Articolo metodologico

Profilazione elettrofisiologica del veglio della corteccia prefrontale ventromediale in un modello murino di depressione e morbo di Parkinson

DOI:

10.3791/69366

⸱

30 dicembre 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

In questo articolo

Sommario

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Utilizzando un modello murino simile al morbo di Parkinson (PD) che sovraesprime la forma mutante A53T della alfa-sinucleina umana (h-α-Syn) nel nucleo del rafe dorsale (DR), abbiamo sviluppato un metodo di registrazione elettrofisiologica per indagare il ruolo del circuito ventromediale della corteccia prefrontale (vmPFC)-DR nei disturbi depressivi/ansiosi nella DP.

Abstract

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Sebbene il morbo di Parkinson (PD) sia principalmente noto come disturbo motorio, i sintomi non motori spesso emergono prima dei deficit motori e influenzano significativamente la progressione della malattia, essendo cruciali in tutte le fasi della malattia. Tra questi, depressione e ansia sono i sintomi più diffusi e causano un carico sintomatario più elevato nelle donne rispetto agli uomini. Le alterazioni nel sistema serotoninergico (5-HT) sono frequentemente associate a disturbi dell'umore, e sono state osservate accumulazioni di α-sinucleina (α-Syn) nei nuclei 5-HT del rafe (RN) di pazienti con morbo di Parkinson (PD) e depressione. Comprendere i circuiti neurali alla base di questi sintomi non motori è quindi fondamentale.

Qui presentiamo un protocollo migliorato per indagare il ruolo del circuito della corteccia prefrontale ventromediale (vmPFC)-nucleo dorsale del rafe (DR) nei disturbi dell'umore associati alla PD, utilizzando un modello femminile di murino che sovraesprime la forma mutante A53T della α-syn (h-α-Syn) umana nella DR. Il nostro metodo consente una valutazione ad alta risoluzione dell'attività neuronale nelle cortecce infralimbiche (IL) e prelimbiche (PL) sia in condizioni basale sia durante il condizionamento avversivo e l'estinzione. Utilizzando un paradigma di condizionamento sensoriale tono-luce in topi svegli e con la testa fissa, impieghiamo sonde elettrofisiologiche multicanale per registrare le risposte neuronali. Gli esperimenti sono stati condotti in corridoi di realtà virtuale, combinando un tapis roulant cilindrico con un display visivo a doppio schermo per mantenere l'impegno comportamentale garantendo al contempo un controllo preciso degli stimoli sensoriali e la stabilità della registrazione.

Questo protocollo si basa sul coinvolgimento consolidato delle cortecce IL e PL nel condizionamento della paura e nell'estinzione e fornisce un quadro solido per esaminare l'attività neurale dinamica nei circuiti implicati in comportamenti depressivi e simili all'ansia nella DP. Consentendo misurazioni comportamentali ed elettrofisiologiche simultanee in condizioni controllate, questo approccio offre uno strumento potente per chiarire i meccanismi neurobiologici dei sintomi non motori nella DP e per testare potenziali interventi.

Introduzione

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Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo motorio, ma i sintomi non motori sono noti per precedere le manifestazioni motorie e sono critici in tutte le fasidella malattia 1, 2, 3 e 4. Tra questi, depressione e ansia sono i sintomi neuropsichiatrici più diffusi, che influenzano gravemente la qualità della vita dei pazienti con disturbo di Parkinson e causando un carico sintomatario maggiore sulle donne rispetto agliuomini 5. Nonostante ciò, spesso vengono sottodiagnosticati e trattati in modoinadeguato. 6. Per tutti questi motivi, è essenziale comprendere la neurobiologia e i circuiti coinvolti nei sintomi neuropsichiatrici della DP per stratificare i pazienti e offrire loro cure più personalizzate.

Sebbene l'eziologia della DP rimanga parzialmente incerta, sono state identificate diverse caratteristiche neuropatologiche chiave. La malattia è caratterizzata dalla progressiva degenerazione e perdita di neuroni e fibre dopaminergiche (DA) nel sistema nigrostriatale, portando ai deficit motori prototipici associati aPD 7,8. Un altro segno distintivo della PD è la presenza di corpi di Lewy (LB) e neuriti di Lewy — inclusioni intracellulari formate da aggregati proteici fibrillari — composti prevalentemente dalla proteina α-sinucleina (α-Syn)9,10. Gli studi di neuroimaging rivelano anche che altri sistemi neurotrasmettitori sono colpiti — anche prima del coinvolgimento della DA — tra cui, il sistema serotoninergico (5-HT) 11,12,13. I cambiamenti nel sistema serotoninergico (5-HT) sono comunemente associati a disturbi dell'umore, e depositi di α-sinucleina (α-Syn) sono stati rilevati nei nuclei rapo (RN) 5-HT di individui diagnosticati con morbo di Parkinson (PD) edepressione 14.

