Interferometria Biolayer per l'Indagine del Legame Proteina-Inibitore della Membrana: TACAN Mutant e GsMTx4 come Sistema Modello

Sommario

Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per ottimizzare e condurre esperimenti di Bio-Layer Interferometry (BLI) per studiare le interazioni proteina-ligando di membrana per proteine di membrana solubilizzate in detergente. Utilizzando l'interazione tra il mutante TMEM120A M207A e l'inibitore peptidico GsMTx4 come modello, questo flusso di lavoro delinea la preparazione proteica, il carico dei biosensori e l'acquisizione dei dati cinetici.

Abstract

L'Interferometria Bio-Layer (BLI) è una tecnica biofisica efficiente che consente l'analisi quantitativa in tempo reale delle interazioni biomolecolari. Sebbene comunemente usate per proteine solubili, la loro applicazione alle proteine di membrana rimane difficile a causa dell'idrofobia e della dipendenza dal detersivo. Questo studio presenta un protocollo BLI ottimizzato per caratterizzare le interazioni tra proteina di membrana solubilizzata in detergente e inibitori peptidici.

Come sistema modello, il peptide modificatore di gating Grammostola mechanotoxin 4 (GsMTx4) è stato testato contro il mutante multifunzionale della proteina di membrana TMEM120A M207A. La variante TMEM120A contrassegnata con FLAG è stata immobilizzata su biosensori anti-FLAG - rappresentanti un sistema basato su tag ma senza etichette fluorescenti ed enzimatiche - ed esposta a diluizioni seriali di GsMTx4 per misurare i tassi di associazione e dissociazione.

Il protocollo integra l'ottimizzazione del detergente utilizzando Lauryl Maltose Neopentil Glicole (LMNG) e caratterizzazione complementare tramite fotometria di massa e fluorimetria differenziale a scansione (DSF). Questo flusso di lavoro consente misurazioni cinetiche affidabili ed è compatibile con lo screening a media trotto. L'approccio potrebbe essere applicabile ad altri sistemi proteina-ligando di membrana in cui la stabilità del detergente è mantenuta. Nel complesso, lo studio evidenzia parametri chiave che influenzano l'efficienza dell'immobilizzazione e la consegna degli analiti, supportando la potenziale utilità del BLI nel profiling degli inibitori e negli studi meccanicistici delle interazioni proteiche di membrana.

Introduzione

Le proteine di membrana svolgono ruoli centrali nei processi fisiologici essenziali, inclusa la trasduzione del segnale, il trasporto di ioni e metaboliti e l'organizzazione della membrana. Dato il loro coinvolgimento nella comunicazione cellulare e nell'omeostasi, rappresentano una quota significativa dei target farmacologici nello sviluppo clinico. Comprendere le interazioni membrana-proteina e ligando è fondamentale per chiarire la funzione e guidare la progettazione terapeutica. Tuttavia, la natura anfipatica di queste proteine e la loro dipendenza dagli ambienti lipidici presentano sfide significative per la purificazione, la stabilizzazione e la caratterizzazione biofisica.

La risonanza plasmonica superficiale (SPR) e la calorimetria da titolazione isotermica (ITC) sono tecniche ampiamente utilizzate per studiare la cinetica e la termodinamica delle interazioni membrana-proteina-ligando ^1,2. Quando adeguatamente ottimizzati, entrambi i metodi possono fornire approfondimenti quantitativi dettagliati, anche per proteine di membrana solubilizzate o ricostituite in detergente. La termoforesi su scala microscopica (MST) è stata applicata con successo anche per valutare le affinità di legame in condizioni quasi native, in particolare per le proteine di membrana³. Tuttavia, questi approcci possono essere limitati da un consumo sostanziale di campioni, difficoltà nel mantenere la stabilità delle proteine di membrana o compatibilità limitata con alcuni sistemi di detersivo.

L'Interferometria a Biostrato (BLI) è una tecnica ottica in tempo reale che consente la misurazione quantitativa delle interazioni biomolecolari, incluse quelle che coinvolgono proteine di membrana solubilizzate in detersivo o anfihipolo. Insieme alle tecniche biofisiche già menzionate, il BLI offre una piattaforma efficiente che consente la misurazione diretta della cinetica di legame, inclusi le costanti di associazione (k_on), dissociazione (k_off) e dissociazione di equilibrio (K_D), con concentrazioni campionarie più basse e un adattamento diretto alle proteine di membrana solubilizzate in detergenti o nanodischi. È anche importante notare che, come tutte le tecnologie biofisiche, il BLI presenta i suoi limiti, che saranno menzionati nella sezione Discussione.

Il BLI rileva spostamenti nel pattern di interferenza della luce bianca riflessa dalla punta di un biosensore, con variazioni nello spessore ottico corrispondenti a eventi di legame biomolecolare. Questi spostamenti (Δλ, in nm) sono registrati come sensorgrammi e sono proporzionali alla massa legata alla superficie del sensore. Il BLI è stato ampiamente applicato alle interazioni proteina-proteina e proteina-ligando (inclusi peptidi e piccole molecole) ed è adatto a gamme di affinità che vanno da nanomolari a^{micromolari 4}. La sua flessibilità, il basso consumo di campioni e la configurazione relativamente semplice la rendono uno strumento potenzialmente vantaggioso per studiare proteine di membrana solubilizzate in ^{detersivo 5,6,7}.

Questo studio presenta un protocollo BLI per caratterizzare l'interazione tra TMEM120A M207A, una proteina di membrana, e la meccanotossina 4 di Grammostola (GsMTx4), un inibitore peptidico. TMEM120A è stato proposto come canale ionico meccanosensibile coinvolto nella rilevazione meccanica del dolore⁸; tuttavia, la sua attività nei canali ionici rimane controversa. Numerosi studi hanno riportato l'assenza di correnti meccanosensibili quando TMEM120A è espressa in sistemi eterologi come HEK293 o le cellule^CHO 1,9,10,11. Ad oggi, più di quattro studi crio-EM hanno risolto la struttura della TMEM120A nello stato chiuso, e non è stata osservata alcuna conformazione aperta 1,9,10,11.

Simulazioni di dinamica molecolare e analisi elettrofisiologiche indicano che la metionina 207 (M207) negli TMEM120A umani selvatici potrebbe agire come barriera di accesso all'interno della via di conduzione^{ionica 11}. La mutazione di questo residuo in alanina (M207A) ha dimostrato aumentare la permeabilità ionica, probabilmente alterando l'impacchettamento elicoidale e spostando catene laterali idrofobiche come Phe223. Di conseguenza, il mutante M207A fu selezionato per studi di legame con GsMTx4.

GsMTx4 è un peptide modificatore di gating derivato dal veleno di ragno che inibisce i canali cationici meccanosensibili. Consiste in una sequenza di 32 amminoacidi e ha un peso molecolare di 4-5 kDa, inclusi canali piezologici e TRP, principalmente interagendo con il bistrato lipidico piuttosto che bloccando direttamente il^{poro 12,13}. Studi precedenti hanno dimostrato che GsMTx4 riduce l'attività TMEM120A nei sistemi bistrato^{artificiali 8}. Negli saggi BLI, il mutante M207A TMEM120A è stato immobilizzato su biosensori anti-FLAG ed esposto a concentrazioni crescenti di GsMTx4, permettendo di misurare i tassi di associazione (k_on) e dissociazione (k_off).

Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato per l'ottimizzazione del detergente e l'analisi cinetica utilizzando l'Interferometria Bio-Layer (BLI). Sebbene il BLI presenti alcune limitazioni, come potenziali artefatti dovuti a sovraccarico dei sensori o effetti di trasporto di massa e una ridotta idoneità per interazioni a velocità di associazione rapida (k_on), è un metodo utile per studiare le interazioni membrana-proteina-ligando in condizioni controllate di solubilizzazione in detergente. Il protocollo è adatto a sistemi con affinità di legame da moderate a basse (tipicamente nella gamma nanomolare a micromolare) e può essere adattato ad altri bersagli idrofobici quando vengono applicati controlli e condizioni di buffer appropriate.

