Valutazione Quantitativa Ottimizzata della Stabilità dell'RNA Potenziatore nelle Cellule Staminali Embrionali di Topo

Summary

Questo protocollo misura quantitativamente la stabilità e l'emivita degli RNA potenziatori intergenici e intragenici nelle cellule staminali embrionali di topo utilizzando il trattamento con Actinomicina D, RT-qPCR e analisi di regressione non lineare. Strategie di normalizzazione specifiche per posizione sono incorporate per modellare accuratamente la dinamica del decadimento dell'eRNA in modo dipendente dal contesto.

Abstract

Gli RNA potenziatori (eRNA) sono trascritti non codificanti prodotti da regioni potenziatrici attive in trascrizione e sono sempre più riconosciuti come regolatori chiave dell'espressione genica. Nonostante la loro importanza funzionale, la stabilità e la dinamica di degrado dell'eRNA rimangono poco caratterizzate, in particolare nelle cellule staminali embrionali (ESC), dove i programmi trascrizionali sono altamente dinamici e dipendenti dal contesto. Questo protocollo presenta un metodo quantitativo per valutare la cinetica del decadimento e l'emivita degli eRNA intergenici e intragenici negli ESC del topo. La trascrizione viene inibita tramite Actinomicina D e l'RNA totale viene raccolto in più momenti temporali definiti. Il cDNA viene sintetizzato utilizzando sia esameri casuali che primer oligo(dT) per consentire la rilevazione sia di trascriti poliadenilati che non poliadenilati. Per gli eRNA intergenici, la normalizzazione viene effettuata utilizzando un gene di mantenimento o il valore Ct al tempo 0 min. Per gli eRNA intragenici, viene adottato un approccio di doppia normalizzazione per minimizzare l'interferenza dovuta alla sovrapposizione dei pre-mRNA. Le curve di decadimento vengono analizzate utilizzando un modello di decadimento esponenziale monofase, consentendo una stima accurata dell'emivita. Il protocollo rivela che gli eRNA nei mESC mostrano un rapido ricambio, con un'emivita di circa 2-3 minuti. Questa metodologia fornisce un quadro solido e riproducibile per studiare la stabilità dell'eRNA, offrendo una visione sull'attività degli enhancer e sulla dinamica dell'RNA nei contesti delle cellule staminali pluripotenti.

Introduction

Gli enhancer sono elementi cis-regolatori (CRE) che regolano l'espressione genica specifica per tessuti e stimoli fungendo da piattaforme di legame per fattori di trascrizione e^{co-regolatori} 1,2,3,4,5,6. Sebbene gli enhancer possano essere localizzati lontanamente dai loro geni target a livello genomico lineare, i meccanismi di looping della cromatina consentono la vicinanza spaziale ai promotori, facilitando la regolazione trascrizionale. Gli enhancer attivi vengono trascritti in modo bidirezionale dalla RNA polimerasi II (Pol II), che producono lunghi RNA non codificanti noti come RNA potenziatori (eRNA), che tipicamente hanno una lunghezza mediana di circa 1^kb 1,2,7,8,9. L'espressione degli eRNA è fortemente correlata all'attivazione dei geni target^vicini 10,11,12, e gli studi funzionali hanno costantemente dimostrato che la deplezione degli eRNA riduce la trascrizione dei loro geni target, suggerendo che gli eRNA agiscono come regolatori funzionali piuttosto che come sottoprodotti trascrizionali 13,14,15,16,17. Nonostante la loro importanza funzionale, i protocolli sperimentali per rilevare e quantificare in modo affidabile gli eRNA restano limitati.

Nelle cellule staminali, l'attività degli potenziatori svolge un ruolo cruciale nel mantenere la pluripotenza e nel guidare le transizioni dello sviluppo^18,19. Gli potenziatori possono risiedere in regioni intergeniche (potenziatori intergenici o extragenici) o essere incorporati nei corpi genici come potenziatori^{intragenici 8}. Sebbene gli potenziatori intergenici siano stati ampiamente studiati in vari tipi cellulari, gli inpotenziatori intragenici rimangono relativamente poco esplorati a causa di sfide tecniche, come la sovrapposizione trascrizionale con i pre-mRNA del gene ospite e la presenza di modifiche agli istoni associate all'allungamento^{trascrizionale 20,21}. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che sia gli potenziatori intergenici che quelli intragenici contribuiscono alle reti regolatorie geniche coinvolte nella pluripotenza^22,23 e nella differenziazione^{precoce 24} negli ESC. In particolare, quasi la metà di tutti gli esaltatori annotati sono^{intragenici 20,25}, e la loro attività varia a seconda delle fasi dello sviluppo, spesso aumentando nei tessuti^{differenziati} 8,26,27,28. Tuttavia, la prevalenza e i ruoli funzionali degli esaltatori intragenici negli ESC rimangono incompletamente compresi. In particolare, mentre gli eRNA intergenici vengono trascritti tra i geni, gli eRNA intragenici vengono trascritti all'interno dei corpi genici e possono sovrapporsi con i pre-mRNA. Questa differenza posizionale richiede approcci analitici distinti nell'interpretazione e quantificazione degli eRNA intergenici e intragenici.

