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Articolo metodologico

Ingegneria epigenetica delle cellule K562: strategia episomiale a doppio vettore per la metilazione mirata stabile del DNA utilizzando le proteine di fusione dCas9-DNMT3A e -HDAC1

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DOI:

10.3791/69328

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31 ottobre 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un sistema non integrativo, basato su CRISPR/dCas9 episomiale per l'editing epigenetico mirato nelle cellule K562, che combina effettori dCas9-DNMT3A e dCas9-HDAC1 con sgRNA specifici per indurre la metilazione del DNA locus-specifica con precisione e riduzione degli effetti off-target.

Abstract

Lo studio del ruolo preciso della metilazione del DNA nella regolazione trascrizionale genica e lo sviluppo di terapie mirate a specifici modelli di metilazione genica presentano sfide significative a causa della scarsità di strumenti versatili in grado di indurre modificazioni epigenetiche sito-specifiche e a lungo termine per modulare l'espressione genica. Lo studio mirava a sviluppare e convalidare un sistema innovativo basato sull'episomio per facilitare la metilazione stabile del DNA in un locus genico mirato, potenzialmente utile sia per la ricerca epigenetica di base che per le applicazioni terapeutiche. Per raggiungere questo obiettivo, la linea cellulare K562 è stata co-trasfettata con due distinti vettori episomiali. Entrambi i tipi di vettori sono stati ingegnerizzati per esprimere RNA guida (gRNA) che hanno come bersaglio una regione non metilata di 367 bp all'interno dell'isola CpG 326, situata a monte del gene ZBTB7A . Ogni vettore codificava una forma disattivata di endonucleasi Cas9 (morta o dCas9) fusa al dominio catalitico della DNA metiltransferasi DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) o all'istone deacetilasi HDAC1 (dCas-HDAC1). La sequenza dCas includeva due segnali di localizzazione nucleare (NLS) per garantire l'importazione nucleare della proteina. Questa cassetta di espressione a doppio sistema promuove uno stato di cromatina potenzialmente favorevole al silenziamento epigenetico a lungo termine, promettendo risultati epigenetici robusti e duraturi. Questo approccio intermedio all'epigenoma dell'ospite attraverso l'utilizzo di vettori episomiali autoreplicanti offre diversi vantaggi: mantenimento ed espressione di vettori a basso numero di copie in più divisioni cellulari senza integrazione nel genoma dell'ospite, riducendo così al minimo gli effetti off-target e preservando l'integrità del genoma. Riportiamo l'aumento preciso e significativo della metilazione del DNA presso l'isola ZBTB7A CpG 326 bersaglio. I risultati confermano che i sistemi episomiali CRISPR/dCas ingegnerizzati possono suscitare una metilazione del DNA duratura e sito-specifica. Pertanto, questo sistema è un prezioso strumento di ricerca per valutare gli effetti funzionali di cambiamenti mirati della metilazione e una piattaforma promettente per lo sviluppo di futuri trattamenti epigenetici.

Introduzione

La regolazione epigenetica, compresa la metilazione del DNA e le modificazioni degli istoni, svolge un ruolo fondamentale nel controllo dell'espressione genica, della differenziazione cellulare e della stabilità del genoma. La disregolazione di questi meccanismi è spesso coinvolta - sia come causa che come conseguenza - in vari stati patologici, in particolare nel cancro, nei disturbi neurologici e nelle sindromi da imprinting 1,2,3. In particolare, intervenendo con precisione sul panorama epigenetico in specifici loci genomici utilizzando la tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), è possibile raggiungere livelli di repressione genica paragonabili a quelli osservati nei modelli di knock-out genico, senza alterare la sequenza di DNA sottostante4. Di conseguenza, l'editing epigenetico mirato è emerso come una strategia promettente per sezionare i meccanismi di regolazione genica e sviluppare terapie di precisione.

Gli inibitori della DNA metiltransferasi (DNMT) e gli inibitori dell'istone deacetilasi (HDAC) sono terapie epigenetiche attualmente approvate per uso clinico. Tuttavia, questi agenti prendono di mira in modo non selettivo i marcatori epigenetici in tutto il genoma, alterando gli stati globali della cromatina, causando effetti off-target e tossicità nei pazienti5. Per affrontare i limiti dei tradizionali agenti di alterazione epigenetica, sono stati sviluppati editor epigenetici programmabili basati su Cas9 cataliticamente morto (dCas9) fusi a domini effettori, come le DNA metiltransferasi (ad esempio, DNMT3A), le demetilasi (ad esempio, TET1), le istone acetiltransferasi (ad esempio, p300) o le deacetilasi (ad esempio, HDAC3) 6,7,8,9 . Il sistema effettore dCas9 consente la modifica dell'epigenoma locus-specifico guidata da una piccola molecola di RNA, nota come RNA a guida singola (sgRNA), senza introdurre rotture a doppio filamento nella sequenza bersaglio. Studi recenti hanno dimostrato il loro uso nella modifica dell'espressione genica, nel rimodellamento dell'accessibilità della cromatina e persino nella riprogrammazione dei fenotipi cellulari 10,11,12.

