Articolo metodologico

Isolamento di protoplast di alta qualità specifico per tessuto per analisi a singola cellula in Arabidopsis

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 febbraio 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un protocollo avanzato di isolamento dei protoplasti per i tessuti radici, foglie, steli e floreali di Arabidopsis thaliana. Utilizza passaggi ottimizzati di digestione e purificazione enzimatica per minimizzare danni cellulari e detriti, aumentando così la resa e ottenendo protoplasti di alta qualità per metodi a singola cellula, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) è diventato uno strumento essenziale in biologia vegetale per ottenere informazioni ad alta risoluzione sull'espressione genica specifica per tipo cellulare, sulla dinamica dello sviluppo e sulle risposte specifiche dei tessuti ai fattori ambientali. Una delle principali sfide tecniche nell'applicazione dello scRNAseq alle piante è l'isolamento efficiente e riproducibile di singole cellule vitali senza pareti cellulari, rappresentando l'eterogeneità dei tessuti vegetali. L'isolamento con protopasto, che rimuove enzimaticamente la parete cellulare per ottenere singole cellule vegetali vive, è un approccio ampiamente utilizzato a questo scopo. Tuttavia, un isolamento riuscito dei protoplasti richiede un'attenta ottimizzazione per mantenere la vitalità cellulare e preservare i profili del trascrittoma specifici per tipo cellulare. Qui presentiamo un protocollo robusto e riproducibile per isolare protoplasti di alta qualità da molteplici tessuti di Arabidopsis thaliana , inclusi quelli in superficie (foglie, steli, fiori) e tessuti radicali. Questo protocollo tiene conto delle proprietà fisiologiche uniche dei tipi di tessuto, ottimizzando le condizioni di digestione enzimatica e i passaggi di purificazione per garantire un'elevata resa e una rappresentanza ampia di diversi tipi cellulari. I protoplasti risultanti sono adatti ad applicazioni come scRNAseq, citometria di flusso (FACS) e analisi dell'espressione genica transitoria. Permette la generazione di sospensioni monocellulari da più tipi di tessuto. Il metodo presentato supporta l'esplorazione dell'eterogeneità cellulare e migliora l'affidabilità degli approcci a singola cellula nella ricerca sulle piante.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) ha rivoluzionato la biologia vegetale permettendo l'analisi dell'espressione genica a una risoluzione senza precedenti. scRNAseq fornisce informazioni sul trascrittoma sull'eterogeneità cellulare, le traiettorie di sviluppo e le risposte agli stimoli ambientali a risoluzione specifica per tipocellulare 1,2,3.

A differenza dei sistemi animali, la parete cellulare rigida delle piante e la complessità strutturale dei tessuti vegetali rappresentano barriere significative all'isolamento efficiente delle singole cellule per l'analisi trascrittomica. Tra i metodi disponibili, la rimozione enzimatica della parete cellulare per produrre protoplasti è emersa come un metodo ampiamente utilizzato, sviluppato più di 60 anni fa 4,5,6. Nonostante il suo uso diffuso, l'isolamento dei protoplasti rimane una procedura tecnicamente impegnativa che richiede un'ottimizzazione specifica per tessuto per bilanciare la resa cellulare, la vitalità e un transcriptoma stabile. Metodi alternativi, come il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq), evitano la necessità di digestione della parete cellulare isolando inuclei 7. Tuttavia, ciò comporta la perdita di informazioni sui trascrizioni mature presenti nel citoplasma. Altri metodi di dissociazione fisica, come la microdissezione meccanica e assistita da laser, evitano la digestione enzimatica della parete cellulare ma sono spesso suscettibili alla contaminazione incrociata e possono portare a una diminuzione della vitalità cellulare e a una portatalimitata 8,9,10.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti atlanti cellulari vegetali, in particolare per Arabidopsis, fornendo importanti approfondimenti sui paesaggi trascritomici di varitessuti 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tuttavia, questi atlanti si basano principalmente su piante in stadio giovanile o di piantuglie, concentrandosi principalmente su tessuti radicali o fogliari. I protocolli utilizzati in questi studi richiedono processi di ottimizzazione per i tessuti più anziani di Arabidopsis, come foglie mature, fiori e steli. Inoltre, fino all'uso di studi di sequenziamento specifici per tipo cellulare come scRNAseq o Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) combinati con sequenziamento RNA, i cambiamenti trascritomatici causati dall'isolamento del protoplasto non sono stati completamenteconsiderati 19.

