Articolo metodologico

Ingegneria epigenetica delle cellule K562: strategia episomiale a doppio vettore per la metilazione mirata stabile del DNA utilizzando le proteine di fusione dCas9-DNMT3A e -HDAC1

DOI:

10.3791/69328

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31 ottobre 2025

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1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un sistema non integrativo, basato su CRISPR/dCas9 episomiale per l'editing epigenetico mirato nelle cellule K562, che combina effettori dCas9-DNMT3A e dCas9-HDAC1 con sgRNA specifici per indurre la metilazione del DNA locus-specifica con precisione e riduzione degli effetti off-target.

Abstract

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Lo studio del ruolo preciso della metilazione del DNA nella regolazione trascrizionale genica e lo sviluppo di terapie mirate a specifici modelli di metilazione genica presentano sfide significative a causa della scarsità di strumenti versatili in grado di indurre modificazioni epigenetiche sito-specifiche e a lungo termine per modulare l'espressione genica. Lo studio mirava a sviluppare e convalidare un sistema innovativo basato sull'episomio per facilitare la metilazione stabile del DNA in un locus genico mirato, potenzialmente utile sia per la ricerca epigenetica di base che per le applicazioni terapeutiche. Per raggiungere questo obiettivo, la linea cellulare K562 è stata co-trasfettata con due distinti vettori episomiali. Entrambi i tipi di vettori sono stati ingegnerizzati per esprimere RNA guida (gRNA) che hanno come bersaglio una regione non metilata di 367 bp all'interno dell'isola CpG 326, situata a monte del gene ZBTB7A . Ogni vettore codificava una forma disattivata di endonucleasi Cas9 (morta o dCas9) fusa al dominio catalitico della DNA metiltransferasi DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) o all'istone deacetilasi HDAC1 (dCas-HDAC1). La sequenza dCas includeva due segnali di localizzazione nucleare (NLS) per garantire l'importazione nucleare della proteina. Questa cassetta di espressione a doppio sistema promuove uno stato di cromatina potenzialmente favorevole al silenziamento epigenetico a lungo termine, promettendo risultati epigenetici robusti e duraturi. Questo approccio intermedio all'epigenoma dell'ospite attraverso l'utilizzo di vettori episomiali autoreplicanti offre diversi vantaggi: mantenimento ed espressione di vettori a basso numero di copie in più divisioni cellulari senza integrazione nel genoma dell'ospite, riducendo così al minimo gli effetti off-target e preservando l'integrità del genoma. Riportiamo l'aumento preciso e significativo della metilazione del DNA presso l'isola ZBTB7A CpG 326 bersaglio. I risultati confermano che i sistemi episomiali CRISPR/dCas ingegnerizzati possono suscitare una metilazione del DNA duratura e sito-specifica. Pertanto, questo sistema è un prezioso strumento di ricerca per valutare gli effetti funzionali di cambiamenti mirati della metilazione e una piattaforma promettente per lo sviluppo di futuri trattamenti epigenetici.

Introduzione

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La regolazione epigenetica, compresa la metilazione del DNA e le modificazioni degli istoni, svolge un ruolo fondamentale nel controllo dell'espressione genica, della differenziazione cellulare e della stabilità del genoma. La disregolazione di questi meccanismi è spesso coinvolta - sia come causa che come conseguenza - in vari stati patologici, in particolare nel cancro, nei disturbi neurologici e nelle sindromi da imprinting 1,2,3. In particolare, intervenendo con precisione sul panorama epigenetico in specifici loci genomici utilizzando la....