I nuclei dorsali del rafo (DR) sono il più grande nucleo 5-HT del RN15, svolgendo un ruolo fondamentale nella regolazione emotiva, percezione, ricompensa, aggressività e interazioni sociali. Di conseguenza, la disfunzione nella DR è associata a disturbi neuropsichiatrici come stress, ansia edepressione 15,16. A questo punto, è importante sottolineare la forte connessione funzionale e anatomica bidirezionale tra la DR e la corteccia prefrontale (PFC), una regione cerebrale essenziale per le funzioni cerebrali di ordine superiore. Mentre le regioni più dorsali della PFC sono correlate alle funzioni cognitive, le aree più ventromediali (vmPFC) svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione emotiva, nel controllo delle azioni, nella memoria e nel processodecisionale 17,18. Pertanto, la vmPFC e la DR insieme influenzano significativamente l'umore, e l'alterazione dell'attività in questo circuito è associata a sintomidepressivi 18. Inoltre, l'accumulo di forme aggregate di α-Syn nei neuroni 5-HT dell'RN ha dimostrato di indurre ansia e fenotipidepressivi 19,20,21.

Utilizzando un modello femminile murino con PD con un fenotipo depressivo che sovraesprime la forma mutante A53T della α-syn umana (h-α-Syn) in DR tramite un vettore virale adeno-associato (AAV), abbiamo sviluppato un metodo di registrazione elettrofisiologica. Questo metodo mira a indagare il ruolo del circuito vmPFC-DR nei disturbi depressivi/ansiosi nella DP. Questo approccio prevede la valutazione dell'attività neuronale delle cortecce infralimbiche (IL) e prelimbiche (PL) nei topi svegli tramite registrazioni di potenziali di campo singola e locali (LFP). Questo viene realizzato utilizzando una sonda multicanale in combinazione con un runner in realtà virtuale. Riconoscendo il coinvolgimento delle cortecce PL e IL nel condizionamento avversivo, misuriamo anche la loro attività durante tale paradigma per valutare la loro funzione in situazioni di stress. È fondamentale comprendere che il PL guida principalmente risposte condizionate, mentre la corteccia IL svolge un ruolo chiave nell'estinzione di questerisposte 22,23.

Il seguente protocollo descrive i passaggi per l'impianto di una barra frontale e la registrazione acuta dell'attività elettrica delle cortecce PL e IL in vivo. Lo otteniamo utilizzando un corridoio di realtà virtuale, che combina un tapis roulant cilindrico per mouse con la testa fissa con un display visivo a doppio schermo. Il protocollo è strutturato in quattro fasi principali: (1) chirurgia di impianto della barra della testa, (2) abituazione, (3) registrazione e acquisizione del segnale, e (4) analisi dei dati: ordinamento degli spike e pre-elaborazione dei dati.

Tre settimane dopo aver indotto la sovraespressione di h-α-Syn nel sistema 5-HT cerebrale, i topi si sottopongono all'intervento di impianto della barra della testa, che consente la successiva fissazione della testa. Dopo un periodo di recupero di 1 settimana, i topi si abituano per 4 giorni sia all'sperimentatore sia al tapis roulant e al sistema di fissazione della testa. Nel giorno di registrazione, questa configurazione viene utilizzata per registrare l'attività neurale delle cortecce PL e IL in condizioni di base e durante il condizionamento avversivo. I dati neurali grezzi vengono elaborati tramite ordinamento automatico degli spike con Kilosort4 seguito da una cura manuale in Phy2, al fine di estrarre cluster di unità singola di alta qualità per ulteriori analisi (Figura 1).

Il protocollo proposto di registrazione vmPFC multicanale sveglio e con testa fissa offre diversi vantaggi rispetto alle alternative classiche come preparati anestesiati o ex vivo e registrazioni wireless in animali in movimento libero. A differenza degli approcci anestetizzati o ex vivo, questo metodo consente la valutazione dell'attività vmPFC sotto stimolazione visiva e uditiva controllata all'interno di un ambiente di realtà virtuale, essenziale per implementare paradigmi di condizionamento avversivo24,25. A differenza delle registrazioni a movimento libero, la configurazione a testa fissa fornisce un controllo sperimentale preciso sugli input sensoriali e sulle contingenze del compito, riducendo così la variabilità e consentendo strutture di prova coerenti. Inoltre, la fissazione della testa riduce il rischio di disimpegno del compito osservato in paradigmi a libero movimento, in particolare sotto stimolazione avversiva, consentendo comunque registrazioni multicanale stabilie ad alta resa 26.