A differenza degli mRNA, gli eRNA tipicamente non hanno una coda poli(A) di 3′, il che provoca bassa stabilità e rapida ^degradazione 1,2,7,8,9. Questa instabilità intrinseca rende difficile analizzare l'espressione dell'eRNA, specialmente negli esperimenti sul corso temporale. Nei neuroni, è stato segnalato che gli eRNA presentano un'emivita breve anche di 7,5 min¹⁷. Tuttavia, resta incerto se questa instabilità sia coerente tra diversi tipi cellulari, in particolare nelle ESC, dove sia l'attività degli potenziatori che la trascrizione dell'eRNA sono altamente specifiche per^{tipo cellulare} 7,17,29,30. Gli ESC si basano su programmi dinamici di regolazione genica per mantenere la pluripotenza o avviare la differenziazione, rendendoli un sistema unico per esaminare il turnover dell'eRNA^31,32. Dati i rapidi spostamenti trascrizionali negli ESC, comprendere il decadimento dell'eRNA in questo contesto può rivelare come l'attività potenziatrice sia regolata^{temporalmente 17}. Inoltre, le differenze tra eRNA intergenici e intragenici, come la sovrapposizione con i trascriccati genici dell'ospite, richiedono approcci analitici^{distinti 20}. Nonostante l'importanza di queste domande, esistono pochi metodi standardizzati per misurare l'emivita dell'eRNA negli ESC o per confrontare la dinamica del decadimento dei diversi tipi di eRNA.

Questo studio presenta un protocollo quantitativo per valutare la stabilità e l'emivita degli eRNA trascritti da potenziatori intergenici e intragenici negli mESC. L'inibizione trascrizionale viene ottenuta utilizzando actinomicina D (ActD) a intervalli di tempo definiti, seguita da analisi quantitative PCR in tempo reale (RT-qPCR) e regressione non lineare per quantificare il decadimento dell'eRNA. Per affrontare le differenze posizionali tra potenziatori intergenici e intragenici, il metodo incorpora strategie di normalizzazione distinte, consentendo un confronto sistematico e accurato delle dinamiche di degradazione dell'eRNA. Questo quadro analitico strutturato fornisce preziose informazioni sul ricambio dell'eRNA nelle cellule staminali pluripotenti.

Protocol

Tutti gli esperimenti di questo studio sono stati condotti utilizzando cellule staminali embrionali di topo (mESC; E14Tg2A) che non sono stati generati direttamente nel nostro laboratorio ma sono stati ottenuti da una linea cellulare consolidata, anch'essa disponibile commercialmente tramite ATCC (CRL-1821). Pertanto, il lavoro descritto in questo articolo non richiede la revisione del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) presso la Chungnam National University. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare di mESC

1. Pre-rivestire le piastre di coltura cellulare a 6 pozzi con gelatina allo 0,1% (2 mL per pozzo). Incubare le piastre a 37 °C per 10 minuti.
2. Aspira la gelatina e lava ogni pozzo una volta con 1 mL di PBS. Sterilizza le piastre con irradiazione UV per almeno 15 minuti.
3. Seme di mESC sulle lastre rivestite di gelatina utilizzando 2 mL completi di mezzo di coltura cellulare (Tabella 1).
   NOTA: Aggiungere LIF fresco al mezzo di coltura alla concentrazione richiesta immediatamente prima dell'uso, in base al volume totale del mezzo necessario per l'esperimento.

