Method Article

Visualizzazione della dinamica spaziotemporale dei neuroni della corteccia somatosensoriale durante l'elettroagopuntura utilizzando immagini in vivo a due fotoni

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo integra finestre craniche nei topi transgenici Thy1-GCaMP6f, elettroagopuntura standardizzata e imaging a due fotoni per visualizzare la dinamica dell'ensemble corticale a scala di millisecondi durante la stimolazione, rivelando la plasticità specifica per strato.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un quadro sperimentale completo per indagare la dinamica dei circuiti corticali durante la stimolazione dell'EA (elettroagopuntura). La metodologia integra tre componenti chiave: impianto cronico della finestra cranica nei topi transgenici Thy1-GCaMP6f, stimolazione standardizzata dell'EA al punto di agopuntura ST36 utilizzando impulsi bifasici a 2/100 Hz, e imaging calcio ad alta risoluzione a due fotoni. Questo approccio integrato consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività dell'insieme neurale nella corteccia somatosensoriale primaria (S1) con precisione temporale millisecondaria, catturando dettagli precedentemente inaccessibili delle risposte a livello di rete alla neuromodulazione. La tecnica rivela con successo distinti schemi di attivazione specifici per strato e cambiamenti di plasticità longitudinali, fornendo intuizioni fondamentali sui meccanismi corticali alla base degli effetti dell'EA. Superando le limitazioni spaziotemporali fondamentali insite nelle tecniche convenzionali di fMRI ed elettrofisiologiche, questa piattaforma ad alta risoluzione offre capacità analitiche senza precedenti per mappare circuiti neurali dinamici. Il design robusto del protocollo e i suoi risultati riproducibili lo rendono particolarmente prezioso per ottimizzare terapie di neuromodulazione mirate e per far progredire la nostra comprensione della plasticità a livello di circuito in risposta alla stimolazione periferica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'elettroagopuntura, un adattamento moderno dell'agopuntura tradizionale che incorpora correnti elettriche controllate applicate tramite aghi in punti di agopuntura specifici, è riconosciuta per modulare i circuiti neurali coinvolti nell'elaborazione del dolore, nel controllo motorio e nella funzione autonoma. Si ritiene che i suoi effetti coinvolgano complesse cascate di segnalazione avviate dall'attivazione dei nervi sensoriali periferici (principalmente fibre Aδ e C), che portano al rilascio di neurotrasmettitori (ad esempio, oppioidi, serotonina, GABA) e alla successiva modulazione ai livelli spinale, tronco encefalico ecorticale 1,2. Le strutture chiave implicate includono le cortecce somatosensoriali. All'interno della corteccia S1, che elabora informazioni tattili e nocicettive, l'EA probabilmente influenza sia gli equilibri inibitori-eccitatori locali sia la connettività a lungoraggio 3,4. Tuttavia, la sequenza temporale precisa di attivazione/inibizione tra diverse popolazioni neuronali (ad esempio, neuroni piramidali, interneuroni) e strati all'interno di S1 durante e immediatamente dopo la stimolazione EA rimane in gran parte non mappata a causa dei vincoli metodologici menzionatiin precedenza 5,6. Comprendere queste dinamiche in tempo reale è fondamentale per ottimizzare i parametri dell'EA e prevedere gli esiti terapeutici.

I metodi tradizionali per indagare gli effetti neuromodulatori dell'elettroagopuntura (EA) sui circuiti corticali, come gli studi comportamentali e le analisi post-mortem, offrono preziose intuizioni ma non riescono a catturare l'attività neurale in tempo reale con alta risoluzionespaziotemporale 7,8. Per superare queste limitazioni, emerge l'imaging calcio a due fotoni in vivo come potente alternativa, consentendo la visualizzazione diretta della dinamica dell'insieme neurale durante lastimolazione 8,9. Questa tecnica offre vantaggi senza pari per studi longitudinali cronici, permettendo ai ricercatori di osservare — con risoluzione cellulare — l'attività rapida e distribuita attraverso gli strati corticali negli animali svegli e comportativi. A differenza dell'elettrofisiologia acuta, che offre alta risoluzione temporale ma copertura spaziale limitata, l'imaging a due fotoni facilita il monitoraggio su larga scala di centinaia o migliaia di neuroni simultaneamente all'interno di un campo visivodefinito 9,10. Inoltre, rispetto all'imaging a risonanza magnetica funzionale (fMRI), che eccelle nella copertura dell'intero cervello ma opera su scale temporali più lente e manca di specificità cellulare, l'imaging a due fotoni del calcio offre una rilevazione fine dell'attività di specifiche popolazioni neuronali su una scala temporale rilevante per processi sinaptici e a livellodi circuito 11,12. Pertanto, l'imaging a due fotoni è posizionato in modo unico per colmare un divario critico nella nostra comprensione di come gli stimoli EA periferici vengano tradotti in schemi di attivazione corticali spaziatemporalmente precisi, in particolare in regioni come la corteccia somatosensoriale primaria (S1). Come principale centro per l'elaborazione somatosensoriale (inclusi i segnali provenienti dai punti di agopuntura), e dato che l'EA modula robustamente la sua attività, S1 rappresenta un punto strategico per studiare la dinamica dei circuiti corticali indotta dall'elettroagopuntura.

