L'ubiquitinazione è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delle proteine. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato nelle cellule dei mammiferi e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione. La sovraespressione proteica nelle cellule di HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria, mentre proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi western blot.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Strategie comparative per il rilevamento dell'ubiquitinazione nei lisati cellulari di mammiferi utilizzando SMAD2/SMURF2 come modello
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ubiquitinazione, una modifica post-traduzionale, è un regolatore critico della funzione intracellulare delle proteine. L'ubiquitinazione modula le funzioni proteiche promuovendo la degradazione proteasomiale o alterando la localizzazione subcellulare tramite segnalazione dipendente dalla catena dell'ubiquitina. Qui descriviamo due metodi di lisi cellulare per rilevare i livelli di ubiquitinazione di SMAD2 nelle cellule HEK293T e confrontiamo la loro efficacia nell'analisi dei livelli di ubiquitinazione delle proteine. La sovraespressione proteica nelle cellule è stata indotta da trasfezione transitoria. I plasmidi (HA-Ub, FLAG-SMAD2 e MYC-SMURF2) e i reagenti di trasfezione venivano aggiunti separatamente al mezzo basale, miscelati, e la miscela veniva aggiunta alle cellule. Prima del raccolto, è stato aggiunto MG132 per inibire la degradazione proteasomologica e aumentare l'accumulo di proteine ubiquitinate. La principale divergenza tra i due approcci sperimentali riguarda i loro metodi di lisi cellulare: il metodo del bagno di ghiaccio (eseguito a 4 °C) e il metodo del trattamento termico (che prevede l'incubazione a 95 °C), che influisce sostanzialmente sull'efficienza della lisi proteica. Dopo il completamento della lisi cellulare, il lisato cellulare, le sfere di agarosio e l'anticorpo FLAG sono stati miscelati e incubati a 4 °C durante la notte. Le proteine ubiquitinate sono state poi rilevate tramite analisi western blot. Prima di rilevare proteine ubiquitinate, veniva utilizzato un anticorpo a catena leggera per l'incubazione secondaria degli anticorpi. Successivamente, sono state rilevate bande di ubiquitinazione. I risultati mostrano che sia il metodo del bagno di ghiaccio sia quello del trattamento termico possono essere utilizzati per rilevare i livelli di ubiquitinazione, mentre il metodo di trattamento termico può facilitare la rilevazione dell'ubiquitinazione di SMAD2. Questo studio delinea e confronta due metodi di lisi cellulare per misurare i livelli di ubiquitinazione nelle cellule di mammiferi, utilizzando SMURF2/SMAD2 come modello, per aiutare i ricercatori a selezionare metodi più appropriati per rilevare i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato.
Introduzione
L'ubiquitinazione, una modifica post-traduzionale indispensabile, è un regolatore critico delle funzioni intracellulari delleproteine 1. Il sistema ubiquitina-proteosoma (UPS), che media la degradazione di oltre l'80% delle proteine negli eucarioti, è composto da ubiquitina (Ub), enzimi attivanti E1, enzimi coniuganti E2, ligasi E3, enzimi deubiquitilanti (DUB) e ilproteosoma 26S 2. Questo sistema regola il ricambio proteico con alta specificità, controllando così processi cellulari essenziali come la progressione del ciclocellulare 3, la trasduzione delsegnale 4,5 e le risposte allo stress 6,7. L'ubiquitinazione è un processo enzimatico a più fasi. E1 idrolizza ATP in adenilato il capolinea C di Ub, formando un intermedio Ub-AMP. Successivamente, l'Ub attivato viene trasferito da E1 alla cisteina del sito attivo di un enzima coniugante E2, formando un legame tioestere. Infine, una ligasi E3 recluta sia il complesso E2-Ub sia una proteina bersaglio, catalizzando il trasferimento di Ub da E2 a un residuo di lisina sul substrato8.