Componenti	Concentrazione finale	Volume utilizzato
Il Medium Essenziale Minimo (GMEM) di Glasgow	-	500 mL
Sostituzione del siero KnockOut™ (KOSR)	10%	50 mL
Penicillina-streptomicina	0.50%	2,5 mL
Siero fetale bovino (FBS)	1%	5 mL
Piruvato di sodio	0,1 mM / 1%	5 mL
Soluzione di Amminoacidi Non Essenziali (MnEA)	0,1 mM/ 1 %	5 mL
2-mercaptoetanolo	0,1 mM	910 uL
Fattore inibitore della leucemia (LIF)	1000 U/mL	-

Tabella 1: Composizione del mezzo di coltura mESC. I componenti e le loro concentrazioni finali vengono utilizzati per preparare il mezzo di coltura mESC. I volumi tipici sono elencati per 500 mL di mezzo totale.

4. Mantenere le cellule in condizioni di coltura standard a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ (Figura 1A).

Figura 1: Disegno sperimentale per l'analisi della stabilità dell'eRNA. (A) Schema dell'esperimento di arresto trascrizionale. Le celle sono state impiattate su lastre a 6 pozzi rivestite di gelatina allo 0,1% e trattate con actD (concentrazione finale: 5 μg/mL) nei momenti indicati (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min e 30 min) dopo la raccolta. (B) Layout del test RT-qPCR. L'RNA totale è stato trascritto inversamente utilizzando primer esamerici casuali o oligo(dT). Campioni di cDNA da ciascun punto temporale sono stati analizzati utilizzando RT-qPCR per i target indicati: Tbp_mRNA, eRNA intergenico ed eRNA intragenico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Trattamento con Actinomicina D (ActD)

1. Dissolvere l'actD in DMSO per preparare una soluzione di stocco a una concentrazione di 1 mg/mL³³.
   NOTA: Sebbene l'Actinomicina D venga utilizzata qui per l'inibizione trascrizionale a breve termine, inibitori alternativi come il triptolideo potrebbero essere impiegati anche per bloccare l'inizio della trascrizione in studi futuri. Poiché sia l'Actinomicina D che la DMSO sono fotosensibili, prepara la soluzione originale in microtubi ambrati, proteggila dalla luce e conservala a -20 °C fino all'uso.
2. Due giorni dopo la semina delle cellule (o il giorno stesso del raccolto), aggiungere la soluzione di stocco actD al mezzo di coltura fino a una concentrazione finale di 5 μg/mL³³. Raccogli i campioni a 0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 e 30 min dopo il trattamento (Figura 1A).
   NOTA: Sebbene la maggior parte degli eRNA mostri un rapido decadimento nell'intervallo 0-30 minuti, alcuni eRNA possono mostrare emivite più lunghe. A seconda delle caratteristiche del locus bersaglio, possono essere inclusi campionamenti aggiuntivi in momenti temporali estesi (ad esempio, 1 h, 3 h o 6 h) per catturare con maggiore precisione la cinetica del decadimento (decading). In questo studio, l'Actinomicina D è stata utilizzata a una concentrazione di 5 μg/mL per un blocco trascrizionale a breve termine (≤30 min); tuttavia, per incubazioni più lunghe (>1 ora), si raccomanda di ridurre la concentrazione a 1-2 μg/mL per minimizzare le risposte allo stress cellulare. Poiché il DMSO stesso può influenzare l'attività trascrizionale, dovrebbe essere incluso anche un controllo solo DMSO.