La microscopia laser a scansione a due fotoni (2PLSM) abbinata a indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI), come GCaMP6, rappresenta uno strumento rivoluzionario per le neuroscienze. Consente l'imaging cronico e ad alta risoluzione dell'attività neurale in vivo con specificità cellulare esubcellulare 13. I GECI fluoresiscono proporzionalmente ai transitori intracellulari del calcio, fungendo da proxy affidabile per l'attivazioneneuronale 14. Fondamentale, l'uso della luce di eccitazione nel vicino infrarosso da parte di 2PLSM offre una penetrazione in profondità superiore (centinaia di micron) rispetto alla microscopia convenzionale, permettendo la visualizzazione dell'attività negli strati corticali superficiali e persino più profondi (ad esempio, L2/3, L4, L5). La sua sezionazione ottica intrinseca minimizza la fluorescenza fuori fuoco e il danno fotografico, rendendolo ideale per studi longitudinali durati settimane omesi 15, 16, 17. Questa tecnologia rappresenta un progresso rivoluzionario nella ricerca sull'EA, con il potenziale di trasformare radicalmente la nostra comprensione, offrendo la possibilità di tracciare la dinamica su scala di millisecondi di centinaia o migliaia di neuroni individuali simultaneamente all'interno di un volume corticale definito durante la stimolazione.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti hanno utilizzato topi transgenici Thy1-GCaMP6fdi 8-12 settimane di età. Tutte le procedure sperimentali e i protocolli di cura degli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute (NIH) e sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong; Numero di approvazione del protocollo: 3603). Furono fatti ogni sforzo per minimizzare il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza. Uno schema dell'allestimento sperimentale è mostrato nella Figura 1.

