Questo lavoro propone lo sviluppo di una nuova metodologia alternativa alle tecniche tradizionali per il controllo e il monitoraggio dell'acido 2,4-diclorofenossicarbossilico nei campioni di prodotti api provenienti dal centro e nord dell'Argentina.
Articolo di ricerca
Questo lavoro propone lo sviluppo di una nuova metodologia alternativa alle tecniche tradizionali per il controllo e il monitoraggio dell'acido 2,4-diclorofenossicarbossilico nei campioni di prodotti api provenienti dal centro e nord dell'Argentina.
La salute delle api è essenziale per la produzione di miele e per l'impollinazione delle colture. La produzione di miele può essere negativamente influenzata dall'uso di erbicidi, poiché le api possono entrare in contatto con queste sostanze chimiche durante la raccolta di nettare e polline dalle piante trattate, il che può portare a contaminazioni da miele con questi residui tossici. Sebbene l'acido 2,4-diclorofenossiacetico (2,4-D) sia progettato per controllare le erbacce a foglia larga, può raggiungere i fiori e contaminare la produzione delle api, influenzando potenzialmente la salute e la qualità della vita delle api. Per questi motivi, è importante analizzare periodicamente il miele, al fine di rilevare la presenza di residui di erbicidi e, se necessario, adottare misure correttive. Questo lavoro propone lo sviluppo di una nuova metodologia alternativa alle tecniche tradizionali per il controllo e il monitoraggio del 2,4-D nei campioni di prodotti api provenienti dal centro e nord dell'Argentina. I campioni sono stati condizionati a pH = 7,0 in presenza del tensioativo anionico dodecile solfato di sodio (SDS), filtrando i sistemi tramite carta filtrante a banda blu come supporto solido prima della determinazione tramite fluorescenza in fase solida. In condizioni di lavoro ottimali, si raggiunsero limiti di rilevamento e quantificazione rispettivamente di 0,33 ng/L e 0,90 ng/L, e un intervallo di linearità da 0,90 x 103 ng/L a 1,13 x 103 ng/L. Tra i vantaggi del nuovo metodo vi sono l'uso di strumenti economici e solventi ecologici, la bassa produzione di rifiuti e, di conseguenza, la tutela di alcuni principi della chimica verde.
La salute delle api è essenziale per la produzione di miele e per l'impollinazione delle colture. Una colonia sana dipende da una gestione sanitaria completa che includa una corretta nutrizione, misure igieniche e prevenzione e trattamento delle malattie. La produzione di miele, se effettuata responsabilmente, non danneggia le api, poiché gli apicoltori estraggono solo una piccola parte del miele totale, lasciando riserve per la colonia 1,2.
La produzione di miele può essere negativamente influenzata dall'uso di erbicidi, poiché le api possono entrare in contatto con queste sostanze chimiche durante la raccolta di nettare e polline dalle piante trattate, il che può portare a contaminazione del miele con residui di pesticidi. Inoltre, alcuni erbicidi, come il glifosato, possono influenzare direttamente lo sviluppo e il comportamento delle api, riducendo la loro capacità di foraggiamento e lo sviluppofisiologico 3,4,5,6. Sebbene l'erbicida 2,4-diclorofenossiacetico (2,4-D) sia stato progettato per controllare le erbacce a foglia larga, può raggiungere i fiori e contaminare il miele, potenzialmente influenzando la salute e la qualità del miele delle api 7,8,9.
Il commercio interno e internazionale di miele e altri prodotti api ha mostrato una crescita significativa e sostenuta negli ultimi anni, come si riflette nell'aumento della produzione10, 11, 12. Secondo i dati dell'Organizzazione delle Nazioni Unite per l'Alimentazione e l'Agricoltura (FAO), ci sono cinque principali paesi produttori di miele nel mondo: Cina, Argentina, Turchia, Stati Uniti eUcraina 13. La produzione apicolta è di grande importanza in Argentina ed è in costante crescita grazie alle opportunità di mercato all'esportazione emerse negli ultimi anni. Le condizioni ambientali dell'Argentina (clima, flora, ecc.) e la tecnologia investita nella produzione hanno permesso al paese di posizionarsi in una posizione importante a livello mondiale. D'altra parte, la presenza di xenobiotici costituisce una questione di interesse e richiede sorveglianza, come in altri paesi, poiché influisce sia sulla commercializzazione del miele sia sulla salute dei consumatori a causa dei suoi effettitossici 14,15.