Nonostante i rapidi progressi, i sistemi di ingegneria epigenomica basati su dCas9 continuano ad affrontare alcune limitazioni. La sfida più comune sono gli effetti off-target dovuti alla non specificità dei domini effettori epigenetici, specialmente con un'espressione forte o prolungata degli strumenti di fusione dCas913,14. Inoltre, le grandi dimensioni delle fusioni dCas9 presentano notevoli sfide di consegna. La dimensione della sequenza di Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) è di circa 4,2 kb15, che è paragonabile alla dimensione massima della capacità dei vettori di virus adeno-associati (AAV). Sebbene i vettori lentivirali abbiano una capacità relativamente grande (~12-1 kb), che consente la somministrazione di SpCas9 a lunghezza intera fusa con effettori epigenetici, mantengono ancora la possibilità di integrazione genomica casuale, rischiando la mutagenesi inserzionale e limitando le loro applicazioni cliniche16. D'altra parte, gli approcci non virali come la trasfezione plasmidica soffrono di una scarsa ritenzione nelle cellule in divisione. Gli approcci di somministrazione transitori o "mordi e fuggi" escludono la possibilità di integrazione genomica, ma spesso non riescono a sostenere i cambiamenti di metilazione tra le divisioni cellulari, a meno che non siano combinati con rimodellatori della cromatina o effettori cooperativi 17,18,19.

Per affrontare queste sfide, abbiamo impiegato un sistema di vettori episomiali non integrativo e autoreplicante (pEPI-S/MAR) per la somministrazione di effettori epigenetici fusi con dCas9. Questo vettore persiste extracromosomicamente nelle cellule in divisione a basso numero di copie (~1-2 per cellula), consentendo un'espressione sostenuta ma moderata, al fine di minimizzare le funzioni indesiderate associate alla sovraespressione20,21. L'elemento Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR) dell'episoma interagisce con la matrice nucleare, contribuendo al mantenimento stabile dell'episoma nel nucleo delle cellule durante la divisione cellulare22,23. Inoltre, il sistema di vettori pEPI evita i rischi associati all'integrazione virale e consente la consegna di costrutti senza superare i limiti di confezionamento.

Studi recenti hanno dimostrato che le regioni promotrici caratterizzate da modificazioni istoniche attive, in particolare l'acetilazione di H3K27 (H3K27ac), sono spesso resistenti alla metilazione del DNA ingegnerizzata. È stato dimostrato che gli approcci combinatori che rimuovono o aggiungono segni istonici utilizzando scrittori o cancellatori di modificazioni istoniche e introducono simultaneamente la metilazione del DNA tramite DNMT3A aumentano la stabilità e la persistenza della repressione genica, anche in approcci transitori19,24. Sulla base di queste intuizioni, abbiamo ipotizzato che la co-somministrazione di dCas9-HDAC1 e dCas9-DNMT3A e il targeting di aree genetiche vicine promuoverebbero il rimodellamento della cromatina e faciliterebbero una metilazione più efficiente e duratura agli elementi regolatori bersaglio.

In questo studio, abbiamo mirato a progettare e costruire un sistema in grado di fornire una metilazione mirata e stabile del DNA all'isola CpG 326 di ZBTB7A, una regione caratterizzata da bassa metilazione endogena e marcature aberranti di H3K27ac nelle cellule K562. L'obiettivo di questo studio è stato quello di fornire due costrutti episomiali codificanti dCas9 fusi a ciascuno dei distinti effettori epigenetici, insieme a sgRNA, mirando alla regione regolatoria ricca di CpG a monte del gene ZBTB7A utilizzando il sistema pEPI a bassa espressione, stabile e non integrativo. Come illustrato nella Figura 1, la co-trasfezione delle cellule K562 con questi episomi consente il doppio reclutamento dei complessi di editing nell'isola CpG di interesse, dove HDAC1 rimuove l'acetilazione locale degli istoni per facilitare la successiva metilazione del DNA da parte di DNMT3A, con conseguente modificazione epigenetica coordinata e sito-specifica.

Il sistema qui descritto è appropriato per applicazioni in cui la somministrazione virale non è fattibile a causa delle dimensioni del costrutto, di problemi di sicurezza o di limitazioni di costo. Supporta la clonazione modulare di diversi sgRNA e fusioni di effettori, rendendolo adattabile a una vasta gamma di loci bersaglio. Attualmente è più adatto per studi in vitro o preclinici su linee cellulari che tollerano la trasfezione plasmidica e la selezione di antibiotici. Nella nostra implementazione, la somministrazione episomiale nelle cellule K562 è stata ottenuta utilizzando reagenti a base di lipofectamina e mantenuta sotto la selezione G-418.