Da un punto di vista pratico, questo protocollo richiede che gli animali siano abituati alla fissazione della testa e alla corsa sul tapis roulant, ma beneficia di sistemi di fissazione della testa disponibili in commercio e relativamente accessibili che incorporano tapis roulant cilindrici. Questo rende l'approccio accessibile a laboratori più piccoli, poiché le sonde possono essere riutilizzate più volte (fino a ~10 inserimenti), riducendo notevolmente i costi rispetto agli impianti cronici a movimento libero. Di conseguenza, questo metodo fornisce un equilibrio tra controllo sperimentale, rilevanza comportamentale e costo-efficacia. Un altro fattore da considerare è l'implementazione del paradigma del condizionamento avversivo. In questo studio, abbiamo utilizzato un disegno sperimentale basato sull'avversione naturale dei roditori alla luce: 10 toni uditivi (stimoli condizionati) sono stati ciascuno seguiti da una breve esposizione a luce intensa (stimolo incondizionato). Sebbene questo schema sia meno stressante rispetto ad altri metodi classici di condizionamento, come quelli che coinvolgono scosse elettriche, costituisce uno stressore reale più simile.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti con controlli di età abbinati e le procedure sugli animali sono state progettate in linea con le regole dei 3R; condotta in conformità con le linee guida etiche stabilite nella Direttiva UE 2010/63 (22 settembre 2010), nella legislazione spagnola (RD 1201/2005, L.32/2007 e L.6/2013) e approvata dalla Generalitat Valenciana (ES462500001003; ref. 2023-VSC-PA-0073), e dal Comitato locale di Bioetica dell'Università di Valencia (ref. A20230214153605).

NOTA: Per garantire la sicurezza e prevenire contaminazioni, durante tutta la procedura, indossare dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti e stivaletti usa e getta, camice da laboratorio, mascherina e una rete per capelli. Utilizzare sistemi veterinari di ripresa dei farmaci per lo smaltimento dei residui derivanti dal loro utilizzo, in conformità con le normative locali e i programmi nazionali di ripresa applicabili.

1. Generazione di modelli di mouse

NOTA: Le femmine adulte di topi C57BL/6J (9 settimane) sono state alloggiate in condizioni ambientali controllate (22 ± 1 °C; ciclo luce/buio di 12 ore) con accesso ad libitum a cibo e acqua.

  1. Sotto anestesia isoflurana (4% per induzione, 2% per mantenimento) nella camera di anestesia del topo, assegnare casualmente i topi a ricevere microiniezioni stereotassiche nella DR (coordinate relative al bregma: anteroposteriore [AP] −4,5 mm, mediolaterale [ML] −1,0 mm, dorsoventrale [DV] −3,2 mm; angolo di iniezione: 20°) utilizzando un microiniettore automatico a una portata di 0,4 μL/min, come descrittoin precedenza, 19, 27, 28.
  2. Assicurarsi che ogni topo riceva un volume totale di 0,6 μL di un sierotipo virale adeno-associato ricombinante 1/2 (AAV1/2; concentrazione: 5,16 × 1012 gp/mL) che codifica la forma mutante A53T dell'h-α-Syn umano, per indurre la sovraespressione nei neuroni 5-HT della DR (n = 4) o di un vettore AAV1/2 vuoto contenente DNA STUFFER NON CODIFICANTE (AAV-EV), Utilizzato come gruppo di controllo (n=5).
  3. Per prevenire il reflusso, tieni l'ago fermo per altri 8 minuti prima di ritirarlo lentamente a una velocità di 320-400 μm/min.
    NOTA: Per sicurezza, assicurati che i sistemi di recupero funzionino correttamente per catturare i vapori anestetici prima di qualsiasi intervento stereotassico (sezioni 1 e 2). In caso di fuoriuscita di isoflurano mentre si riempie il vaporizzatore, puliscilo immediatamente usando un materiale inerte e assorbente, come la segatura. Utilizzare sistemi veterinari di ritiro dei farmaci per lo smaltimento dei filtri a isoflurano e di eventuali residui derivanti dal loro utilizzo, in conformità con le normative locali.

2. Chirurgia di impianto di testa-barra

NOTA: Esegui la chirurgia di impianto head-bar seguendo i passaggi riportati, 3 settimane dopo aver generato il modello del topo.