L'ubiquitina può formare diverse catene di poliubiquitina tramite collegamento a sette residui di lisina (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) o Met1(M1)4. Ogni tipo di collegamento determina risultati biologici distinti: le catene K48 mirano principalmente alle proteine per la degradazioneproteasomale 9, le catene K63 regolano la segnalazione e la riparazione del DNA10,11, e le catene collegate a M1 sono fondamentali per le risposte immunitarieinnate 12. Ubiquitinazione e deubiquitinazione sono processi fondamentali di modifica post-traduzionale che governano diversi eventi cellulari, che vanno dalla degradazione delle proteine alla trasduzione del segnale. Ad esempio, nel cancro colorettale, l'attivazione aberrante dell'ubiquitinazione p53 mediata da MDM2 porta a una degradazione eccessiva della p53, compromettendone la capacità di indurre arresto del ciclo cellulare e apoptosi, favorendo così la progressione tumorale e la chemioresistenza13,14. Nella lesione da ischemia e reperfusione epatica, OTUD1 stabilizza NRF2 rimuovendo la sua poliubiquitinazione K48-legata, migliorando così i livelli di stress ossidativointracellulare 15,16. Una serie di inibitori del proteassoma, come bortezomib, carfilzomib e ixazomib, sono entrati progressivamente nella pratica clinica per malattie come il mielomamultiplo 17,18,19.
Attualmente esistono numerosi metodi per rilevare proteine ubiquitinate, tra cui western blotting, saghi basati sulla radioattività e saggi difluorescenza 20. Tuttavia, nella ricerca scientifica, il western blot rimane il metodo preferito per la rilevazione dell'ubiquitinazione delle proteine grazie al suo protocollo relativamente rapido e diretto. I metodi tradizionali per rilevare proteine ubiquitinate sono simili alla tecnologia di co-immunoprecipitazione (co-IP): utilizzano un tampone di lisi per incubare e lisare pellet cellulari a bassa temperatura per rilasciare proteine, poi usano anticorpi per rilevare l'ubiquitinazione delle proteine delsubstrato 21,22. Tuttavia, questo protocollo sperimentale spesso richiede un gran numero di celle. Inoltre, poiché il metodo relativamente lieve della lisi a bassa temperatura non può interrompere completamente le interazioni proteiche, questo aumenta la probabilità di falsi positivi nella rilevazione dell'ubiquitinazione. Il riscaldamento e l'uso della SDS possono compromettere significativamente la struttura proteica, inducendone la completa denaturazione, riducendo così efficacemente i falsi positivi causati dalle interazioniproteina-proteina 23,24,25. Analogamente, le cellule subiscono una lisi sufficiente dopo il riscaldamento e il trattamento SDS, rilasciando più proteine e, di conseguenza, riducendo il numero di cellule necessarie per l'esperimento. In sintesi, sia il metodo del bagno di ghiaccio che quello del trattamento termico lisano le cellule e rilevano i livelli di ubiquitinazione delle proteine del substrato tramite incubazione di anticorpi. Tuttavia, il metodo di riscaldamento porta a una maggiore lisi cellulare e a una denaturazione proteica più forte.
TGF-β svolge un doppio ruolo nei processi fisiopatologici di varie malattie26,27. SMAD2 è un fattore di trascrizione critico a valle del TGF-β. L'ubiquitinazione mediata da SMURF2 di SMAD2 la prende di mira per la degradazione proteasomica, regolando così l'intensità di segnalazioneTGF-β 28. Questo studio delinea e confronta due metodi di lisi cellulare per misurare i livelli di ubiquitinazione nelle cellule di mammiferi, utilizzando SMURF2/SMAD2 come modello. Qui, la sovraespressione proteica nelle cellule HEK293T è stata indotta tramite trasfezione transitoria con plasmidi HA-Ub, FLAG-SMAD2 e MYC-SMURF2. Le celle sono state lisate utilizzando rispettivamente il metodo del bagno di ghiaccio e il metodo del trattamento termico. Le proteine ubiquitinate sono state rilevate tramite analisi Western blot. Abbiamo scoperto che sia il metodo del bagno di ghiaccio che quello del trattamento termico possono essere utilizzati per rilevare i livelli di ubiquitinazione, e il metodo del trattamento termico potrebbe facilitare la rilevazione dell'ubiquitinazione di SMAD2. Questo protocollo offre una nuova alternativa per rilevare proteine ubiquitinate. Inoltre, per alcune proteine del substrato fortemente associate all'ubiquitinazione, il metodo di trattamento termico raggiunge una migliore efficienza di lisi proteica, consentendo così una maggiore rilevazione dell'ubiquitinazione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione del tampone di lisi e dei reagenti
NOTA: Preparare tutti i buffer alle concentrazioni indicate. Segui le istruzioni del produttore per le polveri reagenti per evitare discrepanze di concentrazione.
