualizzare l'assorbimento endocitario specifico del recettore e la loro progressione verso la distribuzione allo stato stazionario. L'analisi quantitativa del traffico di questi reporter dalla membrana plasmatica ai rispettivi compartimenti intracellulari ha rivelato cinetiche coerenti con quelle ottenute attraverso saggi biochimici presentati nella Figura 2 di un precedente studio17. Abbiamo scoperto che l'emivita apparente era considerevolmente più lunga per EGFP-CDMPR (~9 min) rispetto a TfR-EGFP (~4 min), con i segnali che si saturavano rispettivamente dopo circa 43 minuti e 20 minuti. Questi risultati quantitativi si allineano bene con i dati precedentemente pubblicati sulle dinamiche di traffico MPR e TfR 38,39,40. In particolare, il costrutto VHH-mCherry ha raccolto una notevole attenzione da parte della comunità di ricerca, come evidenziato da numerose richieste di distribuzione di Addgene, ed è già stato implementato con successo in diversi studi indipendenti 28,41,42,43,44.

A seconda della configurazione del microscopio o dei requisiti sperimentali, i nanocorpi anti-GFP marcati con mCherry potrebbero non essere sempre ottimali. In tali casi, fluorofori alternativi o varianti proteiche fluorescenti possono fornire proprietà spettrali più adatte se utilizzati in combinazione con linee cellulari reporter GFP. Per risolvere questo problema, abbiamo creato una libreria di nanocorpi funzionalizzati che incorporano una vasta gamma di proteine fluorescenti, tra cui mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 e iRFP670 (243764-68). Questi ulteriori costrutti di nanocorpi saranno resi disponibili tramite Addgene. L'uso di fluorofori spettralmente distinti consente una chiara separazione dei segnali di eccitazione e di emissione, facilitando così l'imaging ottimale in tempo reale di un massimo di tre canali di fluorescenza con una sovrapposizione spettrale minima.

Mentre il monitoraggio dell'assorbimento endocitico allo stato stazionario può sembrare semplice, il monitoraggio del trasporto retrogrado delle proteine al TGN presenta una sfida sperimentale maggiore. Oltre a VHH-mCherry e a una proteina reporter marcata con GFP, per la visualizzazione e la quantificazione è necessario un ulteriore marcatore residente in TGN fluorescente o coniugabile con colorante. Tuttavia, alcune proteine residenti nel Golgi mostrano una parziale permeabilità sulla superficie cellulare, che può essere ulteriormente esacerbata da perturbazioni delle vie di traffico intracellulare, come quelle introdotte dalla manipolazione sperimentale dei componenti del macchinario di trasporto. Il TGN46, ad esempio, è comunemente usato come marcatore residente nel Golgi nonostante il suo ruolo funzionale come recettore del carico che media il trasporto di superficie da TGN a cellula di alcuni carichi secretori 16,45. Allo stesso modo, sono state rilevate anche glicosiltransferasi come la β-1,4-galattosiltransferasi a livello della membrana plasmatica41. Sebbene queste proteine possano raggiungere la superficie, la loro localizzazione predominante allo stato stazionario rimane all'interno del TGN. Etichettare tali marcatori con una proteina fluorescente spettralmente distinta o un tag compatibile con un colorante (ad esempio, SNAP, Halo, ecc.) e co-esprimerli stabilmente con un reporter transmembrana marcato con GFP consentirebbe l'imaging quantitativo dell'arrivo di TGN su cellule vive. Questo potrebbe essere misurato in modo analogo al flusso di lavoro descritto sopra, con la quantificazione basata sull'accumulo del segnale mCherry all'interno del canale di fluorescenza corrispondente alla proteina di fusione residente nel Golgi. Le attuali strategie per studiare il traffico retrogrado in cellule fisse o vive spesso si basano su costrutti recettoriali chimerici in combinazione con anticorpi IgG (ad esempio, CD8)46,47. Tuttavia, il rischio intrinseco di cross-linking dovuto alla bivalenza delle IgG convenzionali durante la marcatura superficiale può alterare significativamente il destino intracellulare della proteina marcata, reindirizzandola frequentemente verso la degradazione lisosomiale dopo l'endocitosi48,49. Al contrario, i nanocorpi, a causa della loro natura monovalente e della stechiometria di legame 1:1, non inducono la reticolazione, preservando così le vie fisiologiche di traffico della proteina bersaglio. Ciò rende gli approcci basati sui nanocorpi particolarmente preziosi per studiare le autentiche dinamiche di trasporto retrogrado senza introdurre artefatti di instradamento artificiale.

Le prestazioni ottimali di questo protocollo per l'imaging di cellule vive richiedono un'attenta titolazione della concentrazione del nanocorpo, poiché quantità eccessive portano a un'elevata fluorescenza di fondo dal nanocorpo non legato nel mezzo. Inoltre, durante la titolazione è necessario tenere conto delle differenze nei livelli di espressione delle linee cellulari reporter GFP per garantire un confronto quantitativo accurato. Per la produzione di nanocorpi, l'induzione a bassa temperatura in E. coli è fondamentale per promuovere il corretto ripiegamento del dominio mCherry. Temperature di induzione più elevate in genere provocano un ripiegamento errato o una degradazione delle proteine e pertanto non sono raccomandate.