Protocollo

1. Purificazione delle proteine e ottimizzazione del campione

1. Coltura cellulare e trasfezione
   1. Coltivare cellule di sospensione HEK293T/SF17 in un mezzo senza siero integrato con 20 mM di L-glutamina in un incubatore shakeante impostato a 120 RPM, 37 °C, 80% di umidità e 8% CO₂. Mantenere le cellule passando fino al passaggio cinque; permettono alle cellule di raggiungere una densità di circa 5 × 10⁶ cellule/mL.
   2. Trasfettare le cellule con il plasmide TMEM120A M207A (N-terminale FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) nel vettore pCDNA3.1 utilizzando un reagente commerciale per la transfezione secondo le istruzioni del produttore (vedi la Tabella dei Materiali).
   3. Le cellule trasfectate da pellet tramite centrifugazione a 5.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Conserva la pellet cellulare a -80 °C fino alla purificazione.
2. Lisi cellulare e solubilizzazione (Figura 1)
   1. Risospendere un pellet di 30 mL in un tampone di solubilizzazione contenente 100 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etanosolfonico (HEPES), pH 7,8; 300 mM NaCl; 0,5% (v/v) o 4,98 mM maltosio di auro neopentil glicole (LMNG); 1x cocktail di inibitori della proteasi; 50 μg di DNasi I; 10% (v/v) di glicerolo.
   2. Lisa le cellule tramite ultrasonicazione al 25% di ampiezza usando un ciclo di impulsi di 20 secondi acceso/20 secondi spento per 15 minuti, mantenendo il campione sul ghiaccio per evitare il surriscaldamento.
   3. Chiarire il lisato centrifugando a 25.800 × g per 45 minuti a 4 °C.
3. Purificazione di affinità usando resina anti-FLAG
   1. Equilibrare resina anti-FLAG M2 con buffer di equilibrio contenente 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,05% (w/v) o 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) di glicerolo.
   2. Incubare il sovrandanante chiarificato con resina equilibrata per 2 ore a 4 °C su un oscillante.
   3. Lavare la resina 2 volte con un tampone di lavaggio contenente 25 mM HEPES, pH 7,8; 150 mM NaCl; 0,05% (w/v) o 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) di glicerolo.
   4. Eluire la proteina legata usando un tampone di eluzione contenente 25 mM di HEPES, pH 7,8; 400 mM NaCl; 0,001% (w/v) o 0,00995 mM LMNG; 10% (v/v) di glicerolo; 200 μg/mL peptide FLAG.
4. Cromatografia a concentrazione e esclusione di dimensione (SEC)
   1. Concentrarsi la proteina eluata a ~500 μL utilizzando un'unità centrifuga di filtro con un cutoff di 30 kDa.
   2. Eseguire la SEC utilizzando la colonna di esclusione di dimensioni di riferimento equilibrata con 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (w/v) o 0,00149 mM LMNG.
   3. Raccogli e raccogli le frazioni di picco corrispondenti alla proteina bersaglio.
   4. Concentra le frazioni aggregate fino a ~3 mg/mL di concentrazione finale. Dopo la purificazione dell'affinità, confermare che il monomero della proteina TMEM120A M207A appare a circa 43 kDa su SDS-PAGE (Figura 2A). Per la SEC, confermare che la proteina purificata nel LMNG eluisce come un picco monodisperso corrispondente a circa 150 kDa, che rappresenta il dimero TMEM120A M207A insieme alla micella detergente LMNG (Figura 2B).
      NOTA: Occasionalmente, la banda proteica monomerica può apparire intorno ai 50 kDa, cosa comune per le proteine di membrana solubilizzate in detersivo, poiché non è tipico bollire campioni di proteine di membrana.

2. Analisi della stabilità termica tramite fluorimetria a scansione differenziale nano (NanoDSF)

1. Diluire la proteina purificata TMEM120A M207A a 0,15 mg/mL in tampone SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
2. Carica 10 μL di ciascun campione in capillari ad alta sensibilità.
3. Esegui il saggio di spostamento termico su uno strumento NanoDSF con una rampa di temperatura da 25 °C a 90 °C.
4. Usa software compatibile per impostare il test ed eseguire un'analisi automatica.
5. Confermare che una singola curva di transizione termica (T_m) sia visibile, indicando un evento di sviluppo cooperativo (Figura 3).

3. Fotometria di massa per la determinazione dello stato oligomerico

1. Prepara un campione diluito a 80 nM in un tampone SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
2. Posizionare il campione in vetri di massa pre-puliti compatibili con fotometria.
3. Acquisire dati utilizzando impostazioni standard e calibrare utilizzando standard proteici.
4. Processare i dati con software di analisi per generare istogrammi di distribuzione di massa (Figura 4A-C).

4. Protocollo di interferometria biostrato (BLI)

NOTA: Questo protocollo descrive un saggio cinetico BLI progettato per studiare le interazioni tra TMEM120A M207A marcati FLAG e liganti come GsMTx4, utilizzando un formato micropiastra a 384 pozzi. Sebbene sviluppato per TMEM120A, il flusso di lavoro può essere adattato ad altre proteine di membrana. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando una piattaforma di interferometria ottica con sonde biosensori FLAG per immobilizzare TMEM120A M207A marcati FLAG. È stata utilizzata una micropiastra nera a 384 pozzi con un buffer di cromatografia a esclusione di dimensione (SEC) ottimizzata contenente 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG e 0,0005% Tween-20, pH 7,8. È stato incluso il Tween-20 per minimizzare il legame non specifico. La concentrazione proteica è stata mantenuta a 250 nM e tutti i saghi sono stati eseguiti in duplicazione per garantire la riproducibilità.