Il metodo qui presentato si basa su sforzi precedenti introducendo diversi miglioramenti fondamentali: tiene conto della variabilità fisiologica e anatomica tra i tessuti vegetali ottimizzando le concentrazioni tampone sia per i tessuti radicali che per quelli sopra il suolo (foglie, steli, fiori) e incorpora passaggi delicati di purificazione per minimizzare i danni cellulari e migliorare la purezza dei protoplasti. Rispetto agli approcci basati su nuclei, questo metodo ha il potenziale di trattenere il trascritoma dell'intera cellula, consentendo informazioni a risoluzione più elevata delle molecole di mRNA mature presenti nel citosol. È importante notare che la procedura garantisce un'elevata vitalità del protoplasto, eterogeneità e concentrazioni riproducibili tra i tessuti, che vanno da circa 9,8 × 103 cellule/mg nei fiori a 2,2 × 102 cellule/mg nelle foglie.

L'obiettivo generale del metodo presentato è presentare un protocollo di isolamento di protoplasti robusto e riproducibile, adattato per molteplici tessuti di Arabidopsis thaliana, rispondendo a una necessità critica di input di alta qualità che copra diversi tipi cellulari per studi su singole cellule vegetali.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del tampone

  1. Preparare il rispettivo buffer di isolamentoprotoplasto 17,18 secondo la Tabella 1 in un tubo centrifuga da 15 mL; Buffer isolante per protoplasti radicali per tessuto radicale o buffer isolante per protoplasti fiore/stelo/foglia per tessuti sopra il suolo.
    NOTA: Quantità approssimativa di tampone isolante del protoplasto necessaria per cinque piante da fiore di Arabidopsis thaliana raccolte (stadio 11-12 con boccioli chiusi): Radice (~ 375 mg): 7 mL, Foglia (~930 mg): 5 mL, Fusto (~215 mg): 3 mL, Fiore (~10 mg): 2 mL.
  2. Aggiungi il 2% (p/v) di cellulasi RS e l'1% (p/v) di Macerozima R10 fresco prima di usare il tampone isolante del protoplasto radice/foglia. Mescola bene mettendo il tampone di isolamento del protoplasto su un rotatore finché la polvere non si scioglie completamente (circa 10 minuti a 25 °C). Evita di creare bolle d'aria e assicurati che non ci siano grumi di polvere all'interno del tampon.

2. Digestione dei tessuti

  1. Filtrare il rispettivo buffer di isolamento del protoplasto attraverso un filtro da 0,2 μm prima di utilizzarlo. Usa una piastra di Petri di dimensioni standard (100 mm x 15 mm) per foglie e radici, e una piastra di Petri di piccole dimensioni (30 mm x 15 mm) per piccole quantità di tessuti come i fiori. Aggiungi alcune gocce di buffer isolante protoplasto nella piastra di Petri prima di trasferire i tessuti.
  2. Trasferisci il tessuto rispettivo nella piastra di Petri e taglialo in pezzi più piccoli con movimenti verticali usando una lametta il più fine e velocemente possibile (Figura 1A).
    NOTA: Usa sempre lame e pinzette diverse per ogni campione per evitare contaminazioni incrociate. Indossa guanti protettivi mentre maneggi la lametta.
  3. Aggiungere il residuo di isolamento del protoplasto nella rispettiva piastra di Petri per immergere il tessuto tagliato e incubare a 25 °C per 1 ora. Tieni i tessuti sopra il terreno sulla panca (senza scuoti) e trasferisci i tessuti radicali su una piattaforma oscillatrice orbitale (60 giri/min).