- Prepara il tampone di lisi contenente 20 mM di Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0) e 1% di Triton X-100. Regolare la concentrazione di NaCl tra 50 e 150 mM se necessario. Prepara tutti i tamponi usando H₂O doppio distillato.
- Preparare la soluzione operativa integrando il tampone di lisi con un cocktail inibitore della proteasi all'1% (senza EDTA). Mescola bene e lascia sul ghiaccio fino all'uso.
- Prepara SDS al 10% sciogliendo 1 g di polvere SDS in 10 mL di PBS. Mescola finché non è completamente sciolto. Conserva a temperatura ambiente.
- Prepara 5× tampone proteico contenente 250 mM di Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 50% glicerolo, 0,5% blu di bromofenolo e 5% β-mercaptoetanolo. Sciogliere i componenti in H2Odoppiamente distillato. Mescolare accuratamente prima dell'uso.
NOTA: Maneggiare SDS e β-mercaptoetanolo in una cappa fumaria indossando l'attrezzatura protettiva appropriata. Smaltire i materiali contaminati secondo le linee guida istituzionali sui rifiuti chimici.
2. Preparazione delle cellule
- Mantenere HEK293T cellule in DMEM ad alto livello di glucosio integrate con FBS al 10% e 1% di penicillina-estreptomicina. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ in condizioni sterili. Cellule di passaggio a circa il 90% di confluenza.
- Cellule seme in piastre a 6 pozzi a 5 × 10⁵ cellule per pozzo. Raccoglie celle da due pozzi per generare un campione.
- Preparare le miscele di trasfezione per rappresentare il 10% del volume totale della coltura e utilizzare l'ubiquitinazione SMAD2 come modello sperimentale. Combinare 1 μg di plasmide HA-Ub, 1 μg di plasmide FLAG-SMAD2 e 0,5 μg di plasmide vettoriale vuoto o MYC-SMURF2 in 100 μL di DMEM senza siero. In un tubo separato, diluire 3,75 μL di reagente di trasfezione in 100 μL di DMEM senza siero. Aggiungi la miscela di reagenti goccia a goccia nella soluzione plasmidica, incuba per 15 minuti a temperatura ambiente e distribuiscila uniformemente sulle cellule.
- Sostituisci il mezzo di trasfezione dopo 6-8 ore con 2 mL di DMEM fresco e completo per ogni pozzo. Incubare le cellule per 48 ore.
- Trattare le cellule con 5 μM di MG132 per 12 ore prima di prelevare.
NOTA: Maneggiare MG132 in un armadietto di biosicurezza indossando i guanti. Smaltire i materiali contaminati secondo le procedure di sicurezza istituzionale.
3. Raccolta delle celle
- Prelevare cellule al 90-100% di confluenza (~3 × 10⁶ cellule). Aspira il mezzo e lava ogni pozzo con 1 mL di PBS preraffreddato. Rimuovere completamente PBS.
- Aggiungi 1 mL di PBS in ogni pozzo e risospezioni delicatamente le cellule. Trasferisci la sospensione su un tubo da 1,5 mL e mettila sul ghiaccio.
- Centrifuga a 380 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovi il soprandanante e conserva il pellet.
4. Preparazione delle perline d'agarosio
- Trasferire 50 μL di sfere di agarosio proteico A/G per campione in un nuovo tube. Lava le perline 3 volte con 1 mL di tampone per la lisi. Centrifuga a 100 × g per 1 minuto a 4 °C tra un lavaggio e l'altro.