1. Considerazioni di progettazione del saggio
   1. Equilibrio della temperatura
      1. Prima di iniziare il test BLI, bilanciare tutti i componenti del saggio - inclusi tampon, campioni e sonde biosensoriali - alla temperatura ambiente (circa 20-25 °C). Durante l'acquisizione dei dati, mantenere la temperatura del saggio a 30 °C, raccomandata per analisi cinetiche al fine di ottimizzare la stabilità delle proteine, il legame dei liganti e la riproducibilità.
         NOTA: Questo passaggio di equilibrio garantisce profili cinetici coerenti e minimizza gli artefatti causati dalle fluttuazioni di temperatura durante l'esperimento. Prevedi tempo sufficiente (almeno 10-15 minuti) affinché tutti i reagenti e i biosensori raggiungano l'equilibrio termico prima di iniziare il saggio.
   2. Idratazione e rigenerazione dei sensori
      1. Idratare i nuovi biosensori FLAG in 250 μL di buffer compatibile BLI (buffer SEC contenente 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% w/v LMNG e 0,0005% Tween-20, pH 7,8) nella piastra massima per almeno 10 minuti prima dell'uso.
         NOTA: Maneggiare con attenzione i biosensori con pinzette pulite e senza polvere per evitare contaminazioni, che possono interferire con l'acquisizione del segnale e portare a risultati incoerenti. Per il riutilizzo del sensore, eseguire la rigenerazione utilizzando il buffer Q (0,3 M glicina, pH 3,8). Una corretta idratazione e rigenerazione sono fondamentali per mantenere le prestazioni e la riproducibilità dei sensori, specialmente quando si lavora con proteine di membrana solubilizzate in detersivo, sensibili alle condizioni ambientali.
   3. Gestione del tampone
      1. Evita le bolle d'aria durante la dispensazione di liquidi, poiché possono interferire con l'acquisizione del segnale ottico.
   4. Composizione e coerenza del buffer
      1. Usa un tampone che minimizzi le interazioni non specifiche preservando la funzione proteica. Per TMEM120A M207A, preparare il tampone contenente 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (p/v) LMNG, 0,0005% (p/v) Tween 20, pH 7,8.
   5. Immobilizzazione proteica
      1. Ottimizza il carico dei liganti per raggiungere una saturazione del sensore del 50-80%. Utilizzare una concentrazione fissa di proteine a 250 nM, con una durata tipica di caricamento di circa 120 s. Carica TMEM120A M207A (250 nM) con il marchio FLAG sul biosensore per 120 secondi per raggiungere una saturazione del 50-80%.
      2. Confermare che il segnale del biosensore raggiunge il 50-80% della capacità massima di legame durante la fase di caricamento.
         NOTA: I segnali sotto il 50% possono indicare un'immobilizzazione proteica insufficiente, mentre i segnali superiori all'80% possono introdurre limitazioni nel trasporto di massa o ostacoli sterici, compromettendo potenzialmente le misurazioni cinetiche.
      3. Per valutare i potenziali effetti del trasporto di massa, si effettua un esperimento di controllo in cui la concentrazione dell'analita (ad esempio, 100 nM GsMTx4) viene mantenuta costante variando i livelli di carico di TMEM120A-M207A sui biosensori FLAG (Figura Supplementare S1).
         NOTA: Le successive misurazioni cinetiche - inclusi associazione, dissociazione, atteggiamenti globali di legame e determinazione di k_on e _{k off} - non sono state significativamente diverse da quelle ottenute nel saggio principale. Questo risultato indica che TMEM120A carico nell'intervallo del 50-80% non introduce artefatti significativi di trasporto di massa, confermando che il livello di carico dei biosensori è adeguato per un'analisi cinetica affidabile.
   6. Stima K_D
      1. Determinare l'affinità di legame (K_D) testando le concentrazioni dell'analita (GsMTx4) di 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM e 100 μM.
   7. Controlli del segnale di fondo
      1. Includere controlli appropriati per sottrarre con precisione i segnali di fondo e garantire misurazioni cinetiche affidabili.
      2. Utilizzare una sonda FLAG di riferimento per tenere conto di legami non specifici o deriva che possono verificarsi durante il saggio.
         NOTA: Questa sonda di riferimento non deve immobilizzare la proteina bersaglio e funge da base per correggere il segnale ottenuto dalle sonde contenenti il campione.
      3. Sottrai il segnale di riferimento dal segnale campione per analizzare solo le interazioni specifiche tra TMEM120A M207A marcati FLAG e gli analiti.
         NOTA: Verifica che la sonda FLAG di riferimento mostri un segnale minimo durante tutto il saggio. Una linea di base stabile e bassa indica un legame non specifico trascurabile. Se il segnale di riferimento fluttua o aumenta, rivalutare la composizione del tampon, la gestione delle sonde o la preparazione del campione per ridurre le interazioni aspecifiche prima di procedere con l'analisi cinetica.
2. Configurazione dei parametri base del saggio per l'analisi cinetica
   1. Imposta la frequenza di acquisizione dati a 5 Hz per raccogliere 5 punti dati/s (raccomandato per tutti i saggi cinetici).
   2. Seleziona la piastra a 384 pozzi come formato di piastra a piatta.
   3. Imposta la velocità dello shaker a 1.000 RPM e la temperatura tra ambiente e 30 °C (30 °C utilizzati in questo esperimento per ottenere risultati cinetici ottimali).
3. Configura la configurazione della piastra.
   1. Naviga nella scheda Setup Plate e definisci le assegnazioni dei pozzi sia per la piastra a 384 pozzi che per la piastra Max.
   2. Assegnare le funzioni del pozzo sulla piastra a 384 pozzi.
      NOTA: I simboli e le annotazioni usati sia per la piastra a 384 pozzi che per la Max Plate sono riassunti nella Tabella Supplementare S1.
      1. Etichettare i pozzi in base al ruolo: cuscinetto, proteina (carico), ligando (campione).
      2. Annota i pozzi di carico proteico con concentrazione (ad esempio, 250 nM) per i saggi cinetici.
         NOTA: Un'etichettatura accurata è essenziale per calcolare k_on e k_D (vedi Figura Supplementare S2A).
   3. Configura la mappa delle placche Max (piastra sonda).
      1. Assegnare le sonde biosensori ai pozzi appropriati.
      2. Se è prevista la rigenerazione delle sonde, assegnare pozzi per buffer di rigenerazione e neutralizzazione. Etichettare chiaramente questi pozzi nel software per garantire una corretta automazione durante la rigenerazione (vedi Tabella Supplementare S2).
         NOTA: Il buffer del saggio era composto da 25 mM HEPES (pH 7,8), 200 mM di NaCl, 0,00015% (v/v) LMNG e 0,0005% (v/v) Tween-20. La fase di rigenerazione delle sonde biosensori anti-FLAG è stata eseguita utilizzando un buffer Q contenente 0,3% di glicina (pH 3,8), seguita da una fase di neutralizzazione con il tampone del test (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG e 0,0005% Tween-20, pH 7,8).
4. Seleziona la scheda Passi del Saggio .
   1. Vai alla scheda Passi del Saggio per configurare il flusso di lavoro del saggio cinetico. Specificare le posizioni del pozzo per ogni fase del saggio, inclusi la linea di base, il carico proteico, l'associazione e la dissociazione (vedi Figura Supplementare S3).
   2. Seleziona il tipo di passo appropriato dal menu a tendina. Assicurarsi che le fasi di associazione e dissociazione siano correttamente etichettate per un'analisi cinetica accurata.
   3. Inserisci la durata di ogni passaggio in secondi per definire i tempi di esposizione di tutte le fasi di interazione.
      1. Imposta la durata del passo di base per consentire l'equilibrio dei sensori prima del carico proteico (60 s).
      2. Imposta la durata del carico proteico per raggiungere livelli desiderati di immobilizzazione dei liganti di (60 s) (Figura 5).
      3. Imposta la durata del passo di associazione per consentire un legame sufficiente all'analita (300 s) (Figura 5).
      4. Imposta la durata del passo di dissociazione per catturare adeguatamente la cinetica di svincolo dell'analita (600 s) (Figura 5).
   4. Imposta la velocità dello shaker (RPM) per ogni passaggio per mantenere una miscelazione costante e una qualità ottimale dei dati (1.000 RPM).
5. Allineare e filtrare il passo (vedi Figura Supplementare S4 e Figura Supplementare S5)
   1. Esegui la correzione dei dati grezzi modificando l'intervallo di dati secondo necessità per rimuovere artefatti dai passaggi cinetici.
   2. Per allineare l'asse Y, allinea i dati all'inizio del passaggio di associazione selezionando Associazione sotto Allinea il Tipo di Passo e attivando l'opzione Inizia .
   3. Abilita l'opzione di correzione Interstep per mantenere la continuità tra i passaggi durante i saghi cinetici standard.
   4. Filtraggio: applica il livellaggio dei dati per ridurre il rumore del segnale senza distorcere le tendenze. Seleziona Elaborato per confrontare i dati smussati con i segnali grezzi.
6. Imposta un passo di riferimento (vedi Figura Supplementare S6).
   1. Designa una sonda di riferimento selezionandola e cliccando sul pulsante Riferimento. Sonda.
   2. Seleziona le sonde campione cliccando sui numeri di colonna corrispondenti per le sonde campione.
   3. Per definire la funzione di sottrazione, apri l'Editor di Formule, clicca su Modifica Formula e definisci la funzione di sottrazione per rimuovere lo sfondo.
   4. Rivedere la visualizzazione a Tabella per confermare che la sottrazione di riferimento è stata applicata correttamente.
7. Passaggio di montaggio del binding
   1. Naviga nella scheda Fitting e definisci i parametri di analisi (Figura Supplementare S7).
   2. Selezione dei dati: Includere sia le fasi di associazione che di dissociazione per l'adattamento cinetico locale. Escludi manualmente gli outlier se mostrano un adattamento della curva scarso o un segnale erratico.
   3. Selezione del modello di binding: Scegli il modello di binding 1:1 per adattarlo ai dati, a meno che non venga osservato un comportamento complesso. Rivedere le sovrapposizioni delle curve e i residui per validare l'idoneità del modello.
   4. Strategia di adattamento: Seleziona una delle seguenti strategie di adattamento a seconda della qualità dei dati e degli obiettivi sperimentali:
      1. Locale: Si adatta a ogni concentrazione di analito individualmente, permettendo una valutazione indipendente della cinetica di associazione e dissociazione.
      2. Globale: Soddisfa tutte le concentrazioni di analiti simultaneamente utilizzando un unico insieme di parametri cinetici, fornendo un modello complessivo per il dataset.
      3. Full: Si adatta sia alle fasi di associazione che a quelle di dissociazione a livello globale in tutte le concentrazioni.
      4. Parziale: Si adatta solo alla fase di associazione, ignorando la dissociazione.
         NOTA: I dati BLI sono stati analizzati utilizzando un modello di legame di Langmuir 1:1 con adattamento locale e completo. L'adattamento locale garantisce che ogni concentrazione di analita venga trattata indipendentemente, fornendo una rappresentazione accurata della cinetica associativa e minimizzando gli artefatti derivanti dall'eterogeneità nella fase di dissociazione. Questo approccio evita il sovrafitting in regioni con segnali variabili o instabili, permettendo una stima più affidabile dei parametri cinetici (k_acceso e_{k spento}) (Tabella 1 e Tabella 2).
8. Analisi cinetica
   1. Revisione delle curve e dei residui adattati: Esaminare le curve adattate e i relativi residui per valutare la qualità e la validità del modello. Confermare che i residui sono distribuiti casualmente attorno a zero senza deviazioni sistematiche (vedi Figura 4E per i residui rappresentativi).
   2. Esclusione di dati mal adattati: rimuovere le concentrazioni di analiti che mostrano segnali piatti, rumorosi o altrimenti inaffidabili per migliorare l'accuratezza complessiva del modello.
      NOTA: Ad esempio, la concentrazione di 10 μM è stata esclusa dall'adattamento a causa della sovrapposizione con il dataset di 5 μM, che potrebbe distorcere la stima dei parametri cinetici (vedi Figura 6A,B).