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Protocollo

1. Progettazione di sgRNA

  1. Identificare l'isola CpG desiderata o i siti CpG regolatori all'interno della regione promotrice del gene di interesse utilizzando un browser del genoma (ad esempio, il browser del genoma UCSC). Qui, il disegno è stato applicato sull'isola CpG 326 (GRCh38) del gene ZBTB7A .
  2. Progetta RNA guida singola (sgRNA) utilizzando una piattaforma di progettazione di sgRNA CRISPR online [ad esempio, CHOPCHOP web tool (versione 3)]. Quando si progettano gli sgRNA, seguire le raccomandazioni seguenti per garantire un'elevata attività on-target ed effetti off-target minimi:
    1. Selezionare la proteina SpCas9 come endonucleasi, utilizzando 5'-NGG-3' come motivo adiacente al protospaziatore all'estremità 3' (PAM-3').
    2. Scegli che la lunghezza dell'sgRNA sia di 20 bp (oltre alla sequenza PAM). Consenti corrispondenze fuori bersaglio con solo tre disallineamenti nella sequenza del protospaziatore.
    3. Quando si sceglie di indirizzare una regione specifica del gene, scegliere l'opzione 'Promotore' e definire l'intervallo a monte (ad esempio, da 1500 bp a 3000 bp a monte per l'isola CpG 326) per posizionare gli sgRNA all'interno della regione regolatoria.
    4. Utilizzare punteggi di efficienza on-target, come quelli sviluppati da Doench et al.25, per valutare l'attività dell'sgRNA.
  3. Quando si selezionano gli sgRNA per uso sperimentale, considerare i seguenti criteri:
    1. Classifica tutti gli sgRNA candidati in base all'efficienza per la regione target. Scegli gli sgRNA nel 10-20% dell'efficienza prevista. Quando si sceglie, evitare gli sgRNA con discrepanze (MM0, MM1, MM2, MM3) in potenziali siti fuori bersaglio.
    2. Scegli sgRNA che prendono di mira aree originariamente non metilate o debolmente metilate per la repressione trascrizionale utilizzando dCas9-DNMT. Per la repressione trascrizionale utilizzando dCas9-HDACs, mirare a regioni altamente acetilate per una maggiore efficienza. Utilizzare database online (ad es. ChIP-Atlas) per confermare la metilazione del DNA e i segni di acetilazione degli istoni nelle cellule K562 nei loci bersaglio.
    3. Utilizzare più sgRNA per coprire regioni target più grandi di 100-200 bp26.
      NOTA: Le modificazioni epigenetiche (metilazione e deacetilazione) influenzano le regioni a monte e a valle del sito di legame dell'sgRNA e questi effetti potrebbero essere limitati a brevi intervalli genomici.
    4. Scegli sgRNA con un contenuto di GC compreso tra il 40% e l'80%.
      NOTA: Il contenuto di GC dell'sgRNA è importante, poiché un contenuto più elevato di GC migliora la stabilità dell'RNA e il legame con il dCas.
    5. Evitare gli sgRNA contenenti tratti di quattro o più timidine (Ts) e scegliere sgRNA con nucleotidi di adenina o timina situati quattro basi a monte del sito PAM.
      NOTA: Quattro o più T possono portare a un'interruzione prematura della trascrizione. Gli sgRNA con A o T localizzati quattro basi a monte del sito PAM possono mostrare un legame più forte con dCas.
    6. Controllare ed evitare gli sgRNA con elevata autocomplementarietà per ridurre al minimo il rischio di formazione di strutture secondarie.
    7. Finalizzare la selezione di alcune sequenze di sgRNA.
      NOTA: Sono stati progettati quattro sgRNA che si estendono su tutta l'isola CpG 326. Le sequenze target di sgRNA1-4 e le posizioni target nell'isola CpG 326 sono mostrate nella Tabella 1 supplementare.
  4. Trasformare la sequenza di sgRNA di scelta (esclusa la tripletta PAM) nel suo complemento inverso. Aggiungi GATCG all'estremità 5' della sequenza diretta e G alla sua estremità 3', e AAAAC all'estremità 5' della sequenza complementare inversa e C alla sua estremità 3'. Ordina i due oligo finali per ogni sgRNA da un fornitore di oligo commerciale.

2. Clonazione

NOTA: Questa sezione descrive l'adattamento del plasmide pEPI-1 per generare vettori episomiali che trasportano sia la fusione dCas-effettore epigenetico che le cassette di espressione di sgRNA. Vedere la Figura 2 per una panoramica completa del flusso di lavoro di clonazione e dell'architettura vettoriale. Tutte le reazioni di digestione e legatura di restrizione descritte di seguito sono state eseguite secondo i protocolli raccomandati dal produttore per ciascun enzima e reagente utilizzato, e le specifiche di reazione sono elencate in dettaglio nella Tabella supplementare 2.