  1. Preparazione pre-chirurgica e anestesia
    1. Anestetizzare l'animale con isoflurano (4% per l'induzione, 1,5-2% per il mantenimento) somministrato tramite un vaporizzatore di isoflurano.
    2. Posiziona il mouse nell'apparecchiatura stereotassica su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante tutta la procedura.
    3. Apri delicatamente la bocca del topo per posizionare i denti sulla barra di morso e fissa la maschera collegata a un apparecchio stereotassico, per garantire una somministrazione continua di isoflurano per il mantenimento dell'anestesia.
    4. Applica colliri per prevenire ulcerazioni oculari.
    5. Somministrare analgesia almeno 10 minuti prima dell'incisione del bisturi tramite iniezione sottocutanea di butorfanolo (5 mg/kg in soluzione salina).
    6. Applicare lidocaina regionale (0,03 mL per orecchio, 4 mg/kg, non superare le dosi massime di 7 mg/kg oppure la crema di lidocaina/prilocaina [25 mg/g di lidocaina e 25 mg/g di prilocaina]) sull'orecchio interno per ridurre il disagio dovuto alle barre per le orecchie.
  2. Posizionamento stereotassico e preparazione del cranio
    1. Posiziona le cuffie per tenere saldamente la testa, garantendo simmetria e il minimo movimento.
    2. Regola la barra incisiva per portare bregma e lambda allo stesso livello orizzontale, assicurandoti che siano sulla linea mediana.
    3. Confermare l'induzione dell'anestesia controllando la perdita di prelievo del pedale, riflessi palpebrici, diminuzione della frequenza respiratoria e assenza di movimento dei baffi.
    4. Assicurati che il mouse sia posizionato correttamente nel frame stereotassico con le barre auricolari accuratamente regolate.
    5. Radere l'area chirurgica e disinfettarla usando una soluzione antisettica (povidone-iodio seguito dal 70% di etanolo) per ridurre al minimo il rischio di infezione.
    6. Fai un'incisione al cuoio capelluto mediano e ritrai delicatamente i tessuti sottostanti per esporre il cranio mantenendo l'emostasi. Assicurati che la pelle sia sufficientemente aperta da poter visualizzare le creste parietotemporali. Per ottenere questo risultato, posiziona quattro pinze bulldog fini sulla fascia sotto la pelle per massimizzare l'esposizione.
    7. Pulire e asciugare accuratamente il cranio esposto per una visione chiara dei punti di riferimento anatomici (bregma e lambda).
    8. Livellare il cranio sull'asse anteroposteriore allineando bregma e lambda nello stesso piano orizzontale.
    9. Livellare il cranio sull'asse mediolaterale abbinando la profondità di entrambe le creste parietotemporali.
  3. Perforazione e posizionamento dell'impianto
    1. Forare un foro di 1 mm di diametro sopra il vmPFC alle coordinate AP: +1,75; ML: −0,4; DV: +3,1 (Figura 2). Usa il braccio stereotaxi per segnare i quattro vertici con l'inchiostro e guidare l'inserimento della sonda di silicio nel giorno della registrazione. Inoltre, disegna una croce collegando i punti descritti con un bisturi e applicando un'abbondanza di inchiostro in modo che penetri nelle incisioni, assicurando che i segni rimangano stabili. Rimuovere eventuali eccessi d'inchiostro con un cotton fioc inumidito con alcol al 70%.
    2. Forare due fori aggiuntivi nella regione posteriore del cranio sopra il cervelletto. Inserire manualmente un filo in ogni foro per riferimento futuro e messa a terra (Figura 2), rispettivamente.
      1. In alternativa, usa viti in acciaio inossidabile (acciaio inossidabile A2, M1 × 2, o acciaio inossidabile 18-8, diametro 0,061" × lunghezza 3/16") o jumper maschio in acciaio inossidabile. Indipendentemente dalla scelta, assicurati che l'elemento che fornisce il contatto elettrico rimanga in contatto diretto con la superficie cerebrale senza esercitare pressione, per evitare danni ai tessuti, compromettere il benessere animale o compromettere la qualità della registrazione.
    3. Crea scanalature superficiali sul cranio esposto con un bisturi per aumentare la superficie e migliorare l'adesione dell'impianto.
    4. Applicare una resina adesiva dentale intermedia sul cranio pulito e essiccato in due strati consecutivi: prima con la miscela base-catalizzatore, lasciandola asciugare completamente, e poi con la miscela contenente polvere, assicurando la copertura dell'intera superficie e dei bordi del cranio. Verifica con una pinzetta che il legame adesivo tra il cranio e il futuro cemento per impianto sia completamente solidificato prima di procedere.
    5. Posizionare una barra di testa in acciaio inossidabile tra il foro di registrazione del PFC e i fori di riferimento/terra (Figura 2). Allineare la barra della testa con il braccio stereotassico per assicurarsi che sia completamente a livello del cranio, mantenendo così coordinate stereotassiche accurate durante la fissazione della testa e la successiva inserzione della sonda di silicio.
    6. Attacca tutti i componenti metallici al cranio usando cemento dentale, evitando con attenzione che qualsiasi cemento entri nel foro di registrazione.
    7. Copri la craniotomia con un silicone chirurgico bicomponente.
      NOTA: Se tutti i passaggi sono seguiti con attenzione, si prevede che l'impianto e la successiva funzionalità della barra della testa procedano senza complicazioni, con un tasso di successo stimato superiore al 95%.
  4. Cure post-operatorie
    1. Monitorare attentamente il recupero del topo dopo un intervento cerebrale, assicurandoti che l'animale riprenda conoscenza, mantenga la temperatura corporea e sperimenti sollievo dal dolore.
    2. I topi da casa singolarmente nelle gabbie e li monitorano fino al completo recupero.
    3. Somministrare butorfanolo sottocutaneo (5 mg/kg in soluzione salina) ogni 12 ore per 3 giorni dopo l'intervento.
      NOTA: (CRITICO) Durante tutto l'intervento, monitorare continuamente i parametri vitali (frequenza cardiaca e respiratoria, saturazione di ossigeno e pressione sanguigna). Applica le gocce oculari quando necessario per prevenire la secchezza o i danni corneali.