1. Impianto cronico della finestra cranica

  1. Induzione anestesica e stabilizzazione stereotassica
    1. Iniziare l'anestesia inserendo il topo Thy1-GCaMP6f di 8-12 settimane in una camera di induzione fornita con isoflurano al 4-5% (vol/vol) in ossigeno di grado medico al 100% a una portata di 1 L/min.
    2. Alla perdita del riflesso di raddrizzamento (tipicamente entro 2-3 minuti), trasferire l'animale a una borsa riscaldante termostatica (mantenuta a 37 °C) integrata in un telaio stereotassico digitale.
    3. Fissare il topo utilizzando un cono nasale che somministra isoflurano 1,5-2,0% per la manutenzione chirurgica. Applicare unguenti oftalmici (ad esempio, Puralube Vet Ountment) su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione corneale.
    4. Inserire con cura le barre auricolari non traumatiche nel meato uditivo esterno, assicurando una posizione simmetrica senza pressioni eccessiva che potrebbero causare danni ai tessuti o rottura della membranatimpanica 19.
    5. Fissare il palato mascellare con la pinza nasale, evitando l'ostruzione delle vie aeree.
    6. Confermare anestesia profonda assenza di riflesso di ritiro del pedale fino a un pizzicamento rigido delle dita e una frequenza respiratoria stabile e lenta (80-120 respirazioni/minuto). Monitora continuamente la temperatura corporea centrale tramite una sonda rettale e regola il cuscinetto riscaldante di conseguenza.
    7. Somministrare analgesia sottocutanea (s.c.) preventiva (ad esempio, Carprofene, 5 mg/kg) e supporto liquido (soluzione salina sterile, 0,5-1 mL s.c.). Verifica parametri fisiologici stabili (SpO₂ > 95%, respirazione regolare) durante tutta la configurazione.
  2. Esposizione chirurgica del cranio
    1. Rasi il cuoio capelluto dorsale con cura con una tosa elettrica, seguita dall'applicazione di una crema depilatoria chimica per la rimozione completa dei peli. Risciacqua accuratamente con soluzione salina sterile.
    2. Eseguire l'antisepsi sequenziale: strofinare la pelle esposta tre volte, alternando tra tamponi di povidone-iodio (10%) e alcol isopropilico al 70%, concludendo con una soluzione di gluconato di clorexidina (2%).
    3. Utilizzando forbici micro-dissezionanti sterili e pinze fini (Dumont #5), realizzare un'incisione sagittale della linea mediana (~15-20 mm di lunghezza) attraverso la pelle e il tessuto connettivo sottostante, partendo da ~2 mm a posteriore agli occhi e estendendosi fino alla giunzione interparietale-occipitale.
    4. Utilizzare le pinze micro-emostatiche o la cauterizzazione bipolare (bassa regolazione) per controllare il sanguinamento capillare lungo i margini dell'incisione. Ritrae delicatamente le lembi laterali usando micro-retratti curvi o suture di seta 5-0 ancorate al drappo circostante.
    5. Espone l'intero calvario dorsale, inclusi le ossa frontali, parietali e interparietali. Utilizzando una micro-curetta (#00), raschiare meticolosamente il periosto - una membrana vascolare fibrosa aderente alla superficie ossea - sotto grande ingrandimento (microscopio chirurgico).
    6. Applica colpi delicati e tangenziali per evitare di scavare il cranio o danneggiare le suture (bregma, lambda, sagittale, coronale). Ottenere una superficie ossea liscia e avascolare, essenziale per una craniotomia precisa e il successivo adesivo.
    7. Irrigare frequentemente il campo con soluzione salina sterile, calda e calda (37 °C) al 0,9% per rimuovere la polvere ossea e mantenere l'idratazione dei tessuti.
  3. Targeting stereotassico della regione dell'arto posteriore S1
    1. Utilizzando un braccio manipolatore stereotassico ad alta precisione, posiziona la punta di una penna chirurgica fine o di una punta micro-trapano direttamente sopra il punto di riferimento anatomico (l'intersezione delle suture coronale e sagittale). Conferma le coordinate tramite visualizzazione al microscopio (10x).
    2. Regolare il manipolatore per spostare il marcatore con precisione anteroposteriore (AP) -1,5 mm (posteriore al bregma) e mediolaterale (ML) +2,0 mm (emisfero destro) rispetto alla linea mediana (sutura sagittale).
      NOTA: Questa posizione corrisponde all'area di rappresentazione primaria della corteccia somatosensoriale (S1) dell'arto posteriore (S1HL).
    3. Incidi leggermente un piccolo mirino (<0,5 mm) sulla superficie dell'osso parietale esposto in questa coordinata, assicurando visibilità senza penetrare l'osso.
    4. Verificare l'assenza di una grande vascolarizzazione superficiale che attraversi il sito segnato; se sono presenti vasi significativi, si aggiustare minimamente le coordinate ML (±0,1-0,2 mm) per evitarle, poiché i vasi durali possono sanguinare copiosamente se perforati e ostacolare la chiarezza ottica.
    5. Documenta le coordinate finali regolate.
  4. Esecuzione precisa della craniotomia
    1. Centra un punzone sterile e usa e getta di 3 mm di diametro con precisione sopra la coordinata S1HL segnata. Applica una pressione ferma e costante verso il basso mentre ruoti delicatamente il punzone per incidere completamente lo strato osseo corticale esterno attorno alla circonferenza. Togli il punch.