  1. Digerire il plasmide pEPI-1 utilizzando AgeI e BspEI, che affiancano la sequenza codificante eGFP (enhanced green fluorescent protein). Dopo la digestione di restrizione, smussare le sporgenze risultanti utilizzando il frammento di Klenow della DNA polimerasi I. Legare la spina dorsale plasmidica con estremità smussata utilizzando la DNA ligasi T4 per generare il vettore deleto da eGFP.
    NOTA: La delezione del gene eGFP viene eseguita per ridurre la dimensione complessiva del vettore. Una dimensione del vettore maggiore potrebbe limitare le fasi di clonazione e trasfezione a valle.
  2. Ottenere le sequenze codificanti per il dominio catalitico (CD) del gene DNMT3A e l'intera lunghezza del gene HDAC1 . Aggiungere un codone di stop all'estremità 3' (a valle) di ciascuna sequenza di codifica. Aggiungere i siti di restrizione BglII (5') e AseI (3') che fiancheggiano le sequenze.
  3. Digerire il vettore pEPI-1 deleto da eGFP con BglII e AseI. Separatamente, digerire le sequenze codificanti DNMT3A(CD) e HDAC1 preparate con gli stessi enzimi. Eseguire due reazioni di legatura indipendenti:
    1. Legare il frammento DNMT3A(CD) nel vettore digerito per generare il costrutto pEPI-1-DNMT3A.
    2. Legare il frammento HDAC1 nel vettore digerito per generare il costrutto pEPI-1-HDAC1.
      NOTA: I siti BglII e AseI posizionano gli inserti a valle del promotore pCMV e a monte dell'elemento S/MAR per un'espressione ottimale.
  4. Trasformare Escherichia coli chimicamente competente (ad es. NEB 5-alfa E. coli competente, Alta efficienza) con i prodotti di legatura di ciascun vettore separatamente. Piastra le cellule trasformate su agar LB contenente kanamicina (50 μg/mL) e incubazione per una notte a 37 °C. Seleziona le colonie positive e isola il DNA plasmidico utilizzando il metodo della miniprep a bollitura rapida27,28.
  5. Ottenere la sequenza che codifica per l'SpCas9 cataliticamente morto (dCas9). Introducete i seguenti elementi nell'ordine specificato:
    1. All'estremità 5': sito di restrizione AscI, sequenza consenso di Kozak e codone di inizio (ATG).
    2. All'estremità 3': NLS, opzionalmente un tag HA, seguito da un sito di restrizione BamHI.
  6. Digerire entrambi i vettori pEPI-1-DNMT3A e pEPI-1-HDAC1 con AscI e BamHI. Eseguire la stessa digestione sull'inserto dCas9. Legare il frammento dCas9 in ciascun rispettivo vettore.
    NOTA: I siti AscI/BamHI assicurano che dCas9 sia inserito a monte di DNMT3A o HDAC1, direttamente a valle del promotore pCMV. Assicurarsi che siano presenti un linker corto o alcuni nucleotidi tra dCas9 e l'effettore epigenetico per mantenere il frame di lettura corretto.
  7. Trasformare i prodotti finali della legatura in ceppi di E. coli competenti ad alta efficienza con uno stretto controllo dell'espressione plasmidica (ad esempio, NEB 5-alfa F'Iq Competent E. coli, High Efficiency). Selezionare i trasformanti sulle piastre di kanamicina. Prepara DNA plasmidico di alta qualità da cloni positivi utilizzando il metodo miniprep a bollitura rapida.
  8. Sequenziare i costrutti plasmidici finali (pEPI-1-dCas9-DNMT3A e pEPI-1-dCas9-HDAC1) utilizzando il sequenziamento dei nanopori per confermare il corretto assemblaggio di tutti i componenti, verificare il frame di lettura utilizzando uno strumento di traduzione online (ad esempio, Expasy translate tool 3.0) e verificare la presenza di potenziali mutazioni o eventi di ricombinazione utilizzando uno strumento di allineamento online (ad esempio, BLAST alignment tool).
    NOTA: I grandi vettori sono più inclini alla ricombinazione e possono accumulare mutazioni. Pertanto, è essenziale una convalida approfondita della sequenza.
  9. Fosforilare i gruppi ossidrilici 5' degli oligonucleotidi sgRNA sia in avanti che in avanti utilizzando la chinasi polinucleotidica T4. Ibridare i due filamenti complementari riscaldando la miscela a 90 °C per diversi minuti per denaturare le strutture secondarie, quindi lasciare raffreddare gradualmente a temperatura ambiente durante la notte per una ricottura completa in DNA a doppio filamento.
  10. Digerire il vettore di espressione dell'sgRNA pGuide selezionato con BamHI ed Esp3I. Legare il frammento di sgRNA a doppio filamento ricotto nel vettore linearizzato utilizzando la DNA ligasi T4.
  11. Utilizzando specifici primer PCR (Tabella supplementare 3), amplificare l'intera cassetta di espressione del gRNA comprendente (1) promotore U6, (2) sequenza di sgRNA clonata e (3) scaffold di sgRNA. Utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà che non generi sporgenze di 3' (cioè una polimerasi di correzione di bozze) per garantire prodotti PCR puliti e smussati adatti alla clonazione a valle.
  12. Ripetere i passaggi 2.9-2.11 per ogni singolo gRNA progettato nella sezione 1. Assicurarsi che ogni cassetta di gRNA sia preparata e amplificata separatamente per preservare la specificità del bersaglio.
  13. Digerire i vettori pEPI-1-dCas9-DNMT3A e pEPI-1-dCas9-HDAC1 con SacII. Smussare le estremità appiccicose utilizzando il frammento di Klenow della DNA polimerasi I. Clonare le cassette del promotore-sgRNA-scaffold U6 precedentemente amplificate in questi vettori utilizzando la ligasi T4.
    NOTA: Durante la fase sperimentale sono state costruite diverse combinazioni di gRNA-effettori epigenetici (ad esempio, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1, ecc.). Tuttavia, solo due combinazioni selezionate sono state portate avanti per gli esperimenti presentati nelle sezioni successive.
  14. Trasformare i prodotti finali della legatura in ceppi di E. coli competenti ad alta efficienza con uno stretto controllo dell'espressione plasmidica. Selezionare i trasformanti sulle piastre di kanamicina. Prepara DNA plasmidico di alta qualità da cloni positivi utilizzando il metodo miniprep a bollitura rapida.
  15. Sequenziare i costrutti plasmidici finali utilizzando il sequenziamento dei nanopori, verificare il frame di lettura e verificare la presenza di potenziali mutazioni o eventi di ricombinazione.