Risultati

Il mutante M207A TMEM120 è stato espresso in celle di sospensione HEK293SF-17 utilizzando un vettore pCDNA3.1 che codifica un tag FLAG N-terminale Figura 1. La trasfezione transitoria ha permesso l'espressione ricombinante di proteine. Dopo il prelievo cellulare, le proteine di membrana sono state solubilizzate nello 0,5% di laurylmaltosio neopentil glicole (LMNG), un detergente non ionico adatto al mantenimento della solubilità proteica di membrana.

La frazione solubilizzata è stata sottoposta a purificazione per affinità utilizzando resina anti-FLAG M2. La resina è stata lavata con un tampone contenente 0,01% LMNG per rimuovere proteine non specificamente legate, e TMEM120 M207A è stato eluzionato in un tampone contenente 0,001% LMNG. L'eluzione è stata concentrata utilizzando filtri centrifughi con tagli di peso molecolare di 30 kDa o 100 kDa, a seconda della resa del campione. Ulteriore purificazione veniva effettuata tramite cromatografia a esclusione di dimensioni (SEC). L'ultimo passaggio SEC è stato eseguito in un tampone contenente 0,00015% LMNG, che ha prodotto un profilo di eluzione monodispersa coerente con una preparazione proteica omogenea e stabile, adatta a analisi strutturali e funzionali successive (Figura 2B).

L'ottimizzazione e la caratterizzazione biofisica delle TMEM120 M207A contrassegnate con FLAG sono riassunte nella Figura 2. L'espressione e la purificazione sono state confermate dalla SDS-PAGE, che ha mostrato una singola banda a circa 50 kDa. La migrazione osservata era leggermente superiore al peso molecolare atteso della forma monomerica (Figura 2A), probabilmente dovuta al campione non bollito prima dell'elettroforesi. Il cromatogramma SEC mostrava un singolo picco simmetrico di eluzione a un volume corrispondente a una massa molecolare apparente di circa 150 kDa nello 0,00015% (w/v) LMNG (Figura 2B), coerente con il dimero TMEM120A M207A nelle micelle detergenti LMNG. Questo comportamento eluzionale presenta una popolazione proteica omogenea e monodispersa, rendendola adatta alla caratterizzazione biofisica a valle.

Le proprietà delle micelle detergenti della LMNG nelle condizioni sperimentali di tamponamento sono state analizzate tramite fotometria di massa. Le misurazioni sono state effettuate in un tamponamento SEC con concentrazioni variabili di LMNG in assenza di proteine per valutare il contributo delle micelle detergenti alla massa molecolare trasparente. Allo 0,001% (w/v) LMNG, una concentrazione superiore alla concentrazione critica di micelle (CMC), il picco predominante è stato rilevato a circa 69 kDa, corrispondente solo alle micelle LMNG senza alcuna proteina associata (Figura 4A). Quando la concentrazione LMNG è stata ridotta allo 0,0001% (p/v), al di sotto della CMC, la specie principale si è spostata a ~48 kDa, indicando la presenza di aggregati residui LMNG più piccoli o assemblaggi submicellari senza proteina (Figura 4B). Più avanti (Figura 4C), TMEM120A M207A è stato diluito in un buffer SEC contenente diverse concentrazioni di LMNG per valutare il suo stato oligomerico tramite fotometria di massa. A 0,00001% LMNG (~20 volte sotto la CMC, magenta), è stato osservato un picco predominante di circa 42 kDa, corrispondente al monomero di TMEM120A M207A. A 0,00015% LMNG (~10 volte sotto la CMC, blu), la popolazione principale a ~86 kDa indicava la presenza di dimeri. Aumentando la concentrazione LMNG allo 0,001% (~2 volte sopra la CMC, arancione) si è prodotto una specie principale ~150 kDa, coerente con i complessi proteina-detersivi. Allo 0,002% LMNG (~4 volte sopra il CMC, verde), è stata rilevata una distribuzione ampia intorno a 180 kDa, che rappresenta assemblaggi più grandi associati alla micella o oligomeri di ordine superiore. Questi risultati dimostrano che la concentrazione LMNG all'interno del tamponamento SEC influenza fortemente lo stato oligomerico chiaro di TMEM120A M207A, con un equilibrio monomero-dimero osservato sotto la CMC e la formazione del complesso detergente-proteina predominante sopra la CMC.

La stabilità termodinamica di TMEM120A M207A raccolta dal picco principale della SEC e mantenuta nel tampone SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG, pH 7,8) è stata valutata tramite analisi di denaturazione termica. La proteina presentava un punto di flessione a circa 46 °C, corrispondente alla sua temperatura di fusione (T_m) in queste condizioni solubili in detersivo. Questo valore T_m indica una stabilità termica moderata, suggerendo che TMEM120A M207A mantiene una conformazione correttamente piegata all'interno delle micelle LMNG ma può iniziare a dispiegarsi o aggregarsi a temperature più elevate.

L'interferometria di biostrato (BLI) mostra affinità di legame μM di TMEM120A M207A a GsMTx4T. Le tracce in Figura 5 illustrano cinque passaggi sperimentali: (1) base, (2) carico TMEM120A campioni di M207A, (3) rimozione di legame aspecifico e eccesso di TMEM120A M207A, (4) associazione e (5) dissociazione. Lo spostamento della lunghezza d'onda (nm) viene tracciato nel tempo per concentrazioni crescenti di GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 e 100 μM) che interagiscono con TMEM120A M207A immobilizzata.

Durante la linea di base iniziale (step 1), il segnale rimaneva stabile, confermando l'equilibrio del sensore nel buffer. TMEM120A carico M207A (passo 2) ha prodotto un aumento caratteristico del segnale, corrispondente a ~50-80% di saturazione della sonda tra i sensori. La fase di carico ha mostrato una risposta leggermente curva piuttosto che un altopiano netto, probabilmente riflettendo una limitazione parziale del trasporto di massa, dove TMEM120A diffusione di M207A verso la superficie del sensore è più lenta della velocità di legame — un effetto comune per proteine solubilizzate in membrana o detergente che può influenzare la copertura apparente della superficie.

