Questo protocollo stabilisce una definizione oggettiva di sufficienza dell'innesto basata sull'output giornaliero di urina e sui valori del pannello di funzione renale sierica per caratterizzare in modo riproducibile e oggettivo se l'innesto è in grado di sostenere indipendentemente l'omeostasi senza dipendere dalla dialisi nei primi 7 giorni dopo il trapianto.
Articolo metodologico
Un protocollo standardizzato di autotrapianto renale suino per studiare la funzione ritardata dell'innesto
In questo articolo
Sommario
Abstract
La funzione ritardata dell'innesto (DGF) è comunemente definita come la necessità di dialisi entro 7 giorni dal trapianto renale; tuttavia, le definizioni attuali spesso si basano su giudizio clinico soggettivo e mancano di criteri standardizzati che descrivano con precisione la sufficienza del trapianto. Questa incoerenza ostacola la diagnosi e i confronti nella ricerca. Questo protocollo stabilisce soglie oggettive per la DGF utilizzando valori quantificabili di output urinario e funzione renale sierica per descrivere oggettivamente la sufficienza dell'innesto e la capacità indipendente di mantenere l'omeostasi. La ricerca nei modelli suini è impegnativa a causa dell'assenza di endpoint diagnostici consensuali per la DGF e della difficoltà di eseguire la dialisi per lunghi periodi. Per affrontare questo problema, introduciamo un protocollo chiaramente definito per definire e indurre la DGF nell'autotrapianto renale suino dopo 30 minuti di ischemia isolata al caldo renale, simulando una procura simile alla morte circolatoria (DCD). Descriviamo metodi di cateterismo di Foley non invasivo, accesso venoso centrale e monitoraggio della linea arteriosa nelle femmine suini, consentendo una misurazione accurata dell'output urina, analisi giornaliere e monitoraggio intraoperatorio. Queste tecniche sono dettagliate per garantire trasparenza e riproducibilità, creando un endpoint standardizzato per gli studi DGF nei suini che ricapitola il fenotipo clinico.
Introduzione
La lista d'attesa per il trapianto di rene negli Stati Uniti supera i 90.000 pazienti. A causa della carenza di innesti, vengono eseguiti meno di 30.000 trapianti di rene all'anno, mentre una coorte simile di nuovi pazienti si aggiunge alla listad'attesa 1. Per affrontare questa carenza in peggioramento, si scelgono sempre più reni con DCD danneggiati da ischemia subottimali. Infatti, dal 2023, il 50% dei reni trapiantati negli Stati Uniti proviene da donatori con DCD. I reni con DCD sono associati ad alti tassi di ritardo nella funzione dell'innesto (DGF). La DGF è definita dalla maggior parte come un requisito di dialisi entro 7 giorni dal trapianto di rene. Sebbene la DGF sia un'insufficienza temporanea dell'innesto, è associata a tassi aumentati di rigetto precoce e tardivo dell'innesto e a una sopravvivenza mediana dell'innesto più breve, di 8-12anni. Essendo per lo più una definizione clinica soggettiva, la DGF è difficile da studiare nei modelli suini a causa della mancanza di una definizione oggettiva e standardizzata e delle sfide della dialisi a lungo termine nei suini. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un protocollo oggettivo e standardizzato per definire la sufficienza del trapianto di innesto e indurre la DGF nell'autotrapianto renale suino. Grazie alle somiglianze comprovate dalla xenotrapiante nella funzione dei reni suini e umani, questo protocollo è traducibile al trapianto di rene umano. Per questo modello è stato scelto l'autotrapianto renale suino per il motivo principale di isolare l'effetto della lesione ischemia-reperfusione come variabile che controlla l'insufficienza precoce del trapianto e neutralizza l'alloimmunità o la tossicità immunosoppressiva come confondenti.
Definizione di funzione ritardata dell'innesto: Per superare le due principali sfide: 1) definire oggettivamente l'insufficienza dell'innesto e 2) definire la natura temporanea del fenotipo in assenza di supporto dialitico come ponte per il recupero funzionale dell'innesto, abbiamo utilizzato valori oggettivi di output urinoso e pannello di funzione renale per definire la malattia. Standardizzare la rianimazione volumetrica, i criteri di autotrapianto e l'assenza di compromissione anastomotica (arteria, vena o uretere), escludono una causa permanente e anatomica di insufficienza del trapianto. Abbiamo definito la funzione ritardata dell'innesto nell'autotrapianto suino come: insufficienza temporanea precoce dovuta a anuria prolungata (<100 mL/giorno) superiore a 3 giorni, portando a livelli variabili di BUN, creatinina e accumulo di potassio fino a raggiungere un obiettivo umano di K ≥ 8 mEq/L (alto rischio di aritmia cardiaca e indicazione oggettiva per dialisi urgente/emergente) in assenza di compromisso anastomotico. Sulla base di questa definizione, un innesto funzionale produce un'emissione di urina sufficiente a mantenere l'equilibrio elettrolitico e a ridurre la tendenza di BUN e creatinina. Al contrario, un innesto insufficiente non produce abbastanza urina per espellere BUN e creatinina e causare iperkalemia potenzialmente letale che richiede dialisi (o eutanasia umana in sua assenza), a causa di lesioni reversibili da ischemia-reperfusione parenchimata e non di compromissione o rigetto anastomotico irreversibile.