3. Coltura cellulare e trasfezione

  1. Mantenere le cellule K562 in fiasche di coltura T-75 a 37 °C, a una temperatura inferiore al 5% di CO2 e in condizioni di umidità. Utilizzare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 1× soluzione di penicillina/streptomicina (Pen/Streptomyc).
  2. Preparare i plasmidi per la trasfezione:
    1. Utilizzare 8 μg di DNA plasmidico totale per trasfezione, quindi 4 μg di ciascun plasmide per una co-trasfezione di due plasmidi. Quantificare il DNA utilizzando l'assorbanza a 260 nm, quindi diluire la quantità richiesta in 90 μL di acqua ultrapura.
    2. Aggiungere 10 μl di soluzione di acetato di sodio 3 M e 2,5 volumi di etanolo al 100% al DNA diluito.
    3. Mescolare accuratamente e incubare a -20 °C durante la notte per far precipitare il DNA.
      NOTA: Quando si co-trasfezionano due plasmidi con distinte combinazioni di gRNA-effettori epigenetici (ad esempio, gRNA1-dCas9-DNMT3A e gRNA2-dCas9-HDAC1), si raccomanda di combinare entrambi i plasmidi nella stessa provetta di precipitazione per semplificare la gestione per le procedure a valle.
    4. Il giorno seguente, centrifugare le provette di precipitazione del DNA a 11.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in condizioni sterili in una cappa di biosicurezza, poiché questa fase comporterà anche la manipolazione di cellule vive.
    5. Eliminare con cautela il surnatante. Aggiungere 500 μl di etanolo al 70% per lavare il pellet. Centrifugare a 11.000 × g per 5 min a 4 °C.
    6. Rimuovere completamente il surnatante di etanolo. Lasciare asciugare il pellet all'aria fino a quando non rimane etanolo visibile.
    7. Risospendere accuratamente il pellet di DNA essiccato in 50 μL di DMEM. Conservare la soluzione plasmidico-DMEM a 4 °C fino al momento dell'uso.
    8. Eseguire 400 ng di DNA episomiale preparato (circa 2,5 μL della soluzione risospesa) su un gel di agarosio all'1% per verificare il successo della purificazione e dell'integrità del DNA prima della trasfezione.
  3. Preparare le cellule:
    1. Raccogli le cellule K562 da un pallone T-75 quando le colture raggiungono la confluenza del 50-60% per garantire l'efficienza della trasfezione.
    2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Trasferire un volume contenente 2 × 105 cellule in una piastra di coltura da 35 mm contenente 900 μl di DMEM senza FBS o antibiotici.
      NOTA: Utilizzare DMEM senza siero per tutte le fasi della procedura di trasfezione. Riprendere le condizioni di coltura completa del terreno solo dopo che il periodo di incubazione della trasfezione è stato completato.
    3. Posizionare la capsula nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per mantenere le cellule pronte per la trasfezione.
  4. Utilizzare un kit di trasfezione a base di lipofectamina per la somministrazione di plasmidi. Seguire le istruzioni del produttore per il kit specifico utilizzato, regolando i volumi se necessario.
    1. Aggiungere 3 μl di reagente P3000 (fornito nel kit di trasfezione) alla soluzione plasmidico-DMEM preparata. Mescolare delicatamente e incubare la miscela di reagenti plasmidi-P3000 a temperatura ambiente per 5 minuti.
    2. Aggiungere 5 μL di reagente Lipofectamine 3000 (fornito nel kit di trasfezione) insieme a DMEM sufficiente a raggiungere un volume di reazione totale di 100 μL. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    3. Aggiungere l'intera miscela di trasfezione da 100 μl al piatto da 35 mm contenente le cellule. Agitare delicatamente la piastra per disperdere il composto, quindi rimettere la piastra nell'incubatrice.
  5. A 24 ore dalla trasfezione, aggiungere 3 mL di terreno completo (DMEM integrato con FBS al 10% e 1× Pen/Strep) a ciascuna piastra da 35 mm per avviare la proliferazione delle cellule trasfettate. A 72 ore dalla trasfezione, iniziare la procedura di selezione aggiungendo l'antibiotico G-418 a una concentrazione finale di 1 mg/mL.
  6. Una volta che la selezione è stata adeguatamente stabilita e la conta totale delle cellule supera 1 × 106, procedere all'isolamento di singoli cloni (Figura 3A) utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS):
    1. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 × g per 6 minuti a 25 °C. Lavare una volta con soluzione salina sterile tamponata con fosfato all'1× (PBS, pH ~7,4) e centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni.
    2. Risospendere il pellet cellulare in PBS 1× e determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro. Diluire la sospensione a 1 × 106 cellule/mL, garantendo una risospensione completa.
    3. Impostare FCS in modalità da più breve a singola cellula (garantisce 1 cellula per gocciolina), utilizzando una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti come dispositivo di raccolta. Se necessario, regolare le impostazioni del software, a seconda dello strumento utilizzato (Figura 3B).
    4. Gate della popolazione primaria in base alle dimensioni previste (FSC) e alla granularità (SSC). Escludere detriti (basso FSC/SSC) e materiale altamente granulare o morto (alto SSC). Utilizza i dot plot FSC-A vs. FSC-H o SSC-A vs. SSC-H per bloccare i singolettoni.
    5. Pre-riempire la piastra a 96 pozzetti con 100 μL di terreno pieno contenente 1 mg/mL di G-418 per pozzetto. Riscaldare la piastra nell'incubatrice prima della cernita.
    6. Eseguire l'ordinamento in modalità cella singola, mantenendo una velocità di ordinamento inferiore a 300 eventi/secondo per migliorare la precisione dell'ordinamento.
    7. Dopo lo smistamento, ispezionare i pozzetti al microscopio per confermare una cellula per pozzetto. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2.
  7. Consentire ai cloni a singola cellula di espandersi individualmente nella piastra a 96 pozzetti. Una volta stabilita la crescita clonale, ridurre la concentrazione di G-418 a 400 μg/mL per mantenere la selezione.
  8. Trasferire i cloni in buona crescita in sequenza su piastre a 12 pozzetti, poi su fiasche T-25 e infine T-75 secondo necessità, fino a quando ogni clone raggiunge ~1 × 106 cellule.
  9. Raccogliere i pellet a doppia cella a intervalli regolari. Conservare un pellet a -20 °C per l'estrazione del DNA genomico. Inoltre, conservare un pellet omogeneizzato in 500 μL di reagente Trizol a -20 °C per l'estrazione dell'RNA e la sintesi del cDNA.
    ATTENZIONE: Il reagente Trizol deve essere maneggiato con cautela a causa della sua tossicità e natura corrosiva in una cappa chimica mentre si indossano dispositivi di protezione individuale e i materiali contaminati devono essere etichettati per lo smaltimento di rifiuti pericolosi.
  10. Estrarre il DNA genomico da cloni selezionati utilizzando l'estrazione tradizionale fenolo-cloroformio, seguita dalla precipitazione dell'etanolo.
    ATTENZIONE: Il fenolo: il cloroformio è tossico e corrosivo e deve essere maneggiato in una cappa chimica indossando dispositivi di protezione individuale. Smaltire i rifiuti contenenti fenolo e cloroformio come rifiuti chimici pericolosi.
  11. Assicurarsi che il DNA sia completamente risospeso in acqua priva di nucleasi o tampone TE. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA utilizzando uno spettrofotometro prima di procedere alle applicazioni a valle.
    NOTA: Questo DNA sarà utilizzato in esperimenti a valle come la PCR e il pirosequenziamento per valutare l'efficienza dell'editing epigenetico.
  12. Estrarre l'RNA totale dai pellet cellulari utilizzando il reagente Trizol, seguito dalla precipitazione dell'isopropanolo29. Maneggiare i campioni di RNA con cautela assicurandosi che i reagenti e i prodotti monouso siano privi di RNasi e mantenendo i campioni a 4 °C durante la procedura.
    NOTA: L'RNA totale sarà utilizzato per la sintesi del cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa.