3. Estrazione di RNA e sintesi del cDNA

1. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare tramite aspirazione e aggiungere 1 mL di reagente TRIzol in ogni pozzo. Incubare le piastre su uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente (RT)^34,35, poi trasferire il lisato in un nuovo tubo da 1,5 mL.
   NOTA: Dopo il trattamento con TRIzol, i campioni possono essere conservati a -80 °C per un massimo di una settimana prima dell'estrazione dell'RNA. Poiché il reagente TRIzol contiene fenolo e isotiocianato di guanidinio, che sono altamente tossici e corrosivi, trattalo con grande attenzione. Tutti i rifiuti di Trizol devono essere raccolti in un contenitore designato per i rifiuti di solventi organici per una corretta dismissione.
2. Aggiungi 500 μL di cloroformio a ciascun campione. Scuoti vigorosamente i tubi e incuba a RT per 3 minuti.
3. Centrifugare i campioni a 13.500 × g per 10 minuti a 4 °C.
4. Trasferire con attenzione la fase acquosa in un nuovo tubo da 1,5 mL contenente un volume uguale di isopropanolo. Incubare la miscela a RT per 10 minuti per aumentare la precipitazione dell'RNA.
   NOTA: Trasferire con attenzione solo la fase acquosa superiore trasparita per evitare contaminazioni con l'interfase. Per aumentare la resa di RNA, incubare i campioni a -20 °C per 1 ora fino a tutta la notte (O/N) dopo l'aggiunta di isopropanolo. Per campioni a basso input, aggiungere glicogeno (ultimi 10-20 μg/mL) o GlycoBlue subito prima di aggiungere l'isopropanolo per migliorare la visibilità e l'efficienza del recupero dei pellet di RNA. L'isopropanolo è altamente infiammabile e potenzialmente dannoso per la salute umana; L'inalazione di vapori o il contatto con pelle o occhi può causare irritazione, mal di testa, vertigini o depressione del sistema nervoso centrale. Maneggiare con cautela e raccogliere tutte le soluzioni rimanenti in un contenitore approvato per i rifiuti di solvente organico per uno smaltimento corretto.
5. Centrifugare nuovamente i campioni a 13.500 × g per 10 minuti a 4 °C e scartare il surnadante.
6. Lavare il pellet di RNA risultante con 1 mL di etanolo al 75%. Centrifugare a 6.800 × g per 5 minuti a 4 °C.
   NOTA: Inverti delicatamente il tubo dopo l'aggiunta di etanolo per sollevare il pellet.
7. Rimuovi con cura il surnante e lascia asciugare il pellet all'aria per 10 minuti a 42 °C. Risospendere il pellet essiccato in acqua priva di RNasi e incubare a 55 °C per 10 minuti.
   NOTA: Quando la purezza dell'RNA è alta, il pellet bianco può diventare traslucido durante il processo di asciugatura all'aria. Evita di asciugare troppo il pellet per più di 10 minuti, poiché un'asciugatura eccessiva può ridurre l'efficienza della rispensione.
8. Misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.
9. Sintetizza cDNA da μg di RNA utilizzando il kit di sintesi di cDNA M-MLV, seguendo le istruzioni del produttore (Tabella 2).

Componenti	Volume utilizzato
Buffer RT 10X M-MLV	2 uL
dNTP	2 uL
Primer (Random / Olido dT)	1uL
M-MLV RT	1uL
Inibitore della Rnasi	0,5 uL
Campione di RNA	2ug (Volume aggistato in base alla concentrazione del campione di RNA)
DW	Volume aggistato a seconda della concentrazione del campione di RNA (per completare il volume finale)
Volume totale	20 uL

Tabella 2: Composizione della reazione di sintesi del cDNA (M-MLV trascridasi inversa). Volumi dettagliati e reagenti utilizzati per la trascrizione inversa di 2 μg di RNA totale utilizzando il kit di sintesi del cDNA M-MLV. Il volume del campione di RNA è stato aggistato in base alla sua concentrazione e è stata aggiunta DW senza nucleasi per portare il volume finale di reazione a 20 μL.

10. Incubare la reazione cDNA a 37 °C per 2 ore, poi inattivare l'enzima a 85 °C per 5 minuti.
    NOTA: Conserva cDNA sintetizzato a -20 °C. La concentrazione tipica di cDNA è di circa 100 ng/μL. Per rilevare eRNA intragenici, sintetizza cDNA dallo stesso campione di RNA utilizzando sia primer esameri casuali che primer oligo(dT).

4. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

1. Prepara una miscela di reazione da 10 μL contenente 15 ng di cDNA, 5 μL di Power SYBR Green PCR master mix, 5 pmol di ciascun primer e acqua distillata (DW).
   NOTA: i loci eRNA spesso contengono o sono adiacenti a sequenze ripetitive, richiedendo un attento design dell'inn. Utilizzare sequenze mascherate ripetute per limitare le regioni candidate e verificare la specificità delle coppie di primer in tutto il genoma usando BLAST. Quando possibile, includere le regioni di controllo vicine per escludere l'amplificazione non^{specifica 36}.
2. Eseguire l'amplificazione utilizzando un sistema PCR in tempo reale con le seguenti condizioni di ciclo termico: un passaggio iniziale di attivazione e denaturazione a 50 °C per 2 minuti e 95 °C per 10 minuti, seguito da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 secondi, e ricottezza, estensione e misurazione della fluorescenza a 60 °C per 1^{minuto e 34 minuti, 37} (Tabella 3).