Il successivo passo di base (passo 3) rimuoveva di fatto TMEM120A M207A non legato o attaccato in modo debolle. Durante la fase di associazione (passo 4), l'aumento delle concentrazioni di GsMTx4 ha portato a chiari aumenti dello spostamento della lunghezza d'onda dipendente dalla concentrazione. Durante la dissociazione (passo 5), il biosensore è stato posizionato in un buffer SEC contenente LMNG a ~10 volte sotto il CMC. I primi 5-10 secondi di dissociazione hanno mostrato una rapida diminuzione del segnale, probabilmente rappresentando un rapido rilascio di GsMTx4 da siti facilmente accessibili, seguito da un decadimento più lento che potrebbe riflettere complessi M207A-GsMTx4 più stabili TMEM120A con cinetiche di dissociazione lente. I segnali della sonda di riferimento sono rimasti piatti per tutto l'esperimento, indicando un legame non specifico minimo. Nel complesso, questi dati dimostrano interazioni specifiche TMEM120A M207A-GsMTx4; tuttavia, la cinetica osservata deve essere interpretata con cautela a causa dell'ambiente del detersivo e dei potenziali effetti del trasporto di massa.

I sensorgrammi di associazione e dissociazione dei dati processati dopo la sottrazione della sonda di riferimento (Figura 6A) hanno mostrato risposte dipendenti dalla concentrazione per GsMTx4 nell'intervallo di 5-100 μM. L'aumento delle concentrazioni di liganti ha prodotto spostamenti progressivamente maggiori della lunghezza d'onda, seguiti da una diminuzione graduale e lenta durante la fase di dissociazione di 200 s. Il dataset da 10 μM è stato escluso dall'adattamento a causa della sovrapposizione con la traccia di 5 μM, il che ha migliorato la qualità complessiva del modello.

L'analisi cinetica è stata effettuata utilizzando un modello associazione-dissociazione di Langmuir 1:1 con una strategia locale di fitting completo, in cui le concentrazioni individuali degli analiti sono state inserite indipendentemente all'interno di un quadro cinetico condiviso (Figura 6B). Le curve adattate (rosso) erano in buon accordo con le tracce sperimentali, fornendo una costante di dissociazione stimata (K_D) nell'intervallo micromolare basso. L'analisi residua (Figura 6C) non ha rivelato deviazioni sistematiche maggiori, indicando che il modello applicato era appropriato per il dataset. Differenze minori osservate durante la fase iniziale di associazione possono riflettere limitazioni nel trasporto di massa o gli effetti dell'ambiente delle micelle detergenti. Esempi aggiuntivi di curve di associazione e dissociazione adattate, grafici residui e statistiche di adattamento tra repliche multiple del saggio e posizioni delle sonde sono mostrati nella Figura Supplementare S8.

Nei dati grezzi (Figura 5), i primi 5-10 secondi di dissociazione hanno mostrato una rapida diminuzione del segnale, probabilmente rappresentando il rapido rilascio di GsMTx4 da siti facilmente accessibili, seguito da un decadimento più lento che potrebbe riflettere complessi M207A-GsMTx4 più stabili TMEM120A con cinetiche di dissociazione lenta. Pertanto, nella Tabella 2, i primi 100 secondi di dissociazione sono stati rimossi dall'adattamento. L'assenza di deviazione sistematica indica un buon adattamento del modello locale di Langmuir full-fitting 1:1 per TMEM120A M207A a tutte le concentrazioni testate (Figura 7).

L'analisi cinetica del legame di GsMTx4 a TMEM120A M207A ha rivelato comportamenti di associazione e dissociazione dipendenti dalla concentrazione nell'intervallo di 5-100 μM dei liganti (Tabella 1). Le costanti di tasso di associazione osservate (k_on) sono aumentate modestamente con l'aumento della concentrazione di GsMTx4, variando da circa 1,0 × 10⁻⁶ a 3,2 × ^10-6 1/M·s, mentre le costanti stimate del tasso di dissociazione (k_off) sono rimaste vicine a zero all'interno dell'errore sperimentale, suggerendo una fase di dissociazione lenta o trascurabile nelle condizioni testate. Le costanti di dissociazione di equilibrio calcolate (K_d) si trovavano nell'intervallo micromolare basso-medio (~0,8-3,3 μM), coerenti con un'interazione di affinità moderata. Il Local Full fitting utilizzando un modello di legame Langmuir 1:1 ha prodotto adattamenti di alta qualità su tutte le concentrazioni di GsMTx4, con coefficienti di correlazione superiori a 0,99 e valori relativi bassi di χ² sia per la fase di associazione che per quella di dissociazione (Tabella 1). Le costanti di dissociazione di equilibrio calcolate sono state coerenti tra concentrazioni e replicazioni, con valori di K_D nell'intervallo micromolare basso (~1-2 μM), indicando un legame moderato ma specifico tra TMEM120A M207A e GsMTx4.

I dataset replicati a ciascuna concentrazione hanno mostrato riproducibilità, come indicato da alti coefficienti di correlazione (R² > 0,99) sia per gli adattamenti di associazione che per quelli di dissociazione. I valori di χ² pieni e relativi erano bassi e comparabili tra repliche, supportando ulteriormente la robustezza del modello di legame di Langmuir 1:1 applicato nell'analisi. A concentrazioni di ligando più elevate (≥50 μM), sono stati osservati lievi aumenti di valori di k_on e K_D , che possono riflettere piccoli effetti di trasporto di massa o eterogeneità superficiale locale piuttosto che veri cambiamenti di affinità. La consistenza cinetica tra repliche multiple e posizioni delle sonde è ulteriormente illustrata nella Figura Supplementare S9.

I profili cinetici dimostrano che GsMTx4 interagisce in modo specifico e stabile con TMEM120A M207A, formando complessi relativamente stabili caratterizzati da dissociazione lenta e affinità di legame micromolare.