3. Filtrazione

  1. Campione radicale dopo l'incubazione:
    1. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire i protoplasti dalla piastra di Petri a un Cell Strainer da 40 μm posizionato sopra un tubo centrifuga aperto pre-raffreddato da 50 mL.
    2. Per raccogliere i protoplasti rimanenti, si aggiunge lo stesso esatto volume di soluzione W5 (2 mM pH 5,7 di MES, 154 mM di NaCl, 125 mM diCaCl 2, 5 mM di KCl) nella stessa piastra di Petri per raccogliere i protoplasti aderiti alla base della piastra di Petri. Trasferire i protoplasti risosspesi nella soluzione W5 allo stesso Cell Strainer da 40 μm posto sopra un tubo centrifuga aperto pre-raffreddato da 50 mL.
    3. Passalo una seconda volta attraverso un nuovo filtro a celle da 40 μm in un nuovo tubo centrifuga pre-raffreddato da 50 mL. D'ora in poi, tieni i campioni sul ghiaccio e sii molto delicato nel maneggiare i protoplasti.
  2. Campioni sopra il suolo dopo l'incubazione:
    1. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire i protoplasti dalla piastra di Petri a un Filtro Cellulare da 70 μm posizionato sopra un tubo centrifuga aperto pre-raffreddato da 50 mL.
    2. Per raccogliere i protoplasti rimanenti, si aggiunge lo stesso esatto volume di soluzione W5 (2 mM pH 5,7, 154 mM NaCl, 125 mMCaCl 2, 5 mM KCl) nella stessa piastra di Petri per raccogliere i protoplasti aderiti alla base della piastra di Petri. Trasferire i protoplasti risospesosi nella soluzione W5 allo stesso Cell Strainer da 70 μm posto sopra un tubo centrifuga aperto pre-raffreddato da 50 mL. D'ora in poi, tieni i campioni sul ghiaccio e sii molto delicato con i protoplasti.

4. Lavaggio e purificazione di Ficoll

  1. Pre-raffredda la centrifuga a 4 °C e raccogli (pellet) i protoplasti per 5 minuti a 500 × g senza freno zero della centrifuga.
  2. Campione radicale dopo centrifugazione:
    1. Scartare il sovrantante senza disturbare il pellet di protoplasto.
    2. Risospensa i protoplasti molto delicatamente in un buffer di risospensione radicale pre-raffreddato (4 °C) da 600-700 μL (parti uguali di isolamento del protoplasto radiciare (senza enzimi) e soluzione W5) utilizzando una pipetta Pasteur o una pipetta Gilson da 1 mL con punta tagliata per evitare il taglio del taglio.
    3. Trasferire la sospensione a tubi pre-raffreddati (4 °C) da 1,5 mL.
  3. Campioni sopra il suolo dopo centrifugazione:
    1. Scarta il soprantantante senza disturbare il pallino.
    2. Sospendere il pellet molto delicatamente in un buffer di risospensione di fiori/steli/foglie pre-raffreddato (4 °C) da 600-700 μL (parti uguali di isolamento protoplasto fiore/stelo/foglia (senza enzimi) e soluzione W5) utilizzando una pipetta Pasteur o una pipetta Gilson da 1 mL con punta tagliata per evitare la tosatura.
    3. Trasferire la sospensione a tubi pre-raffreddati (4 °C) da 1,5 mL.
    4. Prepara 300 μL di soluzione al 13,3% (p/v) di Ficoll PM 400 in un tubo da 1,5 mL. Mescola e tieni sul ghiaccio.
    5. Aggiungi lentamente il campione di protoplasto sospeso (600-700 μL) sopra la soluzione di Ficoll preparata senza toccare o mescolare lo strato di Ficoll.
    6. Centrifugare a 4 °C per 5 minuti a 700 × g con impostazione zero della centrifuga.
    7. Raccogli i protoplasti presenti nello strato intermedio (interfaccia) insieme alla fase superiore (primo strato) (Figura 1B). Fai attenzione a non raccogliere il terzo strato inferiore, che contiene Ficoll e i detriti separati. Conserva a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.