Il 2,4-D è un erbicida sistemico selettivo e ampiamente utilizzato che controlla efficacemente le erbacce a foglia larga agendo come un'auxina sintetica, causando la loro crescita e morte incontrollate. Viene utilizzato in agricoltura, orticoltura e silvicoltura, ed è particolarmente utile per controllare le erbacce in colture come grano, mais e riso, poiché non danneggia erba ocereali 16. Il 2,4-D può anche essere utilizzato come regolatore della crescita delle piante ed è disponibile in diverse formulazioni, inclusi sali amminici ed esterici, per adattarsi a una varietà di applicazioni. Le funzioni 2,4-D sono influenzate dalla dose somministrata e dalla suscettibilità di particolari specie e tipidi tessuto 17,18. Ad esempio, il contatto con il 2,4-D è stato implicato in esiti riproduttivi avversi e in significative alterazioni genetiche nei topi, indicando un effetto genotossico significativo19.
Le api mellifere, in qualità di pollinatori chiave e organismi modello per lo studio dell'eusocialità, dell'apprendimento e della memoria, sono altamente vulnerabili all'avvelenamento diretto da agrochimici utilizzatinei campi 20. L'applicazione aerea di erbicidi e insetticidi durante la fioritura può causare una mortalità significativa tra le api e ridurre drasticamente la produzione di miele. Le miscele di pesticidi, anche a dosi sub-letali, possono disorientare le api in fase di foraggio, comprometterne la memoria e diminuire l'efficienza della ricerca. Questo, a sua volta, indebolisce le colonie riducendo la raccolta di polline e nettare, causando carenze nutrizionali. Inoltre, è stato rilevato 2,4-D in campioni di miele, e polline e nettare contaminati possono essere distribuiti tra i compagnidell'alveare 21.
È importante analizzare periodicamente il miele per la presenza di residui di erbicidi e, se necessario, adottare misure correttive. Per la rilevazione e quantificazione di contaminanti alimentari come gli erbicidi, in questo caso specifico 2,4-D, i metodi strumentali più comunemente utilizzati sono la cromatografia, ovvero la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), la cromatografia liquida a tandem spettrometria di massa (LC-MS/MS) e la gascromatografia tandem spettrometria di massa (GC-MS/MS)22,23,24,25,26 . Tuttavia, i ricercatori presentano periodicamente nuovi metodi di monitoraggio per il 2,4-D che offrono vantaggi rispetto ai metodi convenzionali di quantificazione 27,28,29, ad esempio: uso di strumenti meno costosi, semplicità operativa, uso di meno solventi, applicazione a campioni più complessi e altri.
La fluorescenza in fase solida è una tecnica versatile che, combinando la fluorescenza molecolare con i metodi di estrazione in fase solida, aumenta la già elevata sensibilità inseca agli strumenti a fluorescenza. Migliora inoltre la gamma di linearità e la selettività riducendo o eliminando gli effettimatriciali 30,31.
In questa ricerca viene proposta e applicata una nuova metodologia analitica per il monitoraggio e la quantificazione del 2,4-D a campioni di miele e altri campioni di api provenienti dal centro e nord dell'Argentina. I campioni contengono quantità sconosciute di 2,4-D. Ciò che si sa sono le concentrazioni dei livelli super-aggiunti, cioè la concentrazione fornita dal campione più la concentrazione di 2,4-D che abbiamo aggiunto. Quest'ultimo valore è noto e ci permette di calcolare il recupero. La nuova metodologia si basa sulla determinazione diretta dell'analita utilizzando fluorescenza in fase solida, dimostrando molteplici vantaggi in termini di risparmio strumentale, costi operativi inferiori e maggiore protezione ambientale.
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Questo manoscritto non contiene studi con partecipanti umani o animali condotti da nessuno degli autori.
Apparecchiature utilizzate
Le misurazioni spettrofluorimetriche venivano effettuate utilizzando uno spettrofluorometro basato su PC dotato di una lampada allo xeno da 150 W. Un portacampioni veniva utilizzato per le misurazioni di fluorescenza a superficie solida (SSF). I parametri utilizzati per la quantificazione 2,4-D erano i seguenti: λem = 580 nm, usando λext = 555 nm (Fessure 3-3), utilizzando un supporto campione solido.