Figura 1: Flusso di lavoro di purificazione di TMEM120A mutante M207A espresso nelle celle di sospensione HEK293SF-17. Panoramica schematica della procedura di purificazione proteica. TMEM120A M207A è stato estratto da plasmidi pCDNA3.1 in cellule HEK293SF-17. Le cellule sono state solubilizzate nello 0,5% di LMNG, seguite da una purificazione di affinità con resina anti-FLAG M2. La resina è stata lavata con un tampone contenente 0,01% LMNG per rimuovere proteine non specificamente legate. TMEM120A M207A è stato eluzionato in un tampone contenente lo 0,001% di LMNG. L'eluato è stato concentrato utilizzando filtri di taglio da 100 kDa o 30 kDa e ulteriormente purificato tramite cromatografia a esclusione di dimensione in un tampone contenente 0,00015% LMNG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Cromatografia a esclusione di dimensione e SDS PAGE di TMEM120A purificata M207A Nel detersivo LMNG (A) SDS-PAGE del TMEM120A M207A con marchio FLAG purificato tramite cromatografia a esclusione di dimensioni. La banda proteica appare a ~50 kDa nella corsia 1, corrispondente al monomero atteso. (B) Profilo SEC di TMEM120A purificata M207A su una colonna SEC nel buffer SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG, pH 7,8). L'eluzione proteica indica una specie monodispersa predominante adatta per saghi biofisici a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Fluorimetria differenziale a scansione di TMEM120A purificata M207A in LMNG. La DSF rivela un punto di flessione termodinamico a 46 °C, indicando la stabilità termica della proteina nelle condizioni di tampone testate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: caratterizzazione del TMEM120A purificato M207A in detersivo LMNG utilizzando la tecnica di fotometria di massa. (A,B) Fotometria di massa del buffer SEC con concentrazioni variabili di LMNG. Allo 0,001% LMNG (sopra la concentrazione critica di micelle, CMC), il peso molecolare apparente è di ~69 kDa, corrispondente principalmente alle micelle LMNG. A 0,0001% LMNG (dieci volte sotto la CMC), il picco appare a ~48 kDa. (C) Analisi di fotometria di massa degli effetti dipendenti dalla concentrazione di LMNG sull'oligomerizzazione TMEM120A. TMEM120A nello 0,00001% LMNG (~20 volte sotto il CMC, magenta) mostra una popolazione principale di circa 42 kDa (monomero). Nello 0,00015% LMNG (~10 volte sotto CMC, blu), si osserva una popolazione a ~86 kDa, coerente con il dimero. Nello 0,001% LMNG (~2 volte sopra CMC, arancione), una specie principale a ~150 kDa corrisponde a complessi proteina-detergente. Nello 0,002% LMNG (~4 volte sopra CMC, verde), una distribuzione ampia centrata a ~180 kDa indica assemblaggi associati alla micella più grandi o oligomeri di ordine superiore. Questi risultati dimostrano che la concentrazione di LMNG influenza fortemente lo stato oligomerico apparente della TMEM120A, con un equilibrio monomero-dimero osservato sotto la CMC e la formazione del complesso proteico-detersivo prevalente sopra la CMC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Dati grezzi dal software che mostrano TMEM120A interazioni M207A-GsMTx4. L'interferometria dei biostrati dimostra che TMEM120A (M207A) si lega all'inibitore dei canali meccanosensibili GsMTx4 con affinità micromolare. La figura mostra i dati grezzi di risposta BLI ottenuti dal software Gator Prime, delineando le cinque fasi chiave del saggio: (1) Base iniziale, durante la quale il segnale è rimasto stabile; (2) Immobilizzazione proteica (carico), che comporta un aumento di circa 1,5 nm dello spostamento della lunghezza d'onda; (3) Seconda linea di base, che consente la rimozione di proteine non legate o debolmente associate; (4) Fase di associazione (legame di ligando), in cui l'aumento delle concentrazioni di GsMTx4 produceva un aumento della risposta fino a ~5,5 nm entro 300 s; e (5) fase di dissociazione (rilascio di ligando), che mostra un decadimento graduale del segnale per oltre 600 s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Cinetica di legame di TMEM120A M207A con il peptide GsMTx4. (A) Sensorgrammi di associazione e dissociazione di TMEM120A M207A che interagiscono con GsMTx4 a cinque concentrazioni: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM e 100 μM. Il dataset da 10 μM è stato escluso dall'adattamento a causa della sovrapposizione con la curva a 5 μM, migliorando così l'adattamento complessivo del modello. Le linee rosse tratteggiate verticali indicano l'inizio e la fine della fase di dissociazione. (B) L'adattamento dei sensorgrammi è stato eseguito utilizzando un modello di associazione-dissociazione 1:1 di Langmuir Local Full fitting. Le curve rosse rappresentano il modello adattato, mentre le tracce sperimentali corrispondono ai dati misurati di associazione e dissociazione per ogni concentrazione di GsMTx4 (due repliche per condizione). (C) Grafici residui che mostrano la deviazione tra i dati sperimentali e il modello adatto sia per le fasi di associazione che di dissociazione, confermando la bontà dell'adattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Grafici residui corrispondenti alle curve di legatura adattate mostrate. Ogni grafico rappresenta i residui (differenza tra i dati sperimentali e il modello adattato) per una singola concentrazione di GsMTx4: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM e 100 μM. I residui sono visualizzati come deviazione di spostamento (nm) rispetto al tempo (s), mostrando una distribuzione casuale attorno a zero sia nelle fasi di associazione che di dissociazione. L'assenza di deviazione sistematica indica un buon adattamento del modello Langmuir Local Full Fitting 1:1 per TMEM120A M207A a tutte le concentrazioni testate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Riepilogo dei parametri cinetici per TMEM120A legame di M207A a GsMTx4. I parametri cinetici sono stati ottenuti tramite il Local Full fitting utilizzando un modello di legame Langmuir 1:1. Sono riportate costanti di associazione (k_on), dissociazione (k_off), costanti di velocità osservate (k_obs) e costanti di dissociazione in equilibrio (K_D) per ogni concentrazione di GsMTx4 e replicate. La qualità dell'adattamento è stata valutata utilizzando valori di R² e χ² per le fasi di piena, associazione e dissociazione. In tutte le concentrazioni, gli adattamenti hanno mostrato alti coefficienti di correlazione (R² > 0,99) e bassi valori relativi di χ², indicando prestazioni affidabili del modello. Note: M Conc. indica la concentrazione di GsMTx4 (μM). k_obs rappresenta la costante di velocità osservata che riflette i processi combinati di associazione e dissociazione. Gli errori segnalati per k_obs, k_on e k_off riflettono incertezza di adattamento. I valori R² indicano la bontà dell'adattamento per le fasi di pienezza, associazione e dissociazione. I valori relativi di χ² rappresentano metriche di adattamento normalizzate, mentre i valori assoluti di χ² indicano una deviazione residua tra dati osservati e adattati. Abbreviazioni: k_on = costante di tasso di associazione (1/M·s); k_off, = costante di tasso di dissociazione (1/s); k_obs = costante di velocità osservata (1/s); K_D = costante di dissociazione di equilibrio; R_max = risposta massima; R_{equalizzazione} = risposta di equilibrio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Parametri di elaborazione e residui dell'adattamento cinetico. Parametri di elaborazione: inizio associazione, 0 s; fine associazione, 300 s; inizio dissociazione, 100 s; fine dissociazione, 300 s. Valore minimo R², 0,9; valore massimo χ², 8. Passo di allineamento: fine di un solo passo (indice = 1, media = 0). La correzione tra i passi è stata applicata durante la fase di associazione. media associazione, 50; Media: dissociazione, 0. Il levigamento Savitzky-Golay è stato disabilitato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: Esperimento di ottimizzazione per il caricamento di diverse concentrazioni di TMEM120A proteina M207A su sonde anti-FLAG con una concentrazione fissa (100 nM) del peptide GsMTx4. (A) sensorgrammi BLI grezzi che mostrano i cinque passaggi della misurazione cinetica: (1) base nel tampone SEC o nel tampone di analisi (25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (c/v) LMNG; 0,0005% (v/v) Tween-20); (2) caricamento di quattro diverse concentrazioni di TMEM120A M207A sulla sonda FLAG, con la sonda di riferimento (arancione) utilizzata come controllo negativo per confermare l'assenza di legame aspecifico; (3) al secondo passo di base; (4) la fase di associazione, e (5) la fase di dissociazione. (B) Il modello di legame globale 1:1 si adatta alle quattro concentrazioni di M207A di TMEM120A che interagiscono con il peptide GsMTx4 di 100 nM. (C) Grafici residui sia per la fase di associazione che per quella di dissociazione, mostrando deviazioni minime dal modello adatto (<0,05 nm). Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S2: Configurazione della lastra e configurazione del saggio. (A) Progettazione della piastra per una piastra a 384 pozzi, dove possono essere assegnati diversi parametri. I campioni corrispondono al ligando (GsMTx4) a diverse concentrazioni. I pozzi arancioni indicano TMEM120 proteina M207A a 250 nM. I pozzi rappresentano replicazioni proteiche a 250 nM, e lo stesso buffer è stato utilizzato per le fasi di baseline, associazione e dissociazione. (B) Vista della placca massima che mostra quattro sonde biosensori anti-FLAG: una sonda di riferimento e tre sonde per repliche proteiche. Tutte le sonde sono state pre-bagnate nel tampone di saggio, rigenerate nel tampone Q e neutralizzate nel tampone di saggio. Lo stesso buffer è stato utilizzato durante tutte le fasi di baseline, associazione e dissociazione. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S3: cicli di impostazione del saggio, inclusi basali, carico proteico, seconda base, associazione e dissociazione. Abbreviazioni: B = buffer; L = carico; 0, 5, 10, 20, 30, 50 e 100 = concentrazioni di GsMTx4 in μM. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S4: Nuovo flusso di lavoro di analisi cinetica (K). Seleziona l'icona Esperimento , che fornisce una panoramica di tutti i test eseguiti all'interno di un singolo esperimento. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S5: Nuovo flusso di lavoro di analisi cinetica (K).Icona Align e Filter , dove i dati grezzi sia per le fasi di associazione che per quella di dissociazione possono essere riesaminati e analizzati. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S6: Nuovo flusso di lavoro di analisi cinetica (K).Imposta l'icona di riferimento , usata per selezionare il sensore di riferimento appropriato per la sottrazione di sfondo e l'interpretazione accurata dei dati. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S7: Fasi di adattamento del binding nel flusso di lavoro di analisi cinetica. Impostazioni dei parametri di adattamento cinetico utilizzate per l'analisi dei dati di interazione del legaggio. Il modello assume un'interazione 1:1 con un singolo sito di legame del ligando. Il tipo di adattamento è impostato su Locale, adattando ogni curva di concentrazione indipendentemente piuttosto che globalmente. L'opzione Full Fitting con Full Stitch abilitata include l'intera curva di associazione continua e dissociazione. Le finestre temporali per le fasi di associazione e dissociazione sono stabilite da 0 a 300 s e da 0 a 200 s, rispettivamente. In background, il binding fitting graph, il residuo grafico e le singole curve di saggio illustrano la qualità dell'adattamento e la variabilità sperimentale. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S8: Passaggi di adattamento del binding nel flusso di lavoro di analisi cinetica. Grafo di adattamento del legame che mostra le fasi di associazione e dissociazione tra più repliche del saggio e posizioni delle sonde (C1 e D1). Il grafico residuo qui sotto valuta la qualità dell'adattamento, con i residui che indicano differenze tra i dati sperimentali e il modello adattato; valori vicini a zero riflettono una buona compatibilità. La tabella allegata riassume le statistiche di adattamento, inclusi valori di R² pieno, R² di associazione, R² di dissociazione e Chi-quadrato (X²) per ciascuna replica. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare S9: Passaggi di adattamento del lego nel flusso di lavoro dell'analisi cinetica. Analisi cinetica delle interazioni di legame da repliche multiple e posizioni delle sonde (C1 e D1). Lo spostamento della risposta del sensore (nm) nel tempo(s) mostra le fasi di associazione e dissociazione, con ogni curva codificata a colori in base al test e alla posizione della sonda. La linea rossa a tratteggiamenti verticale segna la transizione tra le fasi di associazione (0-300 s) e di dissociazione. Di seguito, la tabella riporta i parametri cinetici derivati dall'adattamento 1:1 del modello di legame, inclusi la concentrazione dell'analita (M Conc.), la costante di tasso di associazione (k_on), la costante di tasso di dissociazione (k_off), gli errori e la costante di dissociazione di equilibrio (K_D). La qualità costante della calzata supporta la robustezza delle misurazioni cinetiche. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare S1: Tabella che illustra i simboli usati sia nella piastra a 384 pozzi che nella piastra Max. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare S2: Parametri cinetici ottenuti per le quattro concentrazioni di TMEM120A M207A caricati su biosensori FLAG che interagiscono con peptide GsMTx4 a 100 nM, utilizzando valori fissi di kon e koff. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Caratterizzare le interazioni tra membrane e proteine rimane una sfida a causa della necessità di una purificazione proteica meticolosa, un'attenta ottimizzazione della concentrazione del detersivo e una progettazione precisa del saggio. Questo studio presenta un flusso di lavoro dettagliato per TMEM120A M207A, illustrando sia la purificazione che l'analisi cinetica utilizzando GsMTx4 con interferometria biostrato (BLI).