5. Conteggio e controllo qualità

  1. Utilizzare 10 μL della soluzione del protoplasto per contare il numero di protoplasti isolati con un emocitometro di Neubauer.
    OPZIONALE: È possibile aggiungere un colorante Evans Blue all'1% (p/v) per valutare la vitalità dei protoplasti (Figura 1C).
  2. Diluire la soluzione del protoplasto alla concentrazione richiesta di protoplasti/mL utilizzando un tampone di risospensione pre-raffreddato (4 °C) (spiegato nello step 4.2.2 per la radice e nello step 4.3.2 per i tessuti sopra il suolo) del rispettivo tessuto.
  3. Procedere con l'esperimento previsto il più rapidamente possibile, ad esempio sequenziamento di RNA a singola cellula e/o FACS15,19.

Risultati

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I protocolli di isolamento dei protoplasti implementati per tessuti sopra il suolo e radicali permettono con successo una digestione efficiente della parete cellulare e il rilascio di singole cellule intate da tutti i tessuti di Arabidopsis thaliana. Tra i tipi di tessuto testati, che includevano fiori, steli, foglie e radici, il processo di digestione enzimatica ha prodotto protoplasti ben separati con un numero minimo di gruppi cellulari non digeriti (Figura 2A-D). I saghi di colorante Evans Blue hanno confermato che i protoplasti che mostravano morfologia sferica con limiti lisci della membrana plasmatica sono cellule vitali (Figura 1C). Per ogni tipo di tessuto, sono stati conteggiati i protoplasti sferici. I fiori contenevano in media 97.875 ± 7.531 (9.788 celle/mg, n = 3), steli 119.025 ± 22.508 (550 cellule/mg, n = 4), foglie 210.483 ± 15.572 (225 celle/mg, n = 3) e radici 225.363 ± 52.561 (599 celle/mg, n = 4).

Le sospensioni dei protoplasti mostravano una distribuzione ampia delle dimensioni cellulari e la presenza di plastidi verdi o pallidi, riflettendo la composizione cellulare eterogenea di ciascun tessuto prelevato (Figura 3A-D). Per confermare ciò, è stata eseguita un'isolazione protoplastica con una linea reporter YFP specifica per cellule compagne transgeniche, e la sospensione conteneva piccoli protoplasti vitali con un segnale YFP che rappresenta cellule compagne (Figura 3E). Questo sottolinea che il protocollo di isolamento del protoplasto utilizzato è adatto a cellule vascolari difficili da isolare con pareti cellulari rigide.

Con il metodo ottimizzato presentato, si può isolare un alto numero di protoplasti vitali con una quantità minima di detriti provenienti da vari tessuti di piante adulte. Per migliorare la purificazione dei campioni sopraelevati, abbiamo incluso un passaggio di pulizia del cuscino Ficoll per rimuovere gli organelli rilasciati e altri detriti cellulari dai campioni digeriti, preservando la qualità del trascrinome (Figura 4).