Palco	Passo	Temperatura (°C)	Ore	Ciclo
Hold Stage	Trascrizione inversa	50	2 min	1
	Denaturazione iniziale	95	10 min	1
Stadio PCR	Denaturazione	95	15 s	40
	Ricottura/Estensione	60	1 minuto	40
Stadio della curva di fusione	Denaturazione	95	15 s	1
	Ricottura	60	1 minuto	1
	Dissociazione (curva di fusione)	95	15 s	1

Tabella 3: Condizioni di ciclo termico per RT-qPCR. Condizioni riassunte di temperatura, tempo e ciclo per la trascrizione inversa, qPCR a 40 cicli (reazione da 10 μL) e analisi standard della curva di fusione.

3. Per la quantificazione intragenica dell'eRNA, si analizza sia il Tbp (o altro gene di controllo/controllo) sia la regione intragenica dell'epotenziatore utilizzando cDNA sintetizzato con primer oligo(dT). Per gli eRNA intergenici, si utilizza solo cDNA sintetizzato con primer esameri casuali (Tabella 4 e Figura 1B).
   NOTA: Eseguire ogni campione in duplicati tecnici (due pozzi) per consentire la media durante l'analisi dei dati.

Nome genico	Sonda di innesco	Sequenza (5'-3')	Dimensioni degli ampliconi
TBP	Inoltrare	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122 pb
	Inverso	TTGCTGCTGCTGTCTTTGTT
Nsun2_mRNA	Inoltrare	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93 BP
	Inverso	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	Inoltrare	TCCCTACAGCAGATCACTCAC	80 pb
	Inverso	CGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNA	Inoltrare	ACAGATGCAACCGATGCACC	105 pb
	Inverso	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	Inoltrare	CCTGAGAGGTGTTTGCTTTGT	110 pb
	Inverso	AGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNA	Inoltrare	CACTTCTCTGGGGTCTCTGG	107 BP
	Inverso	CCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNA	Inoltrare	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 BP
	Inverso	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative controllo	Inoltrare	CCCCGTGTGTTTAAGAGGAATGA	88 pb
	Inverso	ACTGAACAACCACTACTAGCA

Tabella 4: Sequenze di primer per l'analisi RT-qPCR. Sequenze di primer forward e back utilizzate per l'amplificazione specifica di ciascun gene bersaglio negli esperimenti RT-qPCR. Questi primer sono stati ottimizzati per garantire una quantificazione accurata dell'espressione di mRNA ed eRNA.