Protocollo
Questo studio è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali della Duke University (IACUC). In questo modello vengono utilizzati maiali Yorkshire solo femmine (per inserimento non invasivo del catetere di Foley) che pesano 40-50 kg (per comodità di dimensioni ostiali renali e uretrali per la canulazione). Questo protocollo poteva essere eseguito da un team di quattro persone: un chirurgo, un assistente, un perfusionista di organi e un responsabile dello studio (per campioni, forniture e dati).
1. Giornata postoperatoria (POD) -1 (Prelievo renale)
- Anestesia
- Pre-medicare gli animali con iniezioni intramuscolari (IM) di Ketamina (22 mg/kg) e Midazolam (0,5 mg/kg).
NOTA: Iniziare con una dose relativamente più alta di ketamina aiuta a ridurre in modo sicuro il bisogno intra-operatorio di isoflurano. - Somministrare Isoflurano inizialmente tramite cono musale all'1-1,5% (massimo 2,5%) finché mascella e via aerea superiore non si rilassano per permettere l'intubazione. Imposta il volume di marea a 7-7,5 mL/kg e la velocità di ventilazione a 18-20 respiri al minuto per mantenere livelli fisiologici di saturazione di ossigeno ePCO 2. Applica delicatamente una pomata per gli occhi e/o fissa le palpebre con del nastro adesivo per proteggerti da graffi o secchezza.
- Pre-medicare gli animali con iniezioni intramuscolari (IM) di Ketamina (22 mg/kg) e Midazolam (0,5 mg/kg).
- Posizionamento della linea centrale tunnel
- Posizionare una linea centrale a tunnel Hickman a 9,6 Fr a singolo lumen che esce dalla pelle dalla parte posteriore del maiale tra le scapole per permettere un prelievo di sangue indolore e su richiesta, permettendo però loro di sdraiarsi di lato con il minimo disagio e con basso rischio di alterazione del catetere della linea centrale (Figura 1).
- Dopo aver preparato la pelle, utilizzando un bisturi a 11 lame, eseguire tre incisioni superficiali con coltellate attraverso il derme fino allo strato di grasso sottocutaneo, tra le scapole, alla nuca e al lato anteriore destro del collo.
- Usa il tunneler per creare un tunnel sottocutaneo che collega le tre incisioni. Quando è a terra, infila il catetere da tra le scapole fino alla parte anteriore destra del collo.
- Per inserire il catetere della linea centrale nella vena giugulare esterna destra (EJ), ruota il maiale in posizione supina di Trendelenburg e si utilizza un ago finder da 18 G per aspirare l'EJ usando la tecnica di triangolazione anatomica di Flourney eMani 3. Infila un filo nel lumen usando la tecnica4 di Seldinger, usa l'introduttore peel-away per dilatare il tratto, infila il catetere Hickman nel lumen dell'EJ e fissa la linea centrale sul retro. Dopo la conferma del ritorno del sangue, l'eparina blocca la linea e ripeti dopo ogniutilizzo 5. Se accedere all'EJ destro risulta difficile, si utilizza il tunneler tissutale per estendere il tunnel sottocutaneo anteriore alla trachea e consegnare il catetere sul lato sinistro del collo per l'inserimento nell'EJ sinistro.
- Posizionare una linea centrale a tunnel Hickman a 9,6 Fr a singolo lumen che esce dalla pelle dalla parte posteriore del maiale tra le scapole per permettere un prelievo di sangue indolore e su richiesta, permettendo però loro di sdraiarsi di lato con il minimo disagio e con basso rischio di alterazione del catetere della linea centrale (Figura 1).
- Posizionamento di Foley (tre metodi per aumentare l'invasività in caso di fallimento dell'inserimento)
- Approccio manuale
- Metti l'animale supino sul tavolo operatorio. Prepara la pelle intorno alla volta vaginale con betadine e inonda la volta vaginale con 10 mL di betadine (per ridurre il carico microbico e il rischio di infezioni urinarie).