3. Abituazione

NOTA: Una volta che i topi recuperano il loro peso pre-operatorio (circa 5-7 giorni dopo l'intervento), iniziare un protocollo di abitudine di 4 giorni per abituare gradualmente gli animali all'ambiente sperimentale.

  1. Giorno 1: Effettuare due sessioni di maneggiamento di 10 minuti ciascuna, con un periodo di riposo di 1 ora tra le sessioni per familiarizzare i topi con l'esperimentatore. Tocca delicatamente il mouse mentre è sull'avambraccio per familiarizzare con l'esperimentatore.
  2. Giorno 2: Esegui due sessioni di manipolazione da 5 minuti. Dopo ogni sessione, tieni delicatamente i topi per la barra della testa a intervalli di 10 secondi per un totale di 5 minuti.
  3. Giorno 3: Dopo una breve sessione di maneggiamento, lascia correre liberamente i topi sul tapis roulant per 7 minuti. Poi, fissa la testa e tieni i topi nella posizione fissa per 5 minuti.
  4. Giorno 4: Effettuare una sessione di corsa su tapis roulant di 15 minuti con la testa fissa.
    NOTA: (CRITICO) Gli animali che mostrano una perdita di peso eccessiva, il barbering, una diminuzione del comportamento esplorativo o una ridotta motilità, in conformità con le linee guida stabilite per il benessere animale, devono essere ritirati dallo studio. L'impianto deve rimanere completamente stabile. Qualsiasi spostamento richiede l'esclusione dell'animale dallo studio, poiché potrebbe danneggiare la sonda multicanale durante la registrazione e/o causare segnali instabili e rumorosi.

4. Preparazione della sonda

NOTA: Per collegare la sonda agli adattatori (Figura 3A) segui questi passaggi:

  1. Collega l'adattatore/connettore della sonda all'adattatore del braccio stereotassico.
  2. Collegare 2 adattatori head-stage (ciascuno Om32) all'adattatore della sonda (Figura 3A), assicurando che l'orientamento corrisponda ed evitando forze eccessive.
  3. Collega la sonda all'adattatore (Figura 3B). Per consentire registrazioni simultanee dalle regioni IL e PL a 64 profondità distinte, si utilizza una sonda al silicio a un solo gambo e 64 canali (Lunghezza del gambo: 8 mm; Spessore del gambo: 15 μm) (Figura 4A).
  4. Per facilitare la successiva localizzazione della sonda, si ricopre la sonda con un colorante fluorescente o particelle ferromagnetiche compatibili istologiamente, consentendo una verifica post hoc del sito di registrazione.
  5. Applica il colorante con uno dei seguenti metodi:
    1. Immergi tutto il gambo nella soluzione.
    2. Rilascia una piccola goccia della soluzione da una micropipetta sulla sonda e sparla lungo il gambo.
    3. Usa un pennello fine immerso nella soluzione per dipingere il retro della sonda.
    4. Per i passaggi 4.5.2 e 4.5.3, applica almeno tre corse per garantire un corretto rivestimento del fusto.
      NOTA: I passaggi da 4.1 a 4.3 sono necessari solo la prima volta che la sonda viene utilizzata, poiché può essere riutilizzata in più sessioni di registrazione. Dopo le registrazioni, scollega i cavi dell'interfaccia periferica seriale (SPI) mantenendo la sonda collegata all'adattatore e gli adattatori montati sull'adattatore del braccio stereotassico.