Nelle librerie scRNAseq cDNA generate dai protoplasti, sono stati rilevati tramite specifici test PCR di cDNA 15 trascritti altamente espressi come ACTIN2 e trascrizioni rare/a bassa espressione come il fattore di trascrizione dell'omeodominio KNAT1, un marcatore specifico delle cellule cambiali e meristematiche, così come i marcatori cellulari compagni SUC2 e PARCL1 , tramite specifici saggi PCRdi cDNA 15 (Figura 5). Ciò indica una ampia rappresentazione cellulare e un'eterogeneità della popolazione di protoplasti ottenuta, confermata ulteriormente dall'analisi dei dati scRNAseq prodotti da questometodo 15.

figure-results-1
Figura 1: Flusso di lavoro dei passaggi di isolamento dei protoplasti. Sono mostrati sei passaggi principali: (1) preparazione del tampone, (2) digestione dei tessuti, (3) filtrazione, (4) lavaggio e purificazione di Ficoll, (5) conteggio e controllo qualità, e (6) proseguimento con esperimenti a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Immagini dei passaggi di preparazione del protoplasto. (A) Immagine rappresentativa della fase di taglio del campione di foglia (Passo 2.1). L'immagine superiore mostra il tessuto prelevato con alcune gocce di tampone in una piastra di Petri di dimensioni standard e una lametta da rasoio per il tritatore. L'immagine sottostante, a sinistra, rappresenta il tessuto dopo alcune trattate verticali con la lametta (vedi freccia). L'immagine qui sotto, a destra, rappresenta il campione tagliato, pronto per il passo successivo. (B) Immagine di un cuscino di Ficoll dopo la centrifugazione in un tubo da 1,5 mL (Passo 4.3.7). La freccia bianca indica lo strato intermedio, che contiene i protoplasti. (C) Immagine rappresentativa al microscopio dei protoplasti fogliari incubati nel colorante Evans Blue. Barra di scala: 250 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Immagini microscopiche dei protoplasti generati. Vengono visualizzate immagini di protoplast di ogni tipo di tessuto. (a) fiore, (b) stelo, (c) foglia, (d) radice. Barra di scala: 250 μm. (E) Immagini del microscopio confocale di una linea di reporter YFP specifica per cellule compagne. La prima immagine (a sinistra) rappresenta l'espressione del reporter cellulare compagno YFP nella vascolatura fogliare (colore verde). La seconda immagine (a destra) rappresenta i protoplasti provenienti da cellule che esprimono il YFP reporter (segnale verde). Il colore viola/blu rappresenta l'autofluorescenza del cloroplasto. Barra di scala 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Immagini microscopiche dei protoplasti fogliari prima di (A) e dopo (B) pulizia del cuscino di Ficoll. Barre di scala: 250 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: PCR di controllo qualità delle librerie scRNAseq. Immagini rappresentative in gel delle PCR di controllo qualità delle librerie di RNAseq unicellulari radici e tessuti sopraelevate. Geni testatiSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (da A a D, rispettivamente), e per ciascun tessuto: fiore, stelo, foglia, radice da sinistra a destra, rispettivamente. cDNA (+) viene usato come controllo positivo, mentre l'acqua come controllo negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Buffer Protoplasting RadicaleBuffer Protoplasting di fiori/steli/foglie
600 mM Mannitolo400 mM Mannitolo
2 mMMgCl 2-
0,1% BSA0,1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5,720 mM MES pH 5,7
10 mM KCl20 mM KCl
Regola il pH a 5,5 con 1M Tris Base se necessarioRegola il pH a 5,5 con 1M Tris Base se necessario

Tabella 1: Composizioni di isolamento del protetoplast. Sono fornite ricette di isolamento con protepolto per tessuti radici e sopra terra (fiore, stelo, foglia).

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo ottimizzato per l'isolamento dei protoplasti da vari tessuti di Arabidopsis è stato progettato per applicazioni scRNAseq, analizzando l'intero trascriroma presente nel citoplasma e nei nuclei. L'ottimizzazione specifica per tessuto dei tamponi e ulteriori passaggi per la digestione e purificazione hanno portato a rese robuste e riproducibili su diversi tessuti. In particolare, i protoplasti fiorali hanno avuto una media di ~98.000 cellule per campione (~9.788 cellule per mg di tessuto), i protoplasti staminali ~119.000 cellule (~550 cellule per mg), i protoplasti fogliari ~210.500 cellule (~225 cellule per mg) e i protoplasti radicali ~225.000 cellule (~599 cellule per mg), riflettendo la diversità strutturale e fisiologica di questi tessuti.