- Rimuovere il buffer residuo senza disturbare il pellet. Aggiungere 100 μL di soluzione operativa e 5 μL di anticorpi anti-FLAG. Incubare per 6 ore a 4 °C con rotazione delicata.
5. Lisi cellulare
- Metodo del bagno di ghiaccio
- Aggiungi 500 μL di soluzione lavorativa preraffreddata al pellet. Incuba sul ghiaccio per 30 minuti.
- Sonica a 2 W usando cicli di 4 s on/4 s off per cinque ripetizioni. Tieni i campioni sul ghiaccio durante la sonicazione. Restituire i campioni al ghiaccio per il resto dell'incubazione.
NOTA: Per le interazioni proteiche deboli, ridurre la concentrazione di NaCl a 50-75 mM e omettere la sonicazione.
- Metodo di trattamento termico
- Aggiungi 45 μL di soluzione lavorativa al pellet. Aggiungi 5 μL di SDS al 10% mentre si mescola continuamente.
- Vortice brevemente e riscaldato a 95 °C finché la sospensione non diventa trasparente e completamente liquefatta. Inverti a intermittenza per garantire una denaturazione uniforme.
- Aggiungi 450 μL di soluzione funzionante. Sonicate a 2 W usando cicli di 4 s on/4 s off per cinque ripetizioni mantenendo i campioni in ghiaccio.
NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di SDS rimanga <0,1%. Confermare la lisi completa verificando la scomparsa del pellet visibile e la chiarezza della soluzione uniforme.
6. Rilevamento di immunoprecipitazione e ubiquitinazione
- La centrifuga si lisa a 13.680 × g per 15 minuti a 4 °C. Trasferisci il sovrantantante in un nuovo tubo.
- Riservare 60 μL di lisato e aggiungere 15 μL di buffer di carico 5×. Riscalda a 95 °C per 15 minuti e etichetta come input.
- Aggiungere 100 μL di sfere accoppiate ad anticorpi al lisato rimanente (volume finale 540 μL). Incubare a 4 °C per 8-12 ore con rotazione.
- Centrifuga sfera a 100 × g per 1 minuto a 4 °C e scartare il surnadante. Lava le perline 3 volte con il tampone per la lisi. Aggiungi 75 μL di tampone di carico SDS 1× e riscalda a 95 °C per 15 minuti per eluire le proteine. Etichetta come IP.
- Rilevare proteine ubiquitinate tramite western blot secondo un protocollo standard JoVE.
NOTA: Consultare il protocollowestern blot 29 per procedure dettagliate di trasferimento e rilevamento. Macchie non ritagliate a tutta lunghezza con marcatori di peso molecolare sono fornite nel File Supplementare 1.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Come "messaggero molecolare" nella via di segnalazione TGF-β, SMAD2, dopo essere stato fosforilato dai recettori TGF-β, forma un complesso con SMAD3 e SMAD4, si trasloca al nucleo e avvia la trascrizione dei geni bersaglioa valle 30. È quindi una molecola chiave che collega i segnali extracellulari all'espressione genica intracellulare. La sua degradazione è mediata da SMURF2, una ligasi di ubiquitina E3 che catalizza la poliubiquitinazione della proteina bersagli...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo studio presenta e confronta due protocolli dettagliati di lisi proteica specificamente ottimizzati per rilevare l'ubiquitinazione del substrato mediata dalla ligasi E3. Per garantire la rilevabilità, abbiamo utilizzato la sovraespressione basata su plasmidi (ad esempio, marcato SMAD2, SMURF2 o Ub) nelle cellule, che ha fornito livelli proteici sufficienti per visualizzare segnali specifici di ubiquitinazione, fondamentali per validare le interazioni E3 ligasi-substrato in questo s...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio di ricerca è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China, n. 82370647 (W.H.), n. 82170642 (J-X. Z), n. 81801923 (X-F. Z), n. 81670575 (J-X. Z), n. 81570570 (W.H.) e n. 81070355 (J-X. Z), e il Programma del Team Giovanile Accademico di Frontiera HUST, Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong (2018QYTD02). La Open Foundation of Hubei Laboratorio Chiave di Medicina Rigenerativa e Ricerca Traslazionale Multidisciplinare (2022zsyx003). Il Programma Nazionale Chiave di Ricerca e Sviluppo della Cina (2024YFA1107601).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microtubo da 1,5 mL | Servicebio | EP-150-M | |
| Piatto coltivato trattato con TC da 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| Disco a 6 pozzi | Servicebio | CCP-6H | |
| Anticorpi anti-FLAG | Proteintech | 20543-1-AP | diluizione usata 1:200 per IP 1:10000 per WB |
| Anticorpi anti-GAPDH | Proteintech | MA5-15738 | diluizione usata 1:10000 |
| Anticorpi anti-HA | Proteintech | 51064-2-AP | diluizione usata 1:10000 |
| Anticorpi anti-IgG | CST | #3900 | diluizione usata 1:200 per IP |
| Anticorpi anti-MYC | Proteintech | 60003-2-IG | diluizione usata 1:10000 |