    2. Utilizzando un trapano micro-chirurgico ad alta velocità (ad esempio, con bava in carburo 0,5-0,8 mm) fissato a un braccio stereotassico sotto costante irrigazione salina allo 0,9% (raffreddamento e rimozione dei detriti), assottiglia con cura l'osso all'interno del cerchio segnato.
    3. Esercita a brevi scatti usando un leggero movimento di fresatura tangenziale, progrediendo sistematicamente dalla periferia verso il centro. Monitorare attentamente la traslucenza ossea sotto ingrandimento.
    4. Cessare immediatamente la perforazione dopo aver osservato un sottile aspetto "arrossato" della dura madre sottostante, indicando uno spessore osseo minimo (<50 μm). Passa a micro-pinze fini (Dumont #5/45) e microforbici per sollevare e staccare meticolosamente i frammenti ossei sottili rimanenti, lavorando radialmente verso l'esterno dal centro.
    5. Conserva la dura madre intatta - assicurati che appaia traslucida e lucente, senza lacerazioni o sanguinamenti significativi. Controlla immediatamente eventuali piccoli sanguinamenti durali applicando una pressione delicata con un pledget sterile in schiuma compressa immerso in soluzione salina o trombina allo 0,9%.
    6. Irrigare abbondantemente la dura esposta con liquido cerebrospinale artificiale caldo e sterile (aCSF) o soluzione salina allo 0,9% per rimuovere tutti i detriti ossei. Evitare ladisidratazione 17,20.
  5. Impianto cronico di finestre craniche e fissazione della barra della testa
    1. Prepara un copri-copertura circolare sterile di vetro di diametro 3 mm, spessore #1 (circa 150 μm). Opzionalmente, rivesti la superficie interna con uno strato sottile di elastomero di silicone per chiarezza ottica e ridotta adesione.
    2. Posiziona il coperto con precisione sopra la craniotomia usando pinze sottili. Prepara un cemento dentale a polimerizzazione rapida e a polimerizzazione leggera (ad esempio Metabond o Charisma) secondo le istruzioni del produttore.
    3. Lavorando rapidamente (<90 s), applica una sottile goccia di cemento intorno al perimetro della copertura, direttamente sulla superficie del cranio asciutta e pulita. Assicurati che il cemento sigilli completamente il bordo del copricapo ma non si incastri sotto sulla dura.
    4. Indurisci immediatamente il cemento usando una luce di polimerizzazione dentale (luce blu, 450 nm) per 20-30 secondi per quadrante. Rinforzare la tenuta con più strati di un cemento dentale acrilico autopolimerico da 5 mL a polimerizzazione più lenta (ad esempio, Jet Repair Acrylic o Paladur), costruendo un robusto cappuccio in cemento a basso profilo (altezza <2 mm) che si estende di diversi millimetri oltre il bordo della craniotomia fino al cranio circostante.
    5. Inserire una barra di testa leggera in acciaio inox o titanio su misura (ad esempio, lunga 15-20 mm con apertura centrale) nel tappo di cemento durante la fase iniziale di induririzzazione.
    6. Assicurarsi che la barra della testa sia posizionata parallelamente alla sutura sagittale e centrata sopra la finestra, fornendo punti di fissaggio rigidi ed equilibrati per una futura presa della testa sotto il microscopio senza ostruire l'accesso ottico.
    7. Lascia asciugare completamente il cemento (≥15 minuti). Verifica l'emostosi completa e la chiarezza delle finestre21.
  6. Recupero e monitoraggio postoperatorio
    1. Dopo l'induritura con cemento, libera con cura il topo dalle barre auricolari e dalla pinza nasale. Interrompere l'isoflurano e somministrare ossigeno al 100% finché la respirazione spontanea non riprende completamente.
    2. Somministrare buprenorfina HCl (0,05-0,1 mg/kg s.c.) immediatamente dopo l'intervento per l'analgesia. Trasferire l'animale in una camera di recupero preriscaldata (30-32 °C), integrata con ossigeno, rivestita con lettiera di carta pulita.
    3. Monitorare continuamente finché la reclinazione sternale e la camminata completa non si ritrovano (tipicamente 30-60 minuti). Somministrare una seconda dose di carprofene (5 mg/kg s.c.) 24 ore dopo l'intervento. Fornire soluzione di Ringer lattata riscaldata (1 mL s.c.) per il supporto all'idratazione se necessario.
    4. Ospitano il topo singolarmente in una gabbia standard arricchita con materiale da nidificazione per evitare che i compagni di gabbia danneggino l'impianto della testa. Mantenere condizioni ambientali (22-24 °C, 40-60% di umidità, ciclo chiaro/scuro di 12:12 h) con accesso ad libitum a cibo e idrogel.
    5. Monitorare il topo almeno due volte al giorno per 7 giorni dopo l'intervento per segni di dolore/disagio (postura curva, piloerezione, riduzione dell'attività, perdita di peso >15%), infezione (secrezione purulenta, gonfiore, arrossamento), deficit neurologico o allentamento della barra della testa.
    6. Consentire un periodo minimo di recupero di ≥7 giorni prima di iniziare qualsiasi procedura sperimentale (imaging o EA) per garantire la risoluzione dell'infiammazione chirurgica acuta, il ripristino del comportamento normale e la clearance glymphatica, e la stabilizzazione dell'attività corticale di base. Pesa l'animale ogni giorno per monitorare ilrecupero 22.