4. PCR per confermare la presenza di entrambi gli episomi nei cloni

  1. Raccogliere circa 5 × 105 cellule da ciascun clone di coltura, dopo aver risospeso accuratamente le cellule. Centrifugare a 7.000 x g per 3 minuti a 25 °C. Scartare il mezzo surnatante.
  2. Lavare la cella ririspendendo in 1× PBS. Centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni.
  3. Scartare il surnatante, lasciandone un piccolo volume, appena sopra il livello del pellet. Utilizzare 1 μl di sospensione cellulare direttamente come modello per la PCR.
  4. In alternativa, utilizzare 200 ng di DNA genomico purificato estratto dai cloni trasfettati.
    NOTA: La PCR diretta da cellule lavate fornisce un metodo di screening rapido, ma può produrre risultati variabili. Per una maggiore specificità e sensibilità, utilizzare il DNA genomico purificato come modello.
  5. Preparare la master-mix per PCR secondo la Tabella 1.
  6. Utilizzare due serie di primer, con un primer diretto comune mirato alla sequenza dCas9 e primer inversi separati specifici per ciascun vettore effettore epigenetico (Tabella supplementare 3).
  7. Seguire le condizioni di ciclismo presentate nella Tabella 2.
  8. Eseguire i prodotti PCR su gel di agarosio o analizzarli con elettroforesi capillare per verificare le dimensioni del prodotto: 230 bp per il vettore contenente DNMT3A e 205 bp per il vettore contenente HDAC1 (Figura 3C). Includere un controllo positivo (miscela di entrambi i plasmidi a una concentrazione di 10-20 ng) per confermare le dimensioni della banda previste e convalidare l'efficienza della PCR. Includere un controllo senza modello (NTC).
ReagenteConcentrazione/quantità finale
10× Tampone1×
Innesco in avanti1 μΜ
Inneschi inversi0,5 μM
DNA200 ng
Polimerasi1.25 U
dNTP200 μM ciascuno
Acqua, senza nucleasifino a 50 μL

Tabella 1: Miscela di reazioni PCR per la verifica degli episomi.