| Anticorpi anti-SMAD2 | CST | #5339 | diluizione usata 1:200 per IP 1:2000 per WB |
| Blu di bromofenolo | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8.0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glicerolo | Sinopharm | 10010618 | |
| Bagno a secco per riscaldamento/raffreddamento | Guocheng | ||
| HEK293T celle | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM ad alto contenuto di glucosio | Servicebio | G4515-500ML | |
| Catena Leggera Anti-IgG Topo coniugata HRP | Abclonale | AS062 | diluizione usata 1:5000 |
| Catena leggera IgG anti-Rabbit con HRP coniugata con HRP | Abclonale | AS061 | diluizione usata 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladdin | M421264 | |
| Microcentrifuga | Labgic | CF1524R | |
| Polvere di NaCl | Servicebio | GC102004 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Per l'espressione dei mammiferi | ||
| pCMV-HA-Ub | Per l'espressione dei mammiferi | ||
| pCMV-MYC | Per l'espressione dei mammiferi | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Per l'espressione dei mammiferi | ||
| Penicillina-streptomicina | Servicebio | G4003-100ML | |
| Cocktail inibitore della proteasi senza EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Sfere di agarosio proteico A/G | Beyotime | P2017 | |
| Membrana PVDF | Vayzme | E801 | |
| Polvere SDS | Solarbio | S8010-500g | |
| Sistema SDS-PAGE | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Sonics | Cellula di Uibra | ||
| Polvere Tris-HCl | Biotopped | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100ml | |
| Tripsina | Servicebio | G4021-100ML | |
| Miscelatore a vortice | Gentilmente donato da Vayzme | ||
| β-mercaptoetanolo | Aladdin | M301573 |
Riferimenti
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis. Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).
- Gao, L., et al. The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases. Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).
- Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. Akt and DUBs: A bidirectional relationship. Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).
- Liu, J. Z., et al. BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).
- Cappadocia, L., Lima, C. D. Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism. Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).
- Li, J., et al. ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis. Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).
- Niu, K., et al. USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy. Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation. Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).
- Di, Y., et al. The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity. Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).
- Liebl, M. C., Hofmann, T. G. The role of p53 signaling in colorectal cancer. Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).
- Oikawa, D., et al. OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways. Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).
- Zhang, Q., et al. The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury. Redox Biol. 75, 103287(2024).
- Moreau, P., et al. Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma. N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).
- Stewart, A. K., et al. Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).
- Zhu, Y., et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).
- De Silva, A. R. I., Page, R. C. Ubiquitination detection techniques. Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of protein ubiquitination. J Vis Exp. (30), e1293(2009).
- Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. Method to measure ubiquitination of NLRs. Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Crane, J. L., Cao, X. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling. J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).
- Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer. Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).
- Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β signaling. Biomolecules. 10 (3), 487(2020).
- The western blot. J vis exp. , e5065(2025).
- Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 4, 16009(2016).
- Jeon, S., et al. The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis. J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).
- Zhang, W., et al. SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation. Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).
- Pi, Y., et al. Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression. Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