Campionamento e trattamento del campione
Questo studio sulla produzione di campioni di miele prodotti nel 2025 è stato condotto nelle province di San Luis, San Juan, Jujuy e Salta, nella regione centro-settentrionale dell'Argentina. I campioni analizzati erano: quattro mieli multifloreali, due mieli di propolis, caramelle al miele puro e caramelle fatte con una miscela di miele, coca e propolis, acquistate dagli apicoltori delle regioni. I mieli studiati erano freschi, estratti dagli alveari entro meno di una settimana dalla produzione, per evitare una possibile degradazione del 2,4-D da diversi meccanismi. Tutti i campioni venivano raccolti in nuovi recipienti sterili e immediatamente trasportati in laboratorio. Venivano conservati a 4-8 °C in un luogo buio fino all'analisi. Il caramello solido veniva omogeneizzato con un mortaio e un pestello; il suo contenuto veniva diluito in 5 mL di acqua ultrapura, e da quella soluzione venivano prelevati 0,5 μL.
Metodologia
Sono stati aggiunti aliquoti di 0,5 μL o 1 μL di 2,4-D (1,23 ng/L e 3,49 ng/L), 100 μL di campione, 250 μL di SDS (1 x 10-4 mol/L) e 100 μL di tampone fosfato (1 x 10-4 mol/L, pH=7), e il volume della miscela è stato portato a 3 mL aggiungendo acqua doppiamente distillata. La miscela veniva filtrata attraverso il supporto solido (filtro di carta; vedi Tabella dei Materiali per i dettagli). I supporti solidi venivano essiccati a temperatura ambiente, e poi la fluorescenza superficiale solida (SSF) veniva misurata a λem= 580 nm, usando λext= 555 nm (Fessure 3-3) con un portacampione solido.
Quanto sopra descrive la procedura generale della metodologia sviluppata, in cui ogni parametro è stato studiato e ottimizzato, come mostrato nella sezione Risultati.
Effetto del pH e del tampone
L'ottimizzazione del pH è stata effettuata regolando i sistemi al pH in esame utilizzando acido cloridrico o idrossido di sodio per portarli al valore richiesto (pH testato in intervallo: 5-7). Successivamente, una volta ottenuto l'intervallo di pH più appropriato per ottenere un segnale analitico adeguato, veniva selezionato il buffer da utilizzare.
I tamponi testati erano fosfato, Tris e borace, preparati a una concentrazione di 1 x 10-4 mol/L. Il loro volume veniva variato per ottenere il miglior segnale di intensità di fluorescenza. Vengono mostrati i risultati per l'unico fosfato tampone che ha migliorato l'intensità di fluorescenza, insieme alla sua rispettiva concentrazione ottimale. Qui, il tampone selezionato era fosfato, e il pH = 7.
Concentrazione di tensioattivi
L'uso di diversi tensioattivi nella fluorescenza molecolare offre vantaggi che migliorano la determinazione dell'analita in esame. I mezzi micellari sono utilizzati per minimizzare le interazioni intermolecolari tra l'analita e i componenti della matrice campionaria. Inoltre, le proprietà fotofisiche dei soluti fluorescenti possono essere modificate nel mezzo micellare, migliorando così la sensibilità alla fluorescenza. È stato studiato l'effetto di diversi tensioattivi (SDS e HTAB) sulla quantificazione del 2,4-D utilizzando la fluorescenza della superficie solida (SSF). È stato riscontrato che il tensioativo anionico SDS, a una concentrazione di 8,3 x 10⁻6 mol/L, aumentava l'intensità di fluorescenza dell'erbicida in esame.
Solido supporto
Dato che la configurazione planare è energeticamente preferita nello stato di fluorescenza eccitata, si è esplorata la ritenzione dell'erbicida su supporti solidi. I sistemi venivano filtrati attraverso vari tipi di membrane, tra cui nylon, acetato di cellulosa, esteri misti e carta filtrante Blue-Ribbon. Le soluzioni filtrate venivano raccolte in contenitori separati e puliti, e le membrane venivano asciugate a temperatura ambiente. Successivamente, le membrane sono state inserite in un supporto solido per campioni e è stata registrata la fluorescenza in fase solida (SSF). È stata osservata una ritenzione adeguata e selettiva sulla carta filtrante, quindi questo supporto è stato selezionato per la determinazione della fluorescenza in fase solida. Le soluzioni filtrate sono state anche analizzate tramite fluorescenza molecolare. L'assenza del complesso 2,4-D era evidente, dimostrando la ritenzione dell'erbicida sulla carta filtrante.
Studio sul recupero
Il 2,4-D è stato aggiunto a un volume appropriato di ciascun campione studiato (0,5 μL è stato utilizzato per i campioni di miele e 1 μL per gli altri campioni analizzati), aumentando gradualmente la concentrazione a 1,23 ng/L e 3,49 ng/L. Le concentrazioni di analiti sono state determinate utilizzando questa metodologia, come media di sei repliche (n = 6).