NOTA: Anche quando sono completamente gonfiati, i palloncini da 5 mL tendono a scivolare fuori. - Inserire manualmente un catetere di Foley lubrificato a 12-14 Fr, irrigidito con un filo, tastando l'apertura uretrale profonda 4-5 cm nell'apertura vaginale sulla parete vaginale anteriore (ventrale).
- Metti l'animale supino sul tavolo operatorio. Prepara la pelle intorno alla volta vaginale con betadine e inonda la volta vaginale con 10 mL di betadine (per ridurre il carico microbico e il rischio di infezioni urinarie).
- Approccio con speculo: Se l'approccio manuale fallisce, usa uno speculum lubrificato per visualizzare l'apertura uretrale all'interno della vagina. Usa le lunghe pinze DeBakey con garza sterile per asciugare delicatamente il Betadine e inserisci il catetere Foley a palloncino 12-14 Fr, 10 mL, con o senza filo di irrigidimento, sotto visualizzazione diretta. Gonfia il palloncino solo dopo aver verificato il ritorno delle urine.
- Approccio chirurgico: Se anche l'approccio dello speculo (passo 1.3.2) fallisce, inserire chirurgicamente il catetere di Foley su un filo. Dopo la laparotomia, inserisci un ago da 18 G nella vescica, inserisci un filo da 0,035" lungo circa 1 m nell'uretra attraverso la vescica, infila il catetere di Foley sopra di esso fino alla vescica e gonfia il palloncino. Ritira il filo attraverso la vagina (per evitare contaminazioni addominali) e chiudi il piccolo foro dell'ago nella vescica con una chiusura a uno strato singolo 6-0 Prolene a forma di 8. Sutura il corpo del Foley e una busta di raccolta urina da 1 L alla pelle del maiale (Figura 1).
- Approccio manuale
- Farmaci per la preincisione
- Somministrare la prima dose giornaliera di aspirina antipiastrinica 81 mg per via orale all'interno della sacca guanciale, seguita da antibiotico IM ceftiofur depot, 1 g di cefazolina endovenosa tramite linea centrale per la prevenzione dell'SSI, buprenorfina IM (0,005-0,01 mg/kg) per il controllo del dolore, e iniziare un totale di 1 L di soluzione elettrolitica bilanciata a un'infusione costante di 250 mL/h.
2. Autotrapianto renale di DCD suino sostenente la vita
- Procuramento renale
- Prepara e copri la pelle dell'addome. Esegui una laparotomia della linea mediana dallo xifoide al pube.
NOTA: Ci sono 1-2 vene grandi che attraversano la linea mediana sottocutanea vicino al pube, che sanguinano copiosamente se tagliate ma sono facilmente controllate con l'elettrocauteria. - Installare un retrattore Bookwalter (o due retrattori Balfour a 90°) con quattro lame della parete corporea che tengono entrambi i lati della parete addominale verso l'alto per prevenire fuoriuscite dell'intestino tenue dall'addome con successiva compressione venosa e linfatica e gonfiore intestinale.
- Utilizzando due asciugamani chirurgici caldi e umiditi con soluzione salina per ritrarre l'intestino sul lato sinistro dell'addome e sostituire i retrattori sopra di essi per esporre delicatamente il retroperitoneo destro contenente il rene destro.
NOTA: Un certo grado di posizione Trendelenburg (testa in basso) può aiutare anche nella retrazione intestinale. - Apri il peritoneo posteriore sul lato laterale del rene (per evitare di danneggiare l'uretere destro prima di visualizzarlo). Dissezionare l'uretere destro dal peritoneo posteriore e dall'arteria renale destra e dividerlo tra due nodi di seta 2-0 al polo inferiore del rene destro. Lasciare una coda di sutura più lunga sull'uretere rimanente per facilitare l'identificazione durante l'impianto (24 ore dopo). Lasciare il resto dell'uretere coperto dal rivestimento peritoneale per ridurre le cicatrici e la necessità di una dissezione estesa durante la seconda operazione di impianto.
NOTA: Fai molta attenzione a non danneggiare le due vene lombari che si uniscono alla IVC immediatamente sotto il decollo dell'arteria renale destra dall'aorta (anatomia specifica per suini diversa da quella retro-peritoneale umana). Legare e dividere quelle vene lombari è anche un'opzione sicura. - Dissezionare l'arteria renale lontano dalla vena renale e lungo il suo percorso sotto la VCI fino all'origine aortica per ottenere la massima lunghezza arteria disponibile. Comprimere brevemente la VCI e farla ruotare verso il retroperitoneo sinistro per esporre l'origine dell'arteria renale destra che scorre sotto di essa dopo il decollo dall'aorta addominale.