5. Analisi dei dati sulla stabilità dell'eRNA ²²

1. Analizzare tutti i dati utilizzando il metodo ΔCt e normalizzare i livelli relativi di eRNA rispetto al Tbp_mRNA (File Supplementare 1 e Figura 2A).
   NOTA: Se la differenza di valore Ct tra due repliche tecniche supera 0,5, escludere i dati da ulteriori analisi. Calcola i livelli relativi di espressione genica utilizzando il metodo ΔCt sottraendo il valore Ct del gene di controllo (ad esempio, Tbp_mRNA) da quello del gene bersaglio (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). L'espressione relativa può quindi essere calcolata come 2^-ΔCt (File Supplementare 2B).
2. Per la quantificazione intragenica dell'eRNA, si normalizzano i valori di espressione dividendo i valori del cDNA sintetizzato usando esameri casuali da quelli del cDNA sintetizzato con primer oligo(dT).
   NOTA: Esegui tutte le reazioni qPCR utilizzando tre repliche biologiche indipendenti (n = 3).
3. Normalizza il livello di espressione di ogni punto temporale (ottenuto tramiteil metodo ΔCt) al valore 0 min e traccia la curva di decadimento grafica.
   NOTA: Sebbene questo protocollo impieghi un trattamento breve con Actinomicina D, un'esposizione prolungata agli inibitori della trascrizione (ad esempio, ActD) può anche ridurre l'espressione genica domestica. Per una quantificazione con maggiore precisione, raccomandiamo di aggiungere un RNA esogeno spike-in (ad esempio, ERCC) nella fase di lisi cellulare per correggere le variazioni nell'efficienza dell'estrazione dell'RNA, nell'efficienza della trascrizione inversa e nella precisione del pipettare, permettendo così una normalizzazione più coerente tra i^{campioni 38,39}.
4. Tracciare i livelli normalizzati di eRNA nel tempo e adattarli utilizzando un modello di regressione non lineare (decadimento esponenziale a una fase) in GraphPad Prism (Supplementary File 3).
5. Stimare l'emivita dell'eRNA da repliche biologiche individuali.
   1. Apri GraphPad Prism e seleziona Crea > XY (Opzioni: X = Numeri; Y = Inserisci e traccia un singolo valore Y per ogni punto).
   2. Inserisci i punti temporali (0, 5, 10, 15, 20 e 30 min) come valori dell'asse X.
   3. Elenca i nomi dei campioni sull'asse Y (Gruppo) e inserisci il corrispondente singolo valore dei dati per ogni momento temporale.
   4. Seleziona Analizza > regressione e curve > regressione non lineare (adattamento della curva).
   5. Nella scheda Esponenziale , seleziona il modello di decadimento monofase .
   6. Nel foglio Tabella a Risultati , calcola la media e la deviazione standard dei valori di tempo di dimezzamento per ciascun campione usando Excel o software simile. Traccia i valori risultanti.
6. Curve di decadimento adattate con intervalli di confidenza al 95%
   1. Apri GraphPad Prism e seleziona Crea > XY (Opzioni: X = Numeri; Y = Inserire 3 valori replicati in sottocolonne affiancate).
   2. Inserisci i punti temporali (0, 5, 10, 15, 20 e 30 min) come valori dell'asse X.
   3. Elenca i nomi dei campioni sull'asse Y (Gruppo) e inserisci i tre valori replicati per ciascun campione di eRNA nella scheda tecnica corrispondente.
   4. Seleziona Analizza > regressione e curve > regressione non lineare (adattamento della curva).
   5. Nella scheda Esponenziale , seleziona il modello di decadimento monofase per l'analisi.
   6. Nel foglio Table to Resultat, estrarre i valori dell'intervallo di confidenza (IC) al 95% ottenuti dall'analisi dei campioni triplicati.
      NOTA: Usa la seguente equazione di decadimento (Y) = (Y₀ - Plateau) • ^e-kt + Plateau, dove Y è il livello relativo di eRNA al tempo t, Y₀ è il livello iniziale di eRNA e k è la costante di decadimento (eRNA). Non fissare il Plateau a zero durante l'adattamento della curva eRNA, poiché studi precedenti mostrano che l'eRNA può persistere e non degradarsi completamente nel^{tempo 17,40}. Tuttavia, fissare il Plateau a zero quando si analizza il decadimento dell'mRNA, seguendo i precedenti protocolli^41,42. Permette a GraphPad Prism di calcolare automaticamente l'emivita dell'eRNA (t₁/₂) usando la formula: t_1/2 = In(2)/k. Inserisci il tempo in min; Riporta i valori di tempo di dimezza risultanti in min.

Results

Per valutare la stabilità dell'RNA dopo l'arresto trascrizionale, i mESC sono stati trattati con actD e l'RNA totale è stato raccolto in momenti temporali definiti (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min e 30 min). Dopo la sintesi del cDNA, è stato eseguito RT-qPCR per quantificare l'eRNA intragenico di Nsun2 e Sox2, l'eRNA intergenico di Pou5f1 e i loro corrispondenti mRNA. Questi dati sono stati utilizzati per generare curve di ...

Discussion

Questo protocollo delinea un metodo affidabile e riproducibile per misurare la stabilità dell'eRNA negli mESC. I passaggi sperimentali fondamentali, tra cui la coltura cellulare, il trattamento con actinomicina D, l'estrazione di RNA e la quantificazione RT-qPCR, sono chiaramente illustrati nelle figure e nei file supplementari per guidare gli utenti nel flusso di lavoro. Inoltre, procedure analitiche dettagliate come la modellazione di regressione non lineare e l'interpretazione degli i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanolo	Gibco	21985023
Actinomicina D	Sigma-Aldrich	A9415
cloroformio	Sostanze chimiche Daejung	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glasgow' s Medium Essenziale Minimo (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (versione 9)	GraphPad Software
Isopropanolo	Sostanze chimiche Daejung	5035-4105
Sostituzione del siero KnockOut (KOSR)	Gibco,	10828028
Fattore inibitore della leucemia (LIF)	Merck	ESG1106
Soluzione di Amminoacidi Non Essenziali (MnEA)	Welgene	LS005
Kit di sintesi cDNA M-MLV	Enzimomica	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
Penicillina-streptomicina	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix	Biosistemi applicati	4368708
QuanStudio1 Sistema PCR in tempo reale	Biosistemi applicati	A40425
Piruvato di sodio	Welgene	LS013
TRIzol	Invitrogen	15596018