Studio di precisione
La ripetibilità del metodo e la precisione intra-giornaliera sono state studiate tramite test ripetuti di campioni (n = 6) contenenti 1,23 ng/L e 3,49 ng/L di 2,4-D, determinando il contenuto analitico utilizzando la metodologia. Inoltre, la riproducibilità della precisione inter-giornate è stata valutata in 7 giorni per gli stessi sistemi.
Studio di interferenza
Sono state aggiunte diverse quantità di ioni comuni alla soluzione di prova contenente 3,49 ng/L di 2,4-D, e la metodologia è stata applicata. Sono stati testati i seguenti potenziali interferenti:
Concentrazione del rapporto molare interferente/2,4-D = 1000:1:00 per Na+, K+, Cl-, Fe3+, Cu2+, Cd2+, Sb3+, Mn2+, As3+, CO32-, SO42-, Ca2+, Mg2+, NO3-, Ni2+, fruttosio, glucosio, saccarosio, maltosio, 2,4,5-T, sulfometuron-metil, glifosato e atrazina.
Concentrazione del rapporto molare interferente/2,4-D = 500:1:00 per Zn2+, Co2+, Al3+, clorsulfurone, bensulfuron-metile e triasulfurone.
Calcolo dei parametri di qualità analitici
I parametri di qualità analitica sono il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ). Questi sono stati calcolati applicando i seguenti passaggi. Il rumore di fondo è stato misurato misurando la risposta di 15 campioni vuoti (campioni senza analite) per ottenere un dataset di rumore di fondo. Veniva calcolata la deviazione standard del rumore. Questo viene accettato come valore LOD. I limiti di rilevamento si basano su 3,3 volte le deviazioni standard dello blank (N = 15). I limiti di quantificazione si basano su deviazioni standard 10 volte del blank (N = 15).
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I risultati presentati di seguito indicano come lo studio di ciascuna delle variabili che influenzano la procedura generale, la sua ottimizzazione e le condizioni di lavoro ottimali raggiunte sia stato affrontato passo dopo passo.
Caratterizzazione dello spettro 2,4-D
La caratterizzazione 2,4-D è stata effettuata tramite spettroscopia UV-Vis e fluorescenza molecolare, osservando massimi di intensità fluorescente a λem= 580 nm, us...
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L'uso intensivo di erbicidi è aumentato esponenzialmente in Argentina e nel resto del mondo a causa della necessità di soddisfare la domanda alimentare di una popolazione in crescita. Se l'uso di tali prodotti viene monitorato in modo appropriato, razionale e periodico, non comprometterebbe i benefici attesi né avrebbe effetti negativi sull'ambiente nel suo complesso. Il 2,4-D è stato ampiamente utilizzato in tutto il mondo e molti studi hanno dimostrato che questo erbicida induce altera...
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Gli autori ringraziano con gratitudine l'Instituto de Química San Luis - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL CONICET, Progetto 11220130100605CO) e l'Universidad Nacional de San Luis (Progetto PROICO 02-1120), Argentina, per il supporto finanziario.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,4-D | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49083 | |
| Acido acetico/acetato | Mallinckrodt Chemical Works | ||
| Fogli filtranti Blue Ribbon | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | WHA1001929 | 2-5 & mu; m dimensione dei pori e diametro di 12,5 cm |
| Membrana di acetato di cellulosa | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 0,45 μ m dimensione dei pori e 47 mm | |
| Bromuro di esadeciltrimetilammonio (HTAB) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H5882 | |
| acido cloridrico | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 1.09063 | |
| Membrane dell'immobilone (+) | Millipore, San Paolo, Brasile | HATF04700 | 0,45 μ m dimensione dei pori e 47 mm |
| Membrane esteri misti | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 0,45 μ m dimensione dei pori e 47 mm | |
| Membrane in nylon | Millipore, San Paolo, Brasile | Z290793 | 0,45 μ m dimensione dei pori e diametro di 47 mm |
| pHmeter (Orion Expandable Ion Analyzer, ) | Orion Research, Cambridge, MA, USA | Modello EA 94. | |
| Diidrofosfato di potassio | Biopack, Buenos Aires, Argentina | 2000168900 | |
| Acido ftalatico di potassio | Merk &Co., Inc | ||
| Dodecile solfato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 11667289001 | |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S2770 | |
| Tetraborato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 221732 | |
| Spettrofluorimetria | Shimadzu | RF-5301 | equipaggiata con una lampada allo xeno da 150 W e celle di quarzo da 1,00 cm |
| Tris-(idrossimetil)-aminometano | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 77-86-1 |
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