Passaggi critici e ottimizzazione:
Uno dei passaggi critici importanti è stata la concentrazione di detersivo, identificata come un fattore determinante importante per la stabilità delle proteine. Il processo di purificazione prevedeva la solubilizzazione cellulare con un tampone contenente 0,5% LMNG, seguita da lavaggio sequenziale con LMNG 0,005%, eluzione con LMNG 0,001% e cromatografia finale per esclusione di dimensione (SEC) in un tampone contenente 0,00015% LMNG. Questa strategia di detersivo, basata sulla bassa concentrazione critica di micelle (CMC) e sul tasso di rallentamento della LMNG, ha fornito una maggiore stabilità della proteina nelle micelle durante la purificazione. Il tampone SEC conteneva detersivo a una concentrazione dieci volte inferiore al CMC di LMNG (0,001%), minimizzandone efficacemente l'impatto sugli saghi biofisici a valle. L'omogeneità proteica e l'assenza di aggregazione sono state confermate tramite spettrometria di massa e analisi della stabilità termica. La Figura 2, la Figura 3 e la Figura 4 illustrano l'ottimizzazione di successo della purificazione e della stabilizzazione proteica nelle concentrazioni di detersivi sub-CMC.

L'immobilizzazione proteica sul biosensore è stata attentamente controllata per raggiungere una saturazione della sonda del 50-80%. Un livello di carico del 50-80% può introdurre un certo grado di limitazione del trasporto di massa; tuttavia, questa gamma è stata scelta per fornire una potenza di segnale adeguata nel sistema BLI, dove le sonde si spostavano tra i pozzi durante il saggio. Raggiungere questo livello di immobilizzazione dei liganti ha aiutato a mantenere una qualità del segnale costante, anche se tali livelli di carico presentano sia vantaggi che potenziali limitazioni. Includere una sonda di riferimento era fondamentale per gli esperimenti BLI.

Un ulteriore esperimento di controllo in cui sono stati testati quattro diversi livelli di TMEM120A immobilizzati con una singola concentrazione peptidica (100 nM). Questi dati sono ora inclusi nel manoscritto rivisto (Figura Supplementare S1). L'aumento della quantità di proteina immobilizzata ha prodotto segnali di carico più elevati, ma in tutti i casi lo spostamento è rimasto sotto 1 nm rispetto alla linea di base (Figura Supplementare S1A). Abbiamo riportato le curve di associazione e dissociazione adattate utilizzando un modello globale di legame 1:1, e abbiamo incluso anche i grafici residui, che mostrano piccole differenze non significative tra i dati adattati e quelli sperimentali.

Nei principali saghi cinetici (analita 5-100 μM), le costanti di velocità adattate mostravano le tendenze attese dipendenti dalla concentrazione. I valori_{di k off} variavano da circa 1,48 × 10⁻⁴ a 1,43× 10⁻³ s⁻¹, mentre i valori k variavano da 1,12 × 10² a 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. Questi cambiamenti graduali attraverso la serie di concentrazione sono coerenti con l'associazione normale dipendente dall'analita e con il comportamento dissociativo.

Nell'esperimento di controllo, in cui sono stati testati diversi livelli di carico della sonda a una singola concentrazione di analita (100 nM), tutte e quattro le tracce hanno prodotto costanti cinetiche molto simili. I valori di k_off erano costantemente 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, e i valori_{k on} erano costantemente 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ su tutti i livelli di carico. Questa mancanza di variazione suggerisce che né le fasi di associazione né quelle di dissociazione siano state influenzate dalla densità della sonda, dalle limitazioni del trasporto di massa o dal rilego degli analiti.

Si prevede inoltre che la dissociazione a 100 nM appaia più veloce nell'esperimento di controllo. La concentrazione di analiti di 100 nM è circa un ordine di grandezza inferiore a K_D, e a concentrazioni ben al di sotto di K_D il complesso è meno stabile e l'occupazione effettiva è bassa. In tali condizioni, la dissociazione procede più rapidamente perché l'affinità di legame è più debole a basse concentrazioni di analiti, e la riassociazione durante la fase di dissociazione è minima. Questo comportamento è in linea con ciò che si osserva tipicamente quando la concentrazione dell'analita è sostanzialmente inferiore a K_D.

Preso insieme, la coerenza dei parametri cinetici attraverso i carichi delle sonde e il comportamento atteso a basse concentrazioni di analiti supportano l'idea che le costanti di velocità osservate riflettano reali proprietà di legame piuttosto che artefatti derivanti da effetti di carico superficiale o trasporto di massa.