2. Stimolazione con elettroagopuntura

  1. Localizzazione anatomica precisa dell'agopunto ST36
    1. Mira l'agopunto ST36 ("Zusanli") basandosi sui punti anatomici consolidati nell'arto posteriore del topo. Prima dell'inserimento dell'ago, palpare la tibia anteriore prossimale per identificare la tuberosità tibiale - la prominente prominenza ossea situata appena distale rispetto all'articolazione del ginocchio dove si inserisce il legamento rotuliano.
    2. Utilizzando caliperi fini o un marcatore sterile, misura 2 mm lateralmente (verso la fibula) e 2 mm caudale (posteriore) rispetto al centro della tuberosità tibiale. Questa posizione corrisponde al ventre muscolare tibiale anteriore, superficiale al ramo profondo del nervo peroneo e prossimale alla biforcazione dell'arteria tibiale anteriore.
    3. Confermare l'assenza di vasi sanguigni superficiali principali nel sito tramite transilluminazione, se necessario.
      NOTA: La precisione è fondamentale, poiché lievi deviazioni (>0,5 mm) possono alterare significativamente le strutture neurali stimolate e le successive risposte corticali in S1. L'identificazione dei punti di riferimento dovrebbe essere eseguita in modo coerente da personale addestrato per minimizzare la variabilità tra operatori23,24.
      NOTA: I metodi per garantire la stabilità dell'ago sono: (i) Dopo l'inserimento e la fissazione dell'ago, viene concesso un periodo di adattamento affinché il topo si acclimati e riduca le difficoltà iniziali. (ii) La frequenza di vibrazione generata dallo stimolatore di elettroagopuntura (ad esempio, 2 Hz) è intrinsecamente bassa in ampiezza. Inoltre, gli aghi fini utilizzati (ad esempio, Φ0,16 mm) possiedono sufficiente rigidità per resistere efficacemente a questa vibrazione minima. (iii) Durante tutto l'esperimento, l'operatore monitora continuamente la posizione della punta dell'ago. I dati degli studi saranno esclusi se si osservano spostamenti significativi causati dal movimento degli animali.
  2. Tecnica di inserimento con ago sterile
    1. Dopo la disinfezione cutanea (alternanza di uno scrub al 70% etanolo e clorexidina), inserire perpendicolarmente nella pelle un ago sterile e monouso in acciaio inox (diametro nominale: 0,18 mm, equivalente a 36 gauge; lunghezza: 13 mm) perpendicolarmente nella pelle alla coordinata indicata ST36.
    2. Avanza l'ago con passo costante attraverso la pelle, il tessuto sottocutaneo e nel muscolo tibiale anteriore sottostante usando un movimento rotatorio fluido per minimizzare i traumi tissuti.
      NOTA: La profondità di inserimento del bersaglio è di 3 mm dalla superficie della pelle. Questa profondità garantisce un coinvolgimento ottimale degli afferenti muscolari di tipo II/III (fibre Aδ) e potenzialmente fibre somatiche di piccolo diametro senza rischiare il contatto con la tibia sottostante o con i fasci neurovascolari profondi.
    3. Fissa saldamente il mozzo dell'ago usando un piccolo tampone adesivo sterile o una clip personalizzata per evitare lo stacco durante la stimolazione elettrica successiva e eventuali movimenti sottili degli arti.
    4. Verifica la posizione stabile dell'ago osservando una lieve fascicolazione muscolare locale transitoria all'inserimento - un indicatore fisiologico del corretto posizionamento intramuscolare.
    5. Mantenere una tecnica asettica rigorosa per prevenire infezioni, in particolare nei paradigmi di stimolazionecronica 23.
  3. Parametrizzazione e somministrazione della stimolazione dell'elettroagopuntura
    1. Collegare il manico isolato dell'ago inserito al canale di uscita anodo (+) di uno stimolatore programmabile di elettroagopuntura (ad esempio, HANS Agopoint Nerve Stimulator, modello LH202).
    2. Posizionare un elettrodo catodico di riferimento (-), tipicamente una piccola piastra o clip in acciaio inox rivestito con gel conduttivo, sulla zampa posteriore ipsilaterale (ad esempio, superficie plantare vicino al tallone).
    3. Garantire un contatto sicuro e bassa impedenza (<5 kΩ) in entrambi i siti. Programmare lo stimolatore per fornire impulsi a onde quadrate bifasiche (fasi bilanciate positive/negative) per minimizzare la polarizzazione degli elettrodi e i danni ai tessuti.
    4. Impostare il paradigma di stimolazione in modalità a dispersione densa: scompigliamenti alternati di 2 Hz (bassa frequenza) per 3 secondi seguiti da 100 Hz (alta frequenza) per 3 secondi.
      NOTA: Questo schema combinato di frequenza (spesso indicato come 2/100 Hz) è dimostrato empiricamente come un aumento del rilascio di oppioidi endogeni (ad esempio, β-endorfina, enkefalina) e monoamine (ad esempio, serotonina, noradrenalina) nel SNC in modo più efficace rispetto alle singole frequenze.
    5. Regolare l'intensità attuale in modo incrementale a partire da 0,1 mA fino a osservare visivamente un lieve e ritmico tic della zampa (flessione delle dita o della caviglia) - tipicamente raggiunto tra 1,0 mA nei topi adulti sotto anestesia leggera. Questa soglia di contrazione indica un sufficiente reclutamento di efferenti motori e afferenti di grande diametro associati (fibre Aβ), confermando l'attivazione fisiologica senza causare disagio o lotta vigorosa. Mantieni questa intensità calibrata durante la sessione di stimolazione di20 minuti 25,26.
  4. Controlli procedurali critici e monitoraggio fisiologico
    1. Mitigazione degli artefatti di stimolazione
      1. Separare fisicamente i cavi EA dalle apparecchiature di immagini/headstage.
      2. Implementa una messa a terra robusta: collega il terminale di massa dello stimolatore a una messa a terra dedicata e assicurati che il telaio del microscopio e la borsa riscaldante per animali condividano un punto di massa comune.
      3. Sincronizza temporalmente gli impulsi di stimolazione con il segnale di svuotamento del microscopio se disponibile, oppure impiega un elaboramento post-hoc del segnale per rimuovere residui elettrici dalle tracce di calcio.
    2. Stabilità fisiologica
      1. Monitorare continuamente la temperatura corporea centrale (mantenuta a 37,0 ± 0,5 °C tramite borsa riscaldante controllata a feedback), la frequenza respiratoria (80-120 respiri/min) e la SpO₂ (>95%) durante la sessione EA di 20 minuti.
      2. Mantenere l'anestesia isoflurana leggera (1,0-1,5%) per l'immobilità durante l'imaging combinato/stimolazione. Osserva continuamente il movimento indotto della zampa; se diminuisce o cessa, controllare il contatto dell'ago e l'impedenza, e regolare leggermente l'intensità (incrementi di ≤0,1 mA) per mantenere un'attivazione motoria costante e lieve.
      3. Interrompere immediatamente la stimolazione se compaiono segni di disagio (ad esempio, tachipnea, lotta vigorosa).
    3. Riproducibilità
      1. Usa il tipo di ago, la profondità di inserimento, il modello dello stimolatore e il metodo di calibrazione (soglia di contrazione della zampa) identico per tutti gli animali e le sessioni. Documenta l'intensità finale di stimolazione utilizzata per ogni soggetto.
      2. Consentire un periodo minimo di recupero di 5 minuti dopo la stimolazione prima di interrompere l'anestesia o eseguire procedureaggiuntive 27,28.