5. Registrazione e acquisizione del segnale

  1. Monitorare il ciclo estrole, utilizzando un protocollo non invasivo basato sulla tipologia cellulare nei frottis vaginali per assicurarsi che le femmine siano nella fase diestruale29,30.
  2. Fissare l'animale in posizione fissa con la testa su un tapis roulant cilindrico integrato con una struttura stereotassica (Figura 4B). Assicurati che il tapis roulant e la struttura siano adeguatamente allineati per garantire stabilità e comparabilità tra i soggetti.
  3. Per registrare e acquisire segnali, segui i passaggi 5.3.1-5.3.15.
    1. Utilizza una lente d'ingrandimento per assicurarti che l'impianto rimanga completamente immobile.
    2. Montare l'assemblaggio della sonda — composto dalla sonda, dagli adattatori e dagli adattatori headstage — sul braccio adattatore del telaio stereotassico.
    3. Collegare i cavi SPI, precedentemente collegati alla scheda di acquisizione, agli stadi di testa (Figura 3B). Tieni traccia di quale cavo SPI è collegato a ciascun headstage, poiché questa corrispondenza è essenziale per preservare la disposizione degli elettrodi durante il successivo smistamento automatico degli spike.
    4. Collegare il filo di terra dall'adattatore della sonda al ponte maschio ipsilaterale all'emisfero registrato, e il filo di riferimento al lato controlaterale. Applica una piccola quantità di stagno da saldatura sul filo nascosto nel cervello, poi applica brevemente calore per fissare la connessione. Evita il calore eccessivo per evitare danni al tessuto sottostante o all'elettronica dell'adattatore.
    5. Posiziona una lente d'ingrandimento per visualizzare il foro creato per l'inserimento della sonda nelle cortecce PL e IL. Assicurati che i punti di riferimento dell'inchiostro rimangano sempre chiaramente visibili per mantenere coordinate stereotassiche precise durante la procedura.
    6. Guida la sonda verso il centro del foro del vmPFC usando il braccio stereotassico e i punti di riferimento pre-marcati.
    7. Posiziona con cura la sonda al centro della craniotomia e tocca delicatamente la superficie cerebrale. Applica soluzione salina calda sul tessuto esposto per evitare l'asciugatura.
    8. Inizia ad abbassare la sonda a una velocità di 50 μm/min per 4-5 minuti per minimizzare l'infiammazione dei tessuti. Assicurati che il gambo della sonda non si pieghi durante questa inserzione iniziale.
    9. Misura l'impedenza dei siti di registrazione e confronta i valori con quelli forniti dal produttore. Questa valutazione iniziale garantisce che i primi canali che accedono al cervello non siano stati danneggiati o bloccati durante l'inserimento.
      NOTA: (CRITICO) Le impedenze degli elettrodi devono essere confrontate con i valori di base del produttore. Deviazioni fino al ~30% sono generalmente accettabili e non compromettono le registrazioni. Aumenti tra il 30 e il 100% possono comunque essere utilizzabili, ma richiedono cautela e un monitoraggio più attento. Cambiamenti superiori al 100% spesso indicano danni o blocchi, e i siti interessati dovrebbero essere considerati inaffidabili. In tali casi, la sonda dovrebbe essere pulita per ridurre l'impedenza come descritto in precedenza. Se le impedenze non possono essere ripristinate a un intervallo accettabile, la sonda deve essere scartata. Tuttavia, spetta infine allo sperimentatore quanti canali inaffidabili possano essere tollerati prima di scartare la sonda; Uno standard comunemente applicato è che non più del ~10% dei canali debba essere compromesso.
    10. Continuare ad abbassare la sonda a una velocità di 50 μm/min mentre monitora il segnale in tempo reale dei canali che entrano nel cervello. Verifica che questi segnali somiglino a quelli dei canali precedentemente valutati per confermare l'inserimento corretto.
    11. Avanzare la sonda fino a raggiungere una profondità di +3,1 mm DV, mantenendo la craniotomia idratata applicando soluzione salina calda durante tutta la discesa.
    12. Rimuovi la lente d'ingrandimento ed elimina qualsiasi altra fonte di rumore elettrico dalla stanza.