Cinetica e interpretazione del legame:
L'analisi cinetica è stata effettuata utilizzando un modello associazione-dissociazione di Langmuir 1:1 con una strategia locale di fitting completo, in cui le concentrazioni individuali degli analiti sono state inserite indipendentemente all'interno di un quadro cinetico condiviso (Figura 6B). Questo approccio è stato scelto rispetto al tradizionale fitting globale perché alcuni dataset, in particolare a concentrazioni più basse di ligando, mostravano piccole sovrapposizioni o deviazioni nelle prime fasi probabilmente causate da limitazioni del trasporto di massa e dagli effetti delle micelle del detergente sulla diffusione proteica. Il fitting globale presuppone che tutte le tracce seguano rigorosamente lo stesso comportamento cinetico, che può essere compromesso quando l'accessibilità superficiale o il microambiente locale differiscono leggermente tra le concentrazioni. Il fitting completo locale ha permesso di modellare ogni concentrazione di analita indipendentemente mantenendo comunque un quadro cinetico coerente, assicurando che i parametri derivati riflettessero accuratamente il comportamento a ciascuna concentrazione. Le curve adattate (rosso) corrispondevano strettamente alle tracce sperimentali, fornendo una costante di dissociazione stimata (K_D) nell'intervallo micromolare basso. L'analisi residua (Figura 6C) non ha rivelato deviazioni sistematiche maggiori, a supporto dell'idoneità del modello per queste interazioni proteiche di membrana solubilizzate in detergente.

TMEM120A M207A e GsMTx4 hanno mostrato valori di K_D nell'intervallo micromolare basso (∼0,8-3,3 μM). Il tasso di associazione (k_on) è aumentato modestamente con la concentrazione di ligandi, mentre il tasso di dissociazione (k_off) è rimasto molto lento, indicando la formazione stabile di complessi. Il decadimento rapido iniziale del segnale durante i primi 5-10 secondi di dissociazione probabilmente rifletteva siti di legame facilmente accessibili, mentre la fase più lenta rappresentava interazioni più stabili (Figura 6A). Queste osservazioni evidenziano l'importanza di selezionare con attenzione le finestre di dissociazione e di considerare le limitazioni del trasporto di massa nell'analisi delle proteine di membrana solubilizzate in detersivo (Tabella 2).

Limitazioni e risoluzione dei problemi:
Devono essere considerate diverse limitazioni per le proteine di membrana solubilizzate in detersivo come TMEM120A M207A. Gli effetti del trasporto di massa possono verificarsi durante la fase iniziale di associazione, poiché la proteina può diffondere lentamente verso la superficie del biosensore, il che può distorcere leggermente le misurazioni cinetiche. Il sovraccarico dei sensori è possibile se la saturazione della sonda supera il range raccomandato del 50-80%, limitando potenzialmente l'accuratezza dell'analisi cinetica globale e influenzando i valori di kon e koff. Gli effetti dipendenti dal detersivo possono influenzare la stabilità delle proteine, lo stato oligomerico o l'accessibilità superficiale, specialmente a concentrazioni superiori o vicine alla CMC. Fattori aggiuntivi includono una deriva di base minore, legame aspecifico e difficoltà nel catturare la cinetica di una dissociazione molto lenta.

Molti di questi problemi possono essere mitigati con semplici aggiustamenti: ridurre il carico proteico per evitare la sovrasaturazione, ottimizzare la composizione del buffer e includere sonde di riferimento per correggere la deriva di base o segnali non specifici. In questo studio, il tampone SEC contenente 0,00015% LMNG e basse concentrazioni di Tween-20 ha efficacemente minimizzato il legame aspecifico mantenendo la stabilità proteica. Selezionare con cura la finestra di dissociazione per l'adattamento cinetico, insieme alle misurazioni di replicazione e all'analisi dei residui, è stato importante anche per confermare l'affidabilità dei parametri cinetici. Queste strategie generalmente aumentano la riproducibilità e aiutano a generare dati più robusti e interpretabili. Al posto del fitting globale è stato impiegato un fitting completo locale per tenere conto delle piccole differenze tra tracce a singole concentrazioni di ligando, assicurando che i parametri cinetici riflettessero accuratamente il comportamento di ciascun dataset.

BLI e altre tecniche biofisiche:
Rispetto alla risonanza plasmonica superficiale (SPR) e alla calorimetria da titolazione isotermica (ITC), l'interferometria biostrato (BLI) offre diversi vantaggi pratici per analizzare le interazioni proteina-ligando di membrana. Come SPR e ITC, BLI può fornire informazioni dettagliate sulle interazioni di legame, inclusi tassi di associazione (k_on), tassi di dissociazione (k_off) e costanti di dissociazione di equilibrio (K_D), senza richiedere sistemi microfluidici complessi o un'alta concentrazione^{proteica 14}. Il formato open-well, dip-and-read, consente uno scambio rapido di buffer e l'elaborazione parallela di più campioni, supportando una maggiore produttività sperimentale. A differenza dell'ITC, che richiede grandi quantità di proteine altamente pure e fornisce dati termodinamici, il BLI può misurare sia i tassi di formazione del complesso che la dissociazione da concentrazioni minime di campioni nei nanomolari. BLI è anche compatibile con buffer contenenti detersivi o lipidi, rendendolo adatto per proteine di membrana a basso rendimento o instabili che sono difficili da studiare con altri metodi biofisici. Nonostante questi vantaggi, tecniche complementari come SPR o ITC rimangono utili per confermare la consistenza termodinamica e per verificare incrociati i parametri di legame in condizioni prive di detergente e in condizioni di detergente, ma richiedono un'alta concentrazione^{proteica 3}.

Direzioni future:
Questo flusso di lavoro può essere esteso allo studio di altre proteine di membrana, delle interazioni proteina-lipidi o allo screening di modulatori a piccole molecole. Combinare BLI con approcci ortogonali come la fotometria di massa, la caratterizzazione strutturale o la crio-EM potrebbe fornire approfondimenti più dettagliati su oligomerizzazione, stechiometria e meccanismi di legame. Ulteriori ottimizzazioni potrebbero anche consentire l'analisi di liganti ad alta affinità, interazioni multivalenti o complessi in ambienti lipidici più nativi.

In conclusione, un attento controllo dell'immobilizzazione proteica, della concentrazione di detergente e delle condizioni del tampone consente al BLI di generare dati cinetici affidabili e riproducibili per TMEM120A M207A e proteine di membrana simili e difficili. Sebbene esistano limitazioni intrinseche, il metodo fornisce una piattaforma solida per studiare specifiche interazioni proteina-ligando di affinità moderata in condizioni sperimentali ben definite.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
384-well black microplate	Greiner Bio-One	781906	BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO	Sigma-Aldrich	UFC903008	Purification
Anti-FLAG probe	Gator Bio	160036	BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-10ML	Purification
BioRender	BioRender	https://biorender.com	Figure 1 creation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Mass photometry
CD 293 Medium (1x)	Thermofisher	11913019	Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High Performance	Eppendorf	NA	Purification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Merck	11836170001	Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	9003-98-9	Purification
ExpiFectamine 293 Transfection Kit	Thermofisher	A14524	Transfection
Gator Bio software	Gator Bio	NA	BLI
Gator Plus	Gator Bio	NA	BLI
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061	Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetate	Sigma-Aldrich	SML3140-1MG	BLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growth	ATCC	ATCC CRL11268	Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)	Thermofisher	A50940	Purification
Max Plate	Gator Bio	130062	BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	11359061001	Purification
Prometheus High Sensitivity Capillaries	Nano Temper	PR-C006	Thermodynamic stability
Prometheus Panta	Nano Temper	NA	Thermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)	Gator Bio	120010	BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell Disrupter	Qsonica	NA	Purification
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	GE28-9909-44	Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-Linker	GenScript Biotech	NA	Plasmid
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379-25ML	BLI
Two MP	Refeyn	NA	Mass photometry