PassoTemperatura, °COreNumero di cicli
Denaturazione iniziale953 minuti1
Denaturazione9530 secondi30
Ricottura5830 secondi
Estensione721 minuto
Estensione finale725 minuti1

Tabella 2: Condizioni di ciclo PCR per la verifica dell'episoma.

5. Analisi di pirosequenziamento mirato

  1. Trattare il gDNA (1,5 μg) estratto da cloni trasfettati con un kit di conversione del bisolfito secondo le istruzioni del produttore.
  2. Primer di progettazione che fiancheggiano i siti CpG all'interno della regione regolatoria interessata dai costrutti. Utilizzare uno strumento di progettazione di primer al bisolfito dedicato. Segui queste linee guida per la progettazione:
    1. Convertire l'isola CpG o la regione di regolamentazione del sito CpG nella versione convertita con bisolfito.
    2. Progettare un primer diretto e inverso per l'amplificazione PCR del DNA convertito con bisolfito. Includere un'etichetta di biotina su un primer (di solito il contrario) per l'immobilizzazione su perle rivestite di streptavidina.
    3. Progettare un primer di sequenziamento (18-25 bp) interno al prodotto PCR, a monte del primo CpG di interesse. Come regione target, selezionare una finestra di 100 bp a monte o a valle del sito di legame dell'sgRNA per valutare potenziali modificazioni epigenetiche locali.
    4. Evitare i siti CpG all'interno delle sequenze di primer per garantire un'amplificazione imparziale.
    5. Scegliete una coppia di primer con un punteggio del software Assay Design superiore al 75% e una valutazione di qualità "alta" (blu), che indica che l'analisi del software non ha identificato alcun problema o preoccupazione.
      NOTA: Per le sequenze di primer progettate per colpire l'isola CpG 326, consultare la Tabella supplementare 3. I primer sono stati progettati per legarsi nelle regioni che fiancheggiano i siti di legame di sgRNA1 e sgRNA2, consentendo il sequenziamento dei siti CpG che circondano i loci bersaglio.
  3. Imposta una reazione PCR utilizzando una DNA polimerasi hot-start ad alta fedeltà ottimizzata per i modelli di bisolfito.
  4. Procedura di pirosequenziamento:
    1. Legare i prodotti della PCR biotinilata alle perle di sefarosio rivestite di streptavidina e isolare il DNA a filamento singolo utilizzando una workstation di pirosequenziamento.
    2. Aggiungere il primer di sequenziamento al DNA a filamento singolo nel tampone di ricottura. Scaldare il composto a 80 °C per 2 minuti, quindi lasciarlo raffreddare gradualmente a temperatura ambiente.
    3. Eseguire le reazioni di sequenziamento utilizzando lo strumento di pirosequenziamento e l'ordine di dispensazione definito durante la progettazione del primer.
  5. Analisi dei dati:
    1. Utilizzare un software di pirosequenziamento dedicato per quantificare la percentuale di metilazione in ciascun sito CpG.
    2. Confrontare i livelli di metilazione tra cloni trasfettati e non trasfettati. Valutare l'efficienza dell'editing (Figura 3D). Prendere in considerazione l'esecuzione di un t-test non appiato a due code per confrontare i livelli di metilazione tra i controlli non trattati e ciascun clone trasfettato in ogni singolo sito CpG.

6. sintesi di cDNA e PCR digitale per l'analisi dell'espressione di dCas

  1. Preparare l'RNA totale (1.100 ng per reazione) estratto da cloni trasfettati in 12 μL di acqua priva di RNasi. Conservare i campioni sul ghiaccio.
  2. Assemblare la miscela di eliminazione del DNA genomico su ghiaccio: Mescolare 2 μL di tampone di wipeout del gDNA, un campione di RNA contenente 1.100 ng di RNA totale e acqua priva di RNasi fino a un volume finale di 14 μL. Incubare per 2 minuti a 42 °C, quindi porre su ghiaccio.
  3. Preparare la master mix di trascrizione inversa su ghiaccio: mescolare 4 μL di tampone RT con 1 μL di primer RT e aggiungere 1 μL di trascrittasi inversa.
  4. Combinare 14 μl di miscela per l'eliminazione del DNA genomico con 6 μl di master mix per trascrizione inversa fino a un volume di reazione totale di 20 μl. Miscelare delicatamente e incubare a 42 °C per 15 minuti. Inattivare la trascrittasi inversa riscaldandola a 95 °C per 3 min.
    NOTA: Conservare il cDNA a -20 °C fino a nuovo utilizzo.
  5. Diluire il cDNA di tutti i campioni 1:1 con acqua priva di nucleasi. Utilizzare il cDNA diluito per l'analisi PCR digitale a valle, utilizzando un sistema PCR digitale con primer specifici per dCas (Tabella supplementare 3):
    1. Preparare la miscela master 4× e la miscela di reazione secondo la tabella 3. Aggiungere il cDNA diluito alla miscela e pipettare delicatamente per garantire una miscelazione accurata.
      NOTA: Impostare le reazioni almeno in duplicati per tutti i cloni. Includere un controllo negativo (cDNA da cellule K562 non trattate) e un NTC.
    2. Caricare 9 μl della miscela di reazione in ciascun pozzetto della piastra PCR. Configurare il sistema PCR utilizzando le condizioni di ciclo presentate nella Tabella 4.
    3. Selezionare il canale di tintura FAM per il rilevamento e avviare la corsa.
    4. Al termine, recuperare i campioni e analizzare i dati.
      NOTA: La PCR digitale riporta i risultati come copie per μL di reazione.
    5. Moltiplicare il valore riportato (copie/μL) per il volume di reazione (10 μL) per ottenere copie totali per reazione. Dividi questo valore per la quantità di cDNA nella reazione per ottenere copie per ng di cDNA (equivalente all'input di ng RNA).
      NOTA: Se viene seguito il protocollo esatto, ogni campione inizia con 1.100 ng di RNA in una reazione RT da 20 μL (55 ng/μL). Dopo la diluizione 1:1, la concentrazione di lavoro è di 27,5 ng/μl e, poiché 1 μl viene aggiunto a ciascuna reazione di PCR, ciò corrisponde a 27,5 ng di cDNA (RNA-equivalente) per reazione.
Miscela master (4×)
ReagenteConcentrazione/quantità finale
25× SYBR Colorante verde2×
5× Miscela per PCR digitale4×
Acqua, senza nucleasifino a 100 μl
Miscela di reazione
ReagenteConcentrazione/quantità finale
4× Mix principale1×
Innesco in avanti1 μΜ
Innesco inverso1 μΜ
cDNA (diluito)1 μl
Acqua, senza nucleasifino a 10 μl