3. Imaging a due fotoni durante l'EA

  1. Preparazione animale, fissazione della testa e mantenimento fisiologico
    1. Dopo ≥7 giorni di recupero post-operatorio, fissare la testa del mouse Thy1-GCaMP6f utilizzando la barra frontale impiantata all'interno di un apparecchio di fissazione progettato su misura e attenuato dalle vibrazioni, montato su uno stadio motorizzato XY.
    2. Posiziona l'animale comodamente su un tapis roulant cilindrico a basso attrito lubrificato all'aria, permettendo un movimento libero degli arti posteriori. Mantenere l'anestesia chirurgica leggera tramite somministrazione nasale dello 0,5-0,8% di isoflurano al 100% di O₂. Questo livello ridotto di isoflurano minimizza la soppressione dell'attività neurale assicurando al contempo un'immobilità sufficiente per l'imaging ad alta risoluzione.
    3. Monitorare e registrare continuamente la temperatura corporea centrale (mantenuta a 37,0 ± 0,2 °C tramite borsa riscaldante controllata a feedback), la frequenza respiratoria (100-140 respiri/min) e la saturazione periferica di ossigeno (SpO₂ > 95%).
    4. Applicare un gel oftalmico per prevenire la secchezza corneale durante l'imaging prolungato. Assicurarsi che l'ipsilaterale dell'arto posteriore alla finestra cranica S1HL sia accessibile per l'inserimento dell'ago EA a ST36.
    5. Prevedi 15-20 minuti per la stabilizzazione fisiologica dopo la fissazione della testa prima di iniziare l'imaging29.
  2. Targeting ottico e ottimizzazione per l'imaging di livello II/III
    1. Determina con precisione il piano focale per acquisire segnali neuronali di alta qualità. Segui questa procedura di verifica.
      1. Riduci la potenza del laser a un livello basso (tipicamente il 10-20% della potenza di immagini, ad esempio 5-10 mW) per evitare fotosbiancamenti e danni fotografici inutili durante la posizione dell'aereo.
      2. Utilizzando l'azionamento dell'asse Z del microscopio a due fotoni, muovi lentamente l'obiettivo a passi di micron. Inizia dalla superficie della finestra cranica e avanza più a fondo nel tessuto cerebrale.
      3. Nella modalità di anteprima in diretta , identifica il piano focale usando questi indicatori visivi come descritto nei passaggi 3.2.1.4 e 3.2.1.5.
      4. Per il piano focale corretto su uno strato di soma neuronale: Conferma che l'immagine mostri strutture puntate chiare, luminose (somata neuronale) rotonde o ovali con buon contrasto di sfondo. Assicurati che i confini delle cellule siano netti e presentino un aspetto distintivo "sale e pepe".
      5. Per un piano focale errato: se l'immagine appare sfocata o omogenea senza strutture puntiate ben definite, riconosci che la messa a fuoco si trova in una regione priva di somata. Se sono visibili grandi ombre vascolari scure e non strutturate, identifica questo tipo come lo strato dei vasi sanguigni.
    2. Verifica della base di fluorescenza appropriata
      1. Confermare una base di fluorescenza sana e stabile prima di applicare qualsiasi stimolo sperimentale per garantire un'interpretazione valida dei segnali successivi di calcio (ΔF/F). Esegui i passaggi 3.2.2.2-3.2.2.4.
      2. Regolare la potenza del laser al livello di imaging formale (ad esempio, 30-50 mW).
      3. Acquisisci immagini per qualche secondo in una modalità di anteprima veloce e a bassa risoluzione.
      4. Osserva in tempo reale l'intensità media di fluorescenza visualizzata (o monitora direttamente la luminosità dell'immagine). Verifica che il segnale rimanga stabile e non mostri segni di fotosbiancamento rapido prima di procedere all'acquisizione sperimentale dei dati.
    3. Centra il campo visivo dell'imaging all'interno della finestra cranica.
      1. Applicare gel a ultrasuoni o acqua distillata tra l'obiettivo e il copertura per l'accoppiamento a immersione. Utilizzando contrasto a gradiente Dodt infrarossi o illuminazione a epifluorescenza, identificare la vascolarizzazione superficiale e allineare il campo visivo (FOV) per evitare grandi vasi superficiali (>20 μm di diametro).
      2. Passa alla modalità eccitazione a due fotoni utilizzando un laser Ti:Sapphire a femtosecondi sintonizzabile. Imposta la lunghezza d'onda di eccitazione a 920 nm - ottimale per eccitare GCaMP6f (picco ~920 nm) minimizzando al contempo l'autofluorescenza verde e il fotodanno rispetto a lunghezze d'onda più corte.