NOTA: Nei suini, tipicamente ci sono 1-2 linfonodi associati all'arteria renale che la oscurano; tuttavia, l'arteria renale diventa ben scheletrica dopo che questi linfonodi vengono dissezionati e rimossi. - Dissezionare la vena renale destra lontano dalla ghiandola surrenale destra in modo cranico. Per ottenere qualche millimetro di liberità tra la vena renale destra e la ghiandola surrenale, sollevare con attenzione il rivestimento peritoneale posteriore dalla vena renale destra fino a visualizzare le vene surrenali più grandi che drenano nell'IVC.
- Per simulare il processo di prelievo del DCD, somministrare 500 U/kg di eparina tramite la linea centrale e lasciarla circolare per 5 minuti, poi legare due volte l'arteria renale seguita dalla vena renale all'origine (per la massima lunghezza) usando elastici di seta 2-0 o maggiori (i nodi di seta 3-0 sono troppo sottili e fragili per questo tessuto aderente e scivolano frequentemente) e iniziare un cronometro per 30 minuti di trattamento in-situ Tempo ischemico isolato renale caldo. Durante il periodo ischemico caldo, usa forbici per tenotomia o elettrocauterizzazione in posizione di taglio per scheletizzare e separare l'arteria renale e la vena tra loro per facilitare l'impianto in seguito.
NOTA: Lo scheletro dei vasi in situ durante il caldo periodo ischemico sfrutta il controllo vascolare per prevenire la perdita di sangue in caso di lesione vascolare, permettendo però ai vasi pieni di sangue di rivelare eventuali piccole perdite vascolari che potrebbero essere riparate tramite emorragie dalla circolazione renale isolata legata per la simulazione della lesione ischemica. - Al termine del periodo ischemico caldo, si dividono i vasi e l'uretere e si cannula l'arteria renale con una cannula dritta di 3 mm e si somministrano 250 mL di soluzione gelida di Belzer University of Wisconsin tramite l'arteria renale.
NOTA: Una cannula dritta da 5 mm è troppo grande e potrebbe causare danni intimi e formazione di lete. - Conservare l'innesto tramite perfusione ipotermica non ossigenata per 24 ore. Irrigare l'addome con 1 L di soluzione elettrolitica bilanciata e chiudere la fascia con suture continue a 1-0 Prolene looping. Irriga la ferita e chiudi la pelle con graffette.
- Estubare il maiale, tornare nel suo terrario e riprendersi dall'anestesia per 24 ore. Per il controllo del dolore, iniettare Bupivacaine (dosaggio basato sul peso) sottocutaneamente nei bordi della ferita e somministrare Buprenorfina a rilascio prolungato intramedico (dosaggio basato sul peso).
NOTA: Anche il paracetamolo può essere somministrato senza effetto sulla GFR (a differenza dei FANS).
- Prepara e copri la pelle dell'addome. Esegui una laparotomia della linea mediana dallo xifoide al pube.
- Impianto renale
NOTA: L'impianto renale avviene intraperitoneale seguendo l'approccio modificato Starzl con impianto renale direttamente sull'aorta addominale e la VCI con anastomosi ureter-uretere6. Il rene destro viene espistato e riimpiantizzato in una posizione inferiore, invertita nel retroperitoneo destro, seguendo la tecnica Simforoosh7. Il tempo di intervento per l'impianto varia tra 3 e 5 ore, e il tempo di cucitura tra 20 e 40 minuti, a seconda del livello di formazione o competenza e della complessità dell'anatomia.- Dopo 24 ore di recupero, pre-medicare, intuba, preparare e coprire nuovamente l'addome del maiale in sala operatoria (Figura 2).
- Collocamento della linea arteriosa (tre metodi in caso di fallimento dell'inserimento)
- Linea arterio-auricolare: per monitorare l'emodinamica intraoperatoriamente e guidare la rianimazione con liquido e pressore, specialmente dopo la reperfusione, per sostenere l'animale durante la sindrome da reperfusione e non causare una lesione renale acuta a basso flusso secondaria (AKI), posizionare una linea arteriosa angiocath a 22 G nell'arteria auricolare attraverso la palpazione del polso dell'arteria auricolare sul lato posteriore di entrambe le orecchie del suino.
- Linea arteriosa carotide: Se l'inserimento auricolare fallisce, in alternativa, si crea un'incisione mediana nel collo fino alla trachea. Dissezionare il tessuto connettivo adiacente alla trachea e ritrarlo utilizzando un Weitlaner o un retrattore auto-retrattante Gelpi. Una volta visualizzato, circonda l'arteria carotide con un cravatta di seta 2-0. Inserire una linea carotide percutanea di 4 Fr Cordis tramite la tecnica di Seldinger senza la necessità di dilatazione arteriosa. Legare l'estremità distale della carotide e lasciare un nodo di seta 2-0 per legare l'estremità prossimale alla fine dell'operazione una volta rimossa la linea arteriosa, seguita da una chiusura cutanea graffettata.
