Articolo metodologico

Generazione efficiente e rapida di cellule killer indotte da CAR-T e citochine in dispositivi scalabili GMP

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DOI:

10.3791/69369

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5 dicembre 2025

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1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo scalabile per l'espansione dei prodotti Adoptive Cell Therapies (ACT), ovvero le cellule Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T e le cellule Cytokine-Induced Killer (CIK), utilizzando dispositivi di espansione rapida permeabile ai gas (G-Rex), dimostrando una crescita efficiente e robusta in un contesto clinicamente rilevante.

Abstract

Le terapie cellulari adottive (ACT) sono progredite rapidamente negli ultimi anni, svolgendo un ruolo fondamentale nell'immunoterapia contro il cancro e influenzando significativamente gli esiti del trattamento. Un passaggio fondamentale nello sviluppo della terapia cellulare, sia nelle fasi precliniche che cliniche, è il processo di produzione. I metodi convenzionali di coltura statica richiedono frequenti manipolazioni cellulari e sono spesso limitati da ridotti scambi gassosi e apporti di nutrienti, che possono compromettere la resa cellulare e il fenotipo. Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo, riproducibile e scalabile per l'espansione ex vivo di due prodotti ACT, ovvero le cellule Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T e le cellule Cytokine-Induced Killer (CIK), utilizzando dispositivi Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex). I dispositivi G-Rex sono specificamente progettati per migliorare lo scambio di nutrienti e supportare colture ad alta densità con un intervento minimo da parte dell'utente. Tra i vari approcci ACT, le cellule CAR-T hanno dimostrato un successo