Un miglioramento chiave in questo protocollo fu l'uso di un cuscino a base di Ficoll al posto dei più comunemente usati gradienti/cuscinetti a base di saccarosio per la purificazione. A differenza del saccarosio, che viene assorbito dalle cellule e ha un effetto significativo sultrascricroma 13,20,21, Ficoll è osmoticamente inerte e impermeabile alla membrana, preservando così l'integrità dell'RNA durante l'isolamento 22. Questo passaggio ha anche ridotto il numero di organelli liberi, come i cloroplasti, provenienti da cellule rotte e detriti cellulari nella sospensione. La presenza di tali detriti può interferire con la formazione delle gocce ostruendo i canali dei dispositivi microfluidici o causando la presenza di più di una cellula nelle gocce formate, contribuendo così alla contaminazione da RNA ambientale. Tutti questi fattori possono portare a conclusioni errate o a bias nell'analisi dei dati scRNA-seq.

È stato dimostrato che l'isolamento dei protoplasti può alterare il trascrittoma delle cellulevegetali 2,15,16,19. Una strategia chiave in questo protocollo per minimizzare questo artefatto è mantenere i protoplasti a 4 °C (sul ghiaccio) dopo la digestione enzimatica, che rallenta l'attività metabolica e trascrizionale e, di conseguenza, riduce i cambiamenti trascrizionali noti per essere associati all'isolamento dei protoplasti. Inoltre, è fondamentale mantenere il tempo di prelievo del tessuto coerente tra le repliche e allinearlo all'obiettivo dello studio, poiché è stato dimostrato che variazioni temporali influenzano sia i geni indotti dal protoplasto sia i trascrizioni regolate circadianamente rilevate nei datasetscRNA-seq 15.

In questo metodo, oltre a produrre singole cellule con detriti minimi, un altro punto molto importante era mantenere l'eterogeneità dei tessuti per rappresentare potenzialmente tutti i tipi cellulari. La diversità nelle sospensioni dei protoplasti è stata confermata dalla rilevazione di diverse morfologie dei protoplasti, incluse dimensioni diverse e la presenza di segnali provenienti da linee reporter specifiche per tipo cellulare all'interno della popolazione ottenuta (Figura 2). Inoltre, la popolazione di protoplasti è stata valutata rilevando trascrizioni rare e specifiche per tipo cellulare, nonché trascrizioni di mantenimento nelle librerie di cDNA scRNA-seq tramite PCR (Figura 4). Questi includevano geni marcatori rari del meristemo apicale del germoglio e marcatori delle cellulecompagne 15. La cattura riuscita di questi trascrizioni conferma che il metodo presentato consente l'isolamento di diversi tipi cellulari con grande integrità, rendendolo uno strumento prezioso per far avanzare la ricerca sulle singole cellule nelle piante. Oltre allo scRNAseq, questo metodo può essere utilizzato anche per la citometria di flusso, l'analisi dell'espressione genica transitoria e i test di rigenerazione delle piante.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiararono di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo fa parte di un progetto che ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio Europeo della Ricerca (ERC) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (Grant Agreement n. 810131).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RS  della cellulasi;Biochimica di DuchefaC8003
Centrifuga modello 5810REppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozima R10Biochimica di DuchefaM8002
Microcentrifuga modello 5417REppendorfCessata
Filtro a siringa sterile Puradisc 30, 0,2 & micro; mCytiva10462200Chiamato 0.2 & micro; Filtro m nel protocollo
Filtro cellulare sterile 40 & micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363547
Filtro cellulare sterile 70 & micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363548

Riferimenti

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