- Linea arteriosa femorale. In alternativa, una linea femorale potrebbe essere inserita percutaneamente o tramite riduczione.
NOTA: Una linea femorale sarà temporaneamente resa non funzionale durante il clampaggio dell'aorta per l'anastomosi arteriosa durante l'impianto.
- Collocamento della linea arteriosa (tre metodi in caso di fallimento dell'inserimento)
- Farmaci per la preincisione
- Somministrare la seconda dose giornaliera di antipiastrine, aspirina 81 mg per via orale all'interno della sacca guanciale, seguita da 1 g di cefazolina IV tramite linea centrale per la prevenzione dell'SSI, IM Buprenorfina (0,005-0,01 mg/kg) per il controllo del dolore, e iniziare un totale di 4 L di soluzione elettrolitica bilanciata a una dose costante di infusione di 250 mL/h.
- Iniziare un'infusione costante di dopamina non titolabile attraverso la linea centrale a 2 μg∙kg-1∙min-1 e l'infusione di noradrenalina titolabile fino a un massimo di 0,4 μg∙kg-1∙min-1 per una MAP target di 80-100 mmHg.
NOTA: La velocità di somministrazione dei liquidi può essere temporaneamente aumentata a 1 L/h o superiore tramite una sacca a pressione immediatamente prima della reperfusione per fornire un migliore supporto emodinamico se l'ipotensione durante la sindrome da reperfusione è particolarmente difficile.
- Riaprire l'addome rimuovendo le graffette cutanee e tagliando le suture fasciali, e reintrodurre il retrattore Bookwalter.
- Dissezionare la copertura peritoneale del colon discendente dalla linea mediana che sovrasta l'aorta e la IVC (nei suini il colon discendente è collegato tramite una copertura peritoneale più corta alla linea mediana che sovrasta l'aorta e la IVC dai vasi renali sinistri all'arteria mesenterica inferiore per rivelare l'aorta e la VCI nel retroperitoneo (sito di inserimento del trapianto renale)8.
NOTA: Prestare molta attenzione a dividere solo l'attacco peritoneale del colon immediatamente sopra i grandi vasi e non devascolare il colon discendente dividendo le arterie mesenteriche arcuate superiore e inferiore che scorrono più vicino alla parete del colon.
Non è stata osservata alcuna ernia interna con questa manovra, come dimostrano le necropsie, che hanno rivelato che questo spazio si era già ridotto e chiuso spontaneamente entro il settimo giorno post-operatorio. - Dissezionare bilateralmente l'aorta e la vicina endovenale dal loro attacco peritoneale laterale ai muscoli psoas. Successivamente, sezionare aorta e IVC separata l'una dall'altra finché non si visualizzano le arterie e le vene lombari. Opzionale: consentire la massima elevazione e esposizione del lume dell'aorta nella pinza Satinsky durante la cucito, dissezionare, legare e dividere le 1-2 arterie e vene vertebrali che di solito si trovano in quel segmento dei grandi vasi (dai vasi renali sinistri all'arteria mesenterica inferiore) in quel segmento dell'aorta lombare tra 2-0 legami di seta. Schelettizzare la sezione lombare dell'aorta dalla sua pesante copertura avventile per prepararla all'impianto.
NOTA: Non sono state osservate complicazioni spinali con questa manovra. - Somministrare sistemicamente 100 U/kg di eparina tramite la linea centrale e lasciarla circolare per 5 minuti. Contemporaneamente, chiedi al team anestesiario di aumentare temporaneamente la velocità di infusione in soluzione elettrolitica bilanciata da 250 mL/h a 1 L/h e di iniziare a titolare la noradrenalina al bisogno fino a un massimo di 0,4 μg∙kg-1∙min-1 per ottenere una MAP di 80-100 mmHg in preparazione della sindrome da reperfusione.
- Clampa la VCI con una pinza Satinsky che morde di lato inclinata caudale (per non interferire con le mani del chirurgo di cucito posizionate sul lato sinistro del maiale) e crea una velenomia e aspira/risciacquo l'interno della IVC.
- Rimuovere il rene dal ghiaccio o dalla perfusione a macchina e lavarlo con 250 mL di soluzione elettrolitica bilanciata a ghiaccio e portarlo nel campo operatorio, segnando l'inizio del secondo tempo ischemico caldo (di cucito).
- Capovolgere l'autoinnesto del rene destro (tecnica Simforoosh) in modo che l'uretere sia puntato verso l'alto, l'arteria mediale e la vena laterale e posizionato sul lato destro dell'addome rivolto verso l'aortainfrarenale 7,9.