    13. Rimisura l'impedenza per verificare che nessun sito di registrazione sia stato bloccato durante la riduzione della sonda.
    14. Monitorare il segnale da 4-5 canali consecutivi come riferimento e attendere 90-120 minuti per la stabilizzazione del segnale della sonda. Dopo questo periodo di stabilizzazione, verificare che la deriva del segnale sia minima per garantire che il successivo ordinamento automatico degli spike possa isolare in modo affidabile i cluster di unità singole.
    15. Rimisura l'impedenza prima di iniziare l'acquisizione dei dati per confermare le corrette condizioni del sito di registrazione e stabilire una misurazione di base dell'impedenza. Applica regolarmente soluzione salina calda per evitare che i tessuti si secchino. Salva la registrazione come file binario (ad esempio, .dat o .bin) per facilitare la successiva pre-elaborazione dei dati.
  4. Una volta stabili, segui i passaggi 5.4.1-5.4.6.
    1. Registrare l'attività neurale di base per 30 minuti (Figura 4C).
    2. Avviare il protocollo di condizionamento avversivo usando Arduino, 30 minuti dopo la registrazione di base. Questo consiste in 10 toni uditivi (10 s/tono), emessi una volta al minuto per 10 minuti. Ogni tono è immediatamente seguito da uno stimolo luminoso di 10 secondi presentato tramite gli schermi del labirinto di realtà virtuale (Figura 4C).
    3. Registra l'attività neurale per 10 minuti senza alcun tipo di stimolo condizionante.
    4. Registra l'attività corticale PL e IL durante il protocollo di estinzione, in cui vengono presentati 10 toni uditivi senza il successivo stimolo luminoso.
    5. Registra l'attività neurale per altri 10 minuti in assenza di stimoli.
    6. Ferma la registrazione.
  5. Procedure post-registrazione: Dopo aver completato la sessione di registrazione, segui il passaggio 5.5.1.
    1. Ritiro dalla sonda: applicare soluzione salina calda e rimuovere con attenzione la sonda a una velocità di 100-150 μm/min, monitorando continuamente i segnali degli elettrodi per evitare danni meccanici alla sonda e allungamento del tessuto, che potrebbero compromettere la successiva ricostruzione istologica.
    2. Una volta rimossa la sonda dal cervello, immergi immediatamente il gambo in acqua distillata per 10 minuti per evitare che i tessuti attaccati si secchino.
    3. Anestesiare l'animale con pentobarbital sodico (100 mg/kg). Poi, all'interno di una cappa chimica, perfondi il topo transcardicamente con 80 mL di soluzione salina (0,9%), seguiti da 80 mL di paraformaldeide diluito al 4% in PB (0,1 M, pH 7,6).
      1. Per evitare il paraformaldeide, la contattato e l'inalazione, usa dispositivi di protezione per occhi/viso, guanti protettivi chimici e una maschera antipolvere. Al termine della perfusione, si deposita il paraformaldeide rimanente in un contenitore per solventi non alogenati.
      2. In caso di fuoriuscita, inumidisce il materiale per evitare la dispersione della polvere e mettilo in contenitori sigillati. Pulire le aree contaminate e le superfici di lavoro con candeggina per neutralizzare il paraformaldeide.
    4. Rimuovere il cervello, fissare la temperatura durante la notte a 4 °C e conservare il 30% di saccarosio in PB (0,1 M, pH 7,6) a 4 °C per la crioprotezione. Ottieni sezioni coronali da 30 μm usando un microtomo congelante e monta le fette su vetrine di vetro gelatinizzato.
      NOTA: Queste sezioni saranno utilizzate per confermare la sovraespressione della DR α-Syn tramite immunoistochimica come precedentemente 19,20,21 e la localizzazione della sonda.
    5. Pulizia della sonda: Immergi la regione impiantabile della sonda in una soluzione di detersivo enzimatico all'1% in acqua distillata per 1 ora.
    6. Immergi il gambo della sonda in acqua distillata per altri 10 minuti per rimuovere i residui del detersivo.
    7. Asciuga per 20-30 minuti in posizione verticale. Dopo l'asciugatura, ispezionare la sonda al microscopio per confermare che non rimangano tessuti o detriti nei siti di registrazione. Se la sonda è completamente pulita, immergila in alcol isopropilico di alta qualità per 1 minuto e conservala nella sua scatola antistatica originale.