Il successo di questo protocollo dipende in modo critico da tre aspetti chiave: in primo luogo, l'espressione ad alto rendimento e la purezza dei costrutti funzionali di nanocorpi per garantire un'etichettatura coerente e un background minimo; in secondo luogo, l'uso di linee cellulari ben caratterizzate che esprimono stabilmente proteine reporter marcate con GFP con localizzazione della superficie cellulare per ricapitolare le vie fisiologiche di traffico; e in terzo luogo, la gestione e la configurazione ottimali della configurazione della microscopia a fluorescenza, compresi i parametri di imaging e la separazione spettrale, per consentire un'analisi quantitativa e qualitativa accurata delle dinamiche del trasporto merci.

Il metodo e il protocollo qui presentati, incentrati sull'uso di nanocorpi anti-GFP marcati con mCherry, consentono il tracciamento sia quantitativo che qualitativo delle proteine cargo dalla superficie cellulare ai compartimenti endocitici nelle cellule di mammifero in coltura. Quando co-espresso con un marcatore residente nel Golgi marcato in fluorescenza, questo approccio consente ulteriormente l'analisi delle vie di trasporto retrogrado. In quanto tale, questo strumento fornisce una potente strategia per monitorare il traffico intracellulare delle proteine transmembrana della superficie cellulare e dei recettori che in precedenza erano inaccessibili alla marcatura a causa dell'assenza di ligandi specifici o reagenti leganti monomerici compatibili.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università di Basilea. Ringraziamo il Prof. em. Dr. Martin Spiess per la creazione e l'impaginazione delle figure, l'Imaging Core Facility (IMCF) del Biozentrum per il supporto e PNAS per il permesso di ristampa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpi anti-GFP  Sigma-Aldrich118144600001Il prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche
Antamiche da 100 mm per coltura cellulareTPPTPP93100
Anticorpo anti-attinaEMD Millipore MAB1501
Anticorpo anti-HADal laboratorioRealizzato con 12CA5 ibridoma
Anticorpo Anti-His6Laboratori Bethyl & nbsp;A190-114A
Anticorpi anti-T7  Laboratori Bethyl & nbsp;A190-117A
BL21(DE3) Competent E. coliNEBC2527H
Cloruro di calcio diidratoMerck Millipore102382disciolto in acqua sterile, il stock è 1 M
Carbenicillina sale disodicoApplichemA1491disciolto in acqua sterile, il stock è 100 mg/mL
Coomassie-R (Blu brillante)Sigma-AldrichB-0149
D-biotinaSigma-AldrichB4501sciolto in NaH2PO4 4 sterile o DMSO
Colonne di desalinizzazione usa e getta PD10GE HealthcareGE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-IThermo Fisher Scientific61965026
DMEM, glucosio alto, niente glutammina, niente fenolo rossoThermo Fisher Scientific31053028
DNasi IApplichemA3778disciolti in acqua sterile
Dulbecco' s fosfato salare tamponata (DPBS) senza Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher ScientificA5256701
Filtropur S, PES, Porengrö ß e: 0,45 & micro; mSarstedt83.1826
Reagente di trasfezione FuGENE HDPromega E2311
Copertine in vetro (n. 1.5H)VWR631-0153
HRP anti-topo di capraSigma-AldrichA-0168
Capra anti-coniglio HRPSigma-AldrichA-0545
Il suo kit di protezioneCytvia11003400
Le sue colonne GraviTrapCytvia11003399
ibidi µ-Slide 4 well, ibiTreat80426-IBIibidi
Isopropil-β-D-tiogalattiopiranoside (IPTG)ApplichemA1008disciolto in acqua sterile, il stock è 1 M
Kanamicina solfatoApplichemA1493disciolto in acqua sterile, il stock è 100 mg/mL
L-glutaminaApplichemA3704
Lisozima & nbsp;Sigma-Aldrich18037059001Il prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche
Cloruro di magnesio esaidratoMerck Millipore105833disciolto in acqua sterile, il stock è 1 M
Mini gel TGX proteici, 4-20%, 15-pozziBio-Rad4561096
HeLa Kyoto modificataDal laboratorio
NEB5-alpha Competent E. coliNEBC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 preparativiMacherey-Nagel  740412.1
Penicillina/StreptomicinaBioconcept 4-01F00-H
Fenilmetilsolsolfinilfluoro (PMSF)ApplichemA0999.0025disciolto in DMSO al 60% isopropanolo, stock in 500 mM
Linea cellulare Phoenix amphoLaboratorio Nolan
Polibrene (bromuro di esadimetrina)Sigma-AldrichH9268
PuromicinaInvivogenANT-PR-1
Cloruro di sodio  Merck Millipore106404disciolto in acqua sterile, il stock è di 5 M
Piruvato di sodio  Thermo Fisher Scientific11360039
Trans-Blot Turbo Pack, miniBio-Rad1704158
TriptoneApplichemA1553
Estratto di lievito  ApplichemA1552

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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