      3. Aumentare gradualmente la potenza del laser (tipicamente 20-50 mW misurati al campione) mentre si focalizza attraverso la dura trasparente verso la superficie corticale (pia mater). Regolare la posizione Z dell'obiettivo utilizzando un dispositivo piezoelettrico a nano-focus per raggiungere una profondità di 200 ± 10 μm sotto la superficie pial, corrispondente allo strato corticale II/III.
      4. Confermare la profondità tramite densità e morfologia neuronale caratteristica: una popolazione densa di somata piramidale da piccolo a medio (10-15 μm di diametro) con dendriti apicali visibili.
      5. Ottimizzare le impostazioni di guadagno della potenza laser e del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per ottenere una fluorescenza di base GCaMP6f forte (F0) senza saturazione (intensità dei pixel ~50-70% del massimo del rivelatore) e con un fondominimo 30,31.
        NOTA: Durante l'imaging, la potenza media della luce di eccitazione da 920 nm è stata mantenuta con precisione a 30-50 mW sull'obiettivo. Questo livello di potenza è stato convalidato tramite esperimenti pilota su tessuti animali sottoposti a procedure chirurgiche identiche, garantendo un'acquisizione efficace del segnale per durate di scansione fino a 25 minuti, minimizzando al contempo il fotodanno e lo sbiancamento fotografico a fluorescenza.
  3. Protocollo di acquisizione per immagini del calcio ad alta velocità
    1. Configura lo scanner risonante per l'acquisizione di frame ad alta velocità:
      Dimensione del fotogramma: 512 × 512 pixel (campo di vista tipico: ~450 × 450 μm, dimensione pixel ~0,88 μm)
      Frame rate: 7 frame al secondo (fps) ottenuto tramite scansione bidirezionale (~14 kHz line rate). Questa velocità campiona adeguatamente la cinetica del decadimento GCaMP6f (τ~500 ms) bilanciando al contempo il rapporto segnale-rumore (SNR) e minimizzando il fotosbiancamento.
      Tempo di permanenza del pixel: ~0,8 μs (ottimizzato per SNR a 7 Hz).
    2. Avviare l'acquisizione a tempo continuo utilizzando software di acquisizione (ad esempio, ScanImage, Prairie View). Registra un periodo di basi di 5 minuti prima dell'inizio della stimolazione dell'EA per stabilire la dinamica dell'attività neurale pre-stimolo (F₀).
    3. A t = 5 minuti precisi, iniziare la stimolazione EA a ST36 mentre l'imaging prosegue senza interruzioni. Raccogli dati in modo continuo durante i 20 minuti di stimolazione EA. Durata totale della scansione = 25 min (1500 s, ~10.500 fotogrammi).
    4. Salvati i dati come uno stack multi-TIFF o un formato binario proprietario con timestamp incorporati sincronizzati agli impulsi di trigger EA tramite un canale di ingresso TTL.
    5. Monitorare la stabilità della potenza del laser e la deriva di messa a fuoco (<2 μm) in tempo reale; Pausa brevemente per rifocalizzare solo se si verifica una deriva significativa (ad esempio, >5 μm), notando il puntotemporale 32,33.
  4. Correzione rigorosa del movimento e registrazione spaziale
    1. Dopo l'acquisizione, elabora lo stack di imaging grezzo usando NoRMCorre (Non-Rigid Motion Correction) in MATLAB per eliminare artefatti spaziali dai micromovimenti residui (ad esempio, respirazione, impulso).
    2. Per prima cosa, suddividere la pila in patch spaziali sovrapposte (ad esempio, 64 × 64 pixel, 50% di sovrapposizione). Per ogni patch, calcola un template di riferimento facendo la media dei frame ad alto SNR dal periodo di base.
    3. Utilizzando la correlazione incrociata basata su Fourier, calcola gli spostamenti traslazionali X-Y per ogni frame rispetto al template. Applica questi spostamenti tramite interpolazione subpixel.
    4. Successivamente, affrontare le deformazioni non rigide: modellare le distorsioni locali all'interno delle patch usando trasformazioni affini a tratti (traslazione + taglio). Aggiorna iterativamente il modello per migliorare l'accuratezza della registrazione. Parametri chiave:
      max_shift: 20 pixel (limite per la traslazione)
      max_dev: 3 pixel (deviazione massima non rigida)
      bin_width: 50 frame (binning temporale per aggiornamenti dei template)
    5. Visualizza l'efficacia della correzione ispezionando il grafico di correlazione frame-to-frame (dovrebbe stabilizzarsi vicino a 1.0 dopo la correzione) e generando una mappa media delle differenze di proiezione dell'immagine (pre- vs. post-correzione). Salva lo stack corretto per il movimento per l'analisi a valle. Questo passaggio è fondamentale per un'analisi accurata pixel per pixel dei transitori del calcio, specialmente durante i movimenti sottili degli arti indotti dall'EA.