Tabella 3: 4× Master mix e reaction mix per l'analisi PCR digitale dell'espressione di dCas.

PassoTemperatura, °COreNumero di cicli
Denaturazione iniziale9610 minuti1
Denaturazione965 secondi40
Ricottura/Estensione6015 secondi

Tabella 4: Condizioni cicliche per la PCR digitale.

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Risultati

Per indagare se i nostri strumenti di editing epigenetico mirato potessero indurre cambiamenti di metilazione del DNA sito-specifici nell'isola ZBTB7A CpG 326, abbiamo prima generato vettori episomiali codificanti dCas9 fusi con DNMT3A(CD) o HDAC1, insieme a vari sgRNA progettati con siti bersaglio all'interno dell'isola CpG 326. Inizialmente abbiamo co-trasfettato le cellule K562 con combinazioni di questi plasmidi per valutare se la consegna simultanea di sgRNA e moduli effett...

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Discussione

Uno dei passaggi più critici di questo protocollo è la progettazione di sgRNA altamente specifici. Gli effetti off-target sono una limitazione nota dei sistemi di editing epigenetico basati su CRISPR, che spesso possono derivare dall'infedeltà del legame dCas9, nonché dall'attività non specifica dei domini effettori. Per ridurre al minimo questo problema, gli sgRNA devono essere progettati utilizzando strumenti bioinformatici che ottimizzino l'elevata attività on-target e il minimo legam...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o non finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Irene Dereki e Vasiliki Chondrou sono sostenuti da una borsa di studio triennale (sovvenzione n. 80706) dal Conto Speciale dei Fondi di Ricerca (ELKE) dell'Hellenic Open University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)Biosistemi applicatiA52490
AgeI-HF NEBR3552
ASCINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS Classificatore di Celle MelodicheBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Miscela di soluzione desossinucleotidica (dNTP) (10 mM ciascuna)NEBN0447
DMEM Glucosio alto con glutamina stabile, con medium piruvato di sodioBiowestL0103
DNA polimerasi I, Frammento di Grandi Dimensioni (Klenow)NEBM0210
DNMT3A (CD), sequenze HDAC1IDT
DreamTaq DNA Polimerasi Thermo ScientificEP0712
EpiTectQiagen59104Kit di conversione bisolfito & nbsp;
Kit Epitect BisolfitiQiagen59104
Esp3INEBR0734
Siero bovino fetaleGibcoA5256701
Antibiotico selettivo geneticina (solfato G418)Gibco11811031
Kit di trasfezione Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015
NEB®   5-alpha Competent E. coli  (Alta Efficienza)NEBC2987I
NEB®   5-alfa F'Iq  Competent E. coli  (Alta Efficienza)NEBC2992H
Tessuto nucleospin  Macherey-Nagel740952.50
PBS, soluzione 10x pH 7,4LonzaBE17-517Q
Soluzione di penicillina-streptomicina 100xBiowestL0022
Vettore pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Fenolo:Cloroformio:Isoamilico Alcool 25:24:1 Saturo di 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Primer, sgRNA e nbsp;Eurofin
PyroMark Assay Design  QiagenVersione 2.0Strumento per la progettazione di primer al bisolfito 
Reagenti PyroMark Gold Q24Qiagen970802
Kit PCR PyroMark  Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenPostazione di lavoro pirosequenziante 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Software di pirosequenziamento  
Q5® DNA polimerasi ad alta fedeltàNEBM0491
Kit di trascrizione inversa QuantiTectQiagen205311
Kit per piastre QuantStudio Absolute Q MAP16Biosistemi applicatiA52865Sistema PCR digitale  
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, concentrato 10.000x in DMSOInvitrogenS7563
Ligasi del DNA T4NEBM0202
Polinucleotidico chinasi T4NEBM0201
Reagente TrizolInvitrogen15596026

Riferimenti

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