- Anastomosi venosa: Utilizzare due suture 6-0 Prolene a doppio braccio per eseguire un'anastomosi venosa scorrevole. Posiziona una pinza bulldog sulla vena renale e rimuovi la pinza Satinsky. Indipendentemente dal momento in cui si cuce la vena, tieni la pinza Satinsky sulla IVC per un tempo standardizzato di 25 minuti per consentire una lesione ischemica standardizzata al trapianto.
- Anastomosi arteriosa: Dopo la pinza IVC di 25 minuti e la tenuta tra i vasi e i vasi 5 minuti, usa nuovamente la pinza Satinsky per pinzare completamente l'aorta. Fai un'incisione a fessura e allargala usando un punzone da 4,0 mm per fissare un'apertura pulita. Utilizzare una sutura 6-0 Prolene a doppio braccio per eseguire un paracadutismo o un'anastomosi arteriosa da guarigione fino alla punta. Allo stesso modo, indipendentemente dalla velocità con cui si completa l'anastomosi arteriosa, tieni la pinza Satinksy per 25 minuti sull'aorta per standardizzare un tempo totale di cucitura di 55 minuti.
NOTA: Il tempo ischemico caldo totale (30 min simulando donazione e 55 min simulando la manipolazione dell'impianto) ha portato all'induzione del DGF. - Reperfusione dell'innesto: Dopo i 55 minuti standardizzati di tempo ischemico caldo di cucito, rimuovere prima la pinza bulldog sulla vena renale, seguita dalla pinza Satinksy sull'aorta, e controllare la riperfusione dell'innesto e l'emostasi. Mantenere una rianimazione aggressiva di liquidi e noradrenalina per ottenere una MAP di 80-100 mmHg per circa 1 ora dopo la reperfusione, al fine di supportare l'animale durante la sindrome della reperfusione.
NOTA: Non dimenticare di controllare qualsiasi sito di biopsia con ago da 18 G—se eseguito—con pressione e elettrocauterizzazione superficiale coagulativa elevata. - Anastomosi dell'uretere: Scheletizzare gli ureteri restanti e quelli dell'innesto rimuovendo 1 cm del tessuto adiposo circostante. Spatulate 1 cm dell'uretere dell'innesto e dell'uretere destro residuo. Usa due suture 6-0 Prolene (PDS a doppio braccio per pianificare la sopravvivenza a lungo termine per ridurre il rischio di formazione di pietre) per approssimarli. Infila uno stent ureterale doppio J 7F x 24 cm sulla nuova anastomosi e completa l'anastomosi con suture in movimento.
- Nefrectomia controlaterale
- Per permettere al rene trapiantato di essere il rene vitale, rimuovere il rene controlaterale (sinistro).
- Chiusura addominale
- Dopo aver controllato la presenza di emostasi e conteggi, irrigare l'addome con 1 L di soluzione elettrolitica bilanciata e chiudere la fascia con Prolene ad anello 1-0, seguito da irrigazione cutanea e chiusura con una cucitrice. Iniettare lo 0,25% di bupivacaina nella linea di sutura per fornire anestesia locale e iniettare SQ a rilascio prolungato sufficiente per il controllo del dolore. Estuba il maiale e riportalo nel loro terrario separato tramite barriere di vetro o plastica per evitare che si mordano le linee centrali e i cateteri di Foley.
- Dopo 24 ore di recupero, pre-medicare, intuba, preparare e coprire nuovamente l'addome del maiale in sala operatoria (Figura 2).
- Assistenza postoperatoria quotidiana
- Controlla i maiali durante i cicli QID principalmente per assicurarsi che la sacca di raccolta delle urine non si riempia troppo, causando ostruzione postrenale iatrogena e rotture della vescica o dell'uretere.
- Al mattino, somministrare un antiplastrino orale di 81 mg di aspirina, prelevare un campione di sangue dalla linea centrale e bloccarlo, e misurare l'output di urina nella sacca e campionarla.
NOTA: Non sono indicati ulteriori liquidi endovenosi o farmaci, poiché i maiali di solito riacquistano appetito e funzione intestinale con POD1.
- Sacrificio
- Al termine dello studio su POD7, o prima per un endpoint umano, si sottopone nuovamente il maiale ad anestesia endotracheale generale ed esamina l'innesto con un'ecografia per verificare l'integrità anastomica, seguita dalla riapertura dell'addome come descritto in precedenza.
- Esaminare l'innesto per segni di perfusione e esaminare le tre anastomosi per la permeabilità. Rimuovere l'innesto con le tre anastomosi intatte e spatularle lungo la lunghezza per verificarne l'integrità interna e la permeabilità.
- Biopsia del parenchima del rene con una pistola biopsica da 18 G.