4. Analisi della dinamica spaziotemporale

Lo stack di imaging corretto in movimento subisce segmentazione neuronale automatizzata e l'estrazione del segnale utilizzando la pipeline Suite2p (v0.12.3) in Python. Le fasi chiave di elaborazione includono:

  1. Identificazione delle impronte spaziali
    1. Applicare la fattorizzazione a matrice non negativa vincolata (CNMF) per decomporre lo stack in componenti spaziali.
    2. Inizializzare le regioni di interesse (ROI) utilizzando un approccio basato sulla correlazione: unisci pixel con correlazione spaziale incrociata > 0,7 e SNR locale > 4 in ROI candidati. Distinguere i ROI somatici dai dendriti/assoni per dimensione (diametro 8-15 μm) e circolarità (soglia di compattezza >0,6).
  2. Correzione della contaminazione da neuropil
    1. Per ogni ROI, si definisce un anello neuropilo concentrico (raggio interno: 1,5× raggio ROI, raggio esterno: 2,5× raggio ROI).
    2. Calcola il coefficiente neuropil (r_neuropil) tramite regressione ai minimi quadrati:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Coefficiente validato empiricamente per topi Thy1-GCaMP6f).
  3. Deconvoluzione del segnale
    1. Inferire l'attività di picco usando OASIS (deconvoluzione regolarizzata l₁) con il modello di rumore AR(2) per stimare la probabilità di picco S(t) da tracce ΔF/F:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      dove 'k' è il nucleo transiente di calcio e ε è rumore gaussiano.
  4. Controllo qualità
    1. Escludere i ROI con SNR <3, sovrapposizione spaziale >30% o correlazione neuropil >0,3. La verifica visiva viene effettuata tramite la GUI34 di Suite2p.
      Le operazioni specifiche e gli elementi dell'interfaccia sono forniti nel File Supplementare 1. Il file TIFF corretto di movimento generato sopra è stato direttamente inserito nella pipeline Suite2p. Sebbene l'ambiente integrato di Suite2p includa una propria correzione rigida del movimento, questo passaggio interno ridondante è stato disabilitato poiché era già applicata una correzione non rigida più precisa. I ROI neuronali estratti automaticamente si trovano nel File Supplementare 2.

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Results

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Caratterizzazione strutturale della corteccia S1 e dell'attività neurale di base
Abbiamo iniziato stabilendo una base strutturale e funzionale ad alta fedeltà per i nostri esperimenti di imaging. L'analisi morfologica tissutale ha rivelato differenze strutturali riconoscibili tra le preparazioni craniche a finestra cranica non capplicate (Figura 2A) e applicate con copertura (Figura 2B). Sebbene l'applicazion...

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Discussion

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Per colmare il divario critico nell'osservazione degli effetti corticali dell'elettroagopuntura (EA) in tempo reale, presentiamo un protocollo integrato completo che combina l'impianto cronico della finestra cranica per l'accesso ottico, la stimolazione standardizzata dell'EA e l'imaging calcio longitudinale a due fotoni mirata alla corteccia somatosensoriale primaria (S1).

Questo protocollo integrato offre diversi vantaggi distinti rispetto ai metodi tradizio...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 82405550). Ringraziamo i membri del laboratorio Zhang per le discussioni utili.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CarprofenMCEN/A5 mg/kg per analgesia
Fotogramma stereotassico digitaleRWDKopf Modello 1900
Stimolatore di elettroagopunturaHANS LH202 (impulsi bifasici a 2/100 Hz)N/AHANS LH202 (impulsi bifasici a 2/100 Hz)
IsofluranoRWDR510-22-10Portatore di ossigeno di grado medico, 100%
Sistema micro-perforatoreRWDBava in carburo da 0,5 mm, raffreddata in soluzione salina
Povidone-iodioMCEHY-B2234Soluzione al 10%
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Soluzione salina sterileBeyuntianST341-500ml0,9% NaCl
Microscopio chirurgicoZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 e volte; Ingrandimento
Topi transgenici Thy1-GCaMP6fCygen55239788-12 settimane, maschio/femmina
Microscopio a due fotoniNikon A1MPNikon A1MPLaser Ti:Zaffiro (eccitazione 920 nm)

References

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