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Protocollo

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1. Progettazione di sgRNA

  1. Identificare l'isola CpG desiderata o i siti CpG regolatori all'interno della regione promotrice del gene di interesse utilizzando un browser del genoma (ad esempio, il browser del genoma UCSC). Qui, il disegno è stato applicato sull'isola CpG 326 (GRCh38) del gene ZBTB7A .
  2. Progetta RNA guida singola (sgRNA) utilizzando una piattaforma di progettazione di sgRNA CRISPR online [ad esempio, CHOPCHOP web tool (versione 3)]. Quando si progettano gli sgRNA, seguire le raccomandazioni seguenti per garantire un'elevata attività on-target ed effetti off-target minimi:

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Risultati

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Per indagare se i nostri strumenti di editing epigenetico mirato potessero indurre cambiamenti di metilazione del DNA sito-specifici nell'isola ZBTB7A CpG 326, abbiamo prima generato vettori episomiali codificanti dCas9 fusi con DNMT3A(CD) o HDAC1, insieme a vari sgRNA progettati con siti bersaglio all'interno dell'isola CpG 326. Inizialmente abbiamo co-trasfettato le cellule K562 con combinazioni di questi plasmidi per valutare se la consegna simultanea di sgRNA e moduli effett.......

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Discussione

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Uno dei passaggi più critici di questo protocollo è la progettazione di sgRNA altamente specifici. Gli effetti off-target sono una limitazione nota dei sistemi di editing epigenetico basati su CRISPR, che spesso possono derivare dall'infedeltà del legame dCas9, nonché dall'attività non specifica dei domini effettori. Per ridurre al minimo questo problema, gli sgRNA devono essere progettati utilizzando strumenti bioinformatici che ottimizzino l'elevata attività on-target e il minimo legam.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o non finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Irene Dereki e Vasiliki Chondrou sono sostenuti da una borsa di studio triennale (sovvenzione n. 80706) dal Conto Speciale dei Fondi di Ricerca (ELKE) dell'Hellenic Open University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)Biosistemi applicatiA52490
AgeI-HF NEBR3552
ASCINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
BD FACS Classificatore di Celle MelodicheBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Miscela di soluzione desossinucleotidica (dNTP) (10 mM ciascuna)NEBN0447
DMEM Glucosio alto con glutamina stabile, con medium piruvato di sodioBiowestL0103
DNA polimerasi I, Frammento di Grandi Dimensioni (Klenow)NEBM0210
DNMT3A (CD), sequenze HDAC1IDT
DreamTaq DNA Polimerasi Thermo ScientificEP0712
EpiTectQiagen59104Kit di conversione bisolfito & nbsp;
Kit Epitect BisolfitiQiagen59104
Esp3INEBR0734
Siero bovino fetaleGibcoA5256701
Antibiotico selettivo geneticina (solfato G418)Gibco11811031
Kit di trasfezione Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015
NEB®   5-alpha Competent E. coli  (Alta Efficienza)NEBC2987I
NEB®   5-alfa F'Iq  Competent E. coli  (Alta Efficienza)NEBC2992H
Tessuto nucleospin  Macherey-Nagel740952.50
PBS, soluzione 10x pH 7,4LonzaBE17-517Q
Soluzione di penicillina-streptomicina 100xBiowestL0022
Vettore pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Fenolo:Cloroformio:Isoamilico Alcool 25:24:1 Saturo di 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Primer, sgRNA e nbsp;Eurofin
PyroMark Assay Design  QiagenVersione 2.0Strumento per la progettazione di primer al bisolfito 
Reagenti PyroMark Gold Q24Qiagen970802
Kit PCR PyroMark  Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenPostazione di lavoro pirosequenziante 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Software di pirosequenziamento  
Q5® DNA polimerasi ad alta fedeltàNEBM0491
Kit di trascrizione inversa QuantiTectQiagen205311
Kit per piastre QuantStudio Absolute Q MAP16Biosistemi applicatiA52865Sistema PCR digitale  
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, concentrato 10.000x in DMSOInvitrogenS7563
Ligasi del DNA T4NEBM0202
Polinucleotidico chinasi T4NEBM0201
Reagente TrizolInvitrogen15596026

Riferimenti

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  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laborato....

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Tag

dCas9 HDAC1Vettori episomaliMetilazione mirataEpigenetica CRISPRCitometria a flussoRegolazione genica

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