Risultati
Funzione immediata vs ritardata dell'innesto. Abbiamo eseguito n = 5 auto-trapianti renali con DCD da 30 minuti dopo 24 ore di conservazione macchina ipotermica non ossigenata utilizzando (MAP = 40 mmHg) e monitorato il fenotipo del recupero e della funzione dell'innesto nella prima settimana dopo il trapianto, utilizzando campioni di sangue giornalieri e l'output totale di urina. Abbiamo osservato due fenotipi di recupero post-trapianto. Il primo fenotipo era di recupero/sufficienza immediata/precoce dell'innesto. Tre suini su cinque impiantati con i simulati innesti DCD (60%) hanno avuto un ritorno della produzione di urina (output giornaliero > 500 mL/giorno) tramite POD 2-3, consentendo un'omeostasi elettrolitica continua senza intervento (dialisi, chelazione del potassio o spostamento intracellulare mediato dall'insulina) (Figura 3). Il secondo fenotipo era la funzione ritardata dell'innesto (DGF), caratterizzata da anuria sostenuta oltre il POD 3, associata all'accumulo di BUN sierica, creatinina e allo sviluppo di iponatremia e iperkalemia, che sarebbe un'indicazione clinica oggettiva per la dialisi. Anuria e iperkaliemia sono progredite causando variazioni ECG (onde T di picco) intorno a K ≥ 8 mEq/L. Questo rappresentava un'indicazione urgente per la dialisi e fu quindi trattato come un punto finale umano. Una volta raggiunto questo punto finale, è stata eseguita l'eutanasia in anestesia generale per escludere altre cause di insufficienza/fallimento del trapianto dovuta a compromissione anastomotica o altre complicazioni chirurgiche. Utilizzando questa definizione di DGF, i reni con DCD suina con 30 minuti di ischemia calda in situ , seguiti da 24 ore di conservazione ipotermica non ossigenata e 55 minuti di cucitura in tempo ischemico caldo svilupparono DGF al 40% (due suini su cinque). Questo tasso di DGF riassume il tasso riportato nel trapianto di rene conDCD umano 1.
Figura 1: Linea centrale tunnelata e posizionamento del catetere di Foley. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Autotrapianto renale di DCD suino che sostiene la vita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Funzione ritardata dell'innesto nel modello suino. La differenza nell'output urinario (A ) tra innesti a funzione immediata e a funzione ritardata; (B) livelli di potassio tra l'innestato a funzione immediata e quella ritardata; (C) livelli giornalieri di creatinina sierica tra innesti di funzione immediata e ritardata. Tutti i dati sono rappresentati come Media + SEM con i valori riportati come LOCF e analizzati con analisi a modelli misti. Abbreviazione: LOCF = ultima osservazione portata avanti. N=5 maiali per braccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
Il ritardo nella funzione dell'innesto influisce negativamente sul decorso clinico dopo il trapianto di rene. Nel contesto precoce post-trapianto, è associata a ricovero prolungato, a un tasso più elevato di procedure invasive e a un rischio aumentato di rigetto. A lungo termine, la DGF è anche associata a una sopravvivenza più breve dell'innesto. La DGF è una manifestazione di grave lesione ischemia-reperfusione (I/RI), come dimostrato dalla sua maggiore prevalenza nei trapianti di DCD rispetto a DBD o trapianti di rene con donatore vivente. La lesione renale acuta (AKI) è secondaria a una necrosi tubulare acuta causata da I/RI ed è ritenuta la causa più comune per cui un allotrapito non funziona immediatamente. Clinicamente, il DGF è definito dalla necessità di dialisi entro la prima settimana del trapianto. Nei modelli animali di grandi dimensioni, la DGF è stata difficile da definire e studiare a causa della mancanza di una definizione standardizzata di sufficienza del trapianto e dell'impossibilità di eseguire la dialisi per accertare la natura temporanea della condizione, utilizzando la dialisi come ponte per il recupero funzionale dell'innesto.
In questo protocollo è stato scelto un modello suino poiché ampiamente accettato come strettamente parallelo alla fisiologia renale umana (come dimostrato da recenti xeno-trapianti riusciti)10,11. L'autotrapianto è stato scelto per eliminare la risposta allo-immune, il rigetto e la necessità e gli effetti tossici confondenti degli inibitori della calcineurina. La definizione di DGF si basa su un'anuria prolungata (<100 mL di urina al giorno) oltre POD3, che porta a gravi cambiamenti EKG associati all'iperkalemia. La cateterizzazione di Foley consente una raccolta precisa delle urine, che ancorano la definizione di ritardo nella funzione e nell'adeguanza dell'innesto al risultato funzionale della qualità e quantità delle urine. Il prelievo quotidiano di sangue consente la sorveglianza quotidiana dei parametri tradizionali del pannello della funzione renale, fornendo un quadro completo dell'omeostasi elettrolitica.