6. Analisi dei dati: Ordinamento a picchi e preelaborazione dei dati

NOTA: Per analizzare registrazioni neurali extracellulari e attribuire singoli picchi a neuroni specifici, utilizzare l'algoritmo di spik-sorting Kilosort431 .

  1. Esegui la selezione automatica degli spike usando Kilosort431. Nell'interfaccia grafica di Kilosort4, seleziona il file binario di registrazione e specifica la disposizione della sonda secondo il foglio di configurazione del produttore. Esegui lo spike sorting usando i parametri predefiniti, ideali per catturare le forme d'onda registrate nelle cortecce IL e PL senza ulteriori aggiustamenti.
  2. Ispezionare l'output Kilosort usando Phy2 (kwikteam/phy) per ulteriori curazioni manuali. Incorporare plugin sviluppati dalla community (petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin) per aggiungere funzionalità extra a Phy2 e migliorare la qualità dei dati curati.
  3. Etichetta come rumore e scarta qualsiasi cluster con frequenza <0,05 Hz o contenente meno di 500 picchi.
  4. Inoltre, segna i seguenti cluster come rumore:
    1. Segna come rumore quelli che mostrano auto-correlogrammi a forma triangolare.
    2. Segna come rumore quelli con forme d'onda che non assomigliano a picchi.
    3. Segna come rumore quelli rilevati su un singolo canale di registrazione o su tutti i canali con ampiezza variabile.
    4. Segna come rumore coloro che mostrano una forte periodicità nei loro auto-correlogrammi.
  5. Seleziona solo cluster che mostrano forme d'onda fisiologicamente appropriate, evidenza di una valle refrattaria nell'autocorrelogramma, variazioni plausibili di ampiezza e componenti principali chiaramente separate.
  6. Pulisci manualmente ogni cluster applicando la rimozione degli outlier basata sulla distanza di Mahalanobis.
  7. Continua a rivedere le forme d'onda e le variazioni di ampiezza come indicatori chiave della validità della pulizia manuale.
    NOTA: Una volta completato lo spike sorting, i modelli di attività neuronale del vmPFC possono essere analizzati utilizzando le routine implementate in Python.

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Risultati

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Le recenti registrazioni dell'attività corticale PL e IL, utilizzando il protocollo sperimentale dettagliato, rivelano risultati significativi: la sovraespressione di h-α-Syn nella DR, che induce un fenotipo simile all'ansia nelle femmine di topo, altera anche l'attività ventromediale delle vmPFC. Attraverso un'analisi basata su Python, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di α-Syn nei neuroni 5-HT del nucleo DR alterava la dinamica di scarico e l'organizzazione funzionale del circuito vmPFC-DR, riducendo la distin...

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Discussione

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Questo protocollo presenta una metodologia robusta per la valutazione elettrofisiologica in vivo delle cortecce PL e IL in topi svegli e con la testa fissa, utilizzando un sistema di corridoio di realtà virtuale. L'importanza di questo metodo risiede nella sua capacità di investigare direttamente il circuito vmPFC-DR in topi svegli e comportati all'interno di un modello PD. Anche se la fissazione della testa limita i movimenti degli animali e può essere stressante, offre un cont...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal BBRF Young Investigator Grant 31547 (MSA) 2023, dal grant MCIU/AEI/FEDER UE PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, Governo della Catalogna (AB), e PID2022-141733NB-I00 (VT). Vorremmo inoltre ringraziare la Rete Spagnola per la Ricerca sullo Stress, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e CB/07/09/0034 Centro per la Ricerca Biomedica nella Rete di Salute Mentale (CIBERSAM). MSA ha una Borsa di Studio Margarita Salas (MS21-132) dall'Università di Valencia (riclassificazione del Sistema Universitario Spagnolo del Ministero delle Università del Governo spagnolo, finanziata dall'Unione Europea, Next Generation UE).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AAV1/2-CMV/CBA-Umano A53T aSyn-WPRE-BGH-polyAFiume CharlesGD1001-RVA53T umano aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Vuoto-WPRE-BGH-polyAFiume CharlesGD1004-RVControllo vettoriale vuoto
ADPT A64-Om32x2Cambridge NeuroTechOmnetics 2228Adattatore
silicone chirurgico bicomponente  Strumenti di Precisione MondialeKWIK-SIL
Butorphanol Torbugesic vet / quité di cimito; Mica67753-31-5
DuraLayReliance Dental Manufacturing / Kalma43640cemento dentale 
Sonda multicanale H9Cambridge NeuroTechASSY-77 H9
Crema EMLA (Lidocaina / pricolaina) Lirios Vañ &acuto; Farmacia Sempere679290
microiniettore Strumento di Precisione MondialeKDS-310-PLUS
MSS Isoflurane Vaporizer  Forniture e servizi medici, Regno UnitoMSSVAP02 
Open Ephys Acquisition BoardOpen EphysOEPS-9029Consiglio di acquisizione; L'Open Ephys Acquisition Board può trasmettere fino a 512 canali di dati neurali a un computer tramite USB
C& B MetaBond ParkellS380-RDCemento adesivo rapido
Pentobarbital Dolethal Vetoquinol / Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLBariturici
Linea destra 32-canale   HeadstageIntan Technologies#C3314adattatore head-stage 
SiccafluidThea S.A. Laboratories / Lirios Vañ &acuto; Farmacia Sempere6515167Gel oftalmico  
apparato stereotassico Stoelting51730U
Fotogramma stereotassicoNarishigeSR-6N/SM-15R
Terg-a-zimaSigma AldrichZ273287Soluzione per la pulizia delle sonde

Riferimenti

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