Stabilire un modello animale affidabile e riproducibile della funzione ritardata dell'innesto, crediamo che accelererebbe lo studio di terapie efficaci per la funzione ritardata dell'innesto e porterebbe infine a un miglioramento degli esiti del trapianto renale. In sintesi, questo protocollo stabilisce un modello riproducibile di autotrapianto renale suino che consente la caratterizzazione oggettiva della funzione ritardata dell'innesto utilizzando il debito urinario quantificabile e parametri biochimici sierici dopo una lesione ischemica calda controllata. Incorporando condizioni chirurgiche standardizzate, raccolta non invasiva delle urine e monitoraggio seriale di laboratorio, questo approccio fornisce un quadro pratico per studiare la DGF in assenza di dialisi e facilita il confronto con fenotipi clinicamente rilevanti della disfunzione post-trapianto 12,13,14,15.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il laboratorio di perfusione degli organi di Toronto (Top lab) per aver condiviso la propria esperienza durante la formazione sul trapianto di rene suino. Ringraziamo anche Michelle Mendiola Pla per aver condiviso la sua esperienza sull'inserimento non invasivo di Foley suino.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| inserimento di Foley supino | |||
| 12 Padre Foley | Raccolta di urine | ||
| Lubrificante chirurgico | Inserimento Foley | ||
| 1 L di sacchetto per l'urina | Raccolta di urine | ||
| Sutura in nylon 2-0 | Fissazione di foley e linea centrale | ||
| Speculum & lunghi debakey & Luce | Inserimento Foley | ||
| Tubi per il prelievo delle urine (50 ml conici) | Campionamento di urine | ||
| CG8 + Chem 8 + Cartucce Piccolo | Laboratori giornalieri | ||
| <>inserimento della linea centrale da propenso a supino forte | |||
| 9,6 Fr Vassoio cateteristico Hickman a un solo lumen | Laboratori giornalieri | ||
| Lama 10 | incisioni a pugnalata per l'inserimento del CVC | ||
| Linea centrale con cappuccio senza luer-lock | |||
| Sacchetto di soluzione salina (1L di soluzione fisiologica + 10 fiale di eparina) | Heplock CVC | ||
| Esplode | |||
| Pacchetto per laparotomia | |||
| Bovie | |||
| Manici sterili per luci | |||
| Pacchetto spugna | |||
| Asciugamani OR - bianchi 17X23 pollici (4 per pacchetta) | |||
| 2-0 Cravatte di seta | Controllo vascolare | ||
| 1 L Plasmalyte | Soluzione elettrolitica bilanciata | ||
| Vassoio per strumenti per laparotomia generale sterile | |||
| Soluzione fisiologica calda normale per asciugamani per intestino bagnato | Gestione intestinale | ||
| Scatola di gestione dell'ago | |||
| Trattore Bookwalter | |||
| Backtable | |||
| Sacche per organi sterili - 2 per rene | |||
| 1 L di sacco cristalloide per lo slushy | |||
| Soluzione UW - 250ml per rene | |||
| Tubazione a sciacquaggio | |||
| Angiocath calibro 14 | |||
| Drappeggiamento a macchina | |||
| Peso dell'organo (Bilancia + ciotola + Borsa sterile per organo) | |||
| Perfusione meccanica | |||
| Macchina a perfusione | Trasportatore renale Lifeport | ||
| Camera d'organo usa e getta | Trasportatore renale Lifeport | ||
| Soluzione per perfusione | Soluzione KPS-1 | ||
| Impianto | |||
| Tubi a aspirazione | |||
| Punta a aspirazione Yankauer | |||
| Contenitore a aspirazione | |||
| Zocche in gomma | |||
| Punzone aortica da 4 mm | Anastomosi Arteriosa | ||
| Strumenti di microchirurgia + pinza | |||
| Filo guida dell'uretere | |||
| Stent dell'uretere - 4,8 fr x 12 mm | Anastomosi dell'uretere | ||
| Chiusura addominale | |||
| 1 prolene ad anello | |||
| Bupivacaina | |||
| Cucitrice per pelle | |||
| Campioni | |||
| Vassoio per campioni | |||
| Canna biopsica 14 G | |||
| Barattoli per biopsia NBF | |||
| Tubi di Eppendorf | |||
| Tubi sanguigni verdi con la parte superiore | |||
| Conici da 15 mL | |||
| Farmaci | |||
| Fiala di noradrenalina | |||
| Fiala di dopamina | |||
| 1 L plasmalite | Soluzione elettrolitica bilanciata | ||
| Compresse di aspirina 81 mg post post ogni giorno | |||
| Fiala di cefazolina | |||
| Exceed | |||
| Unità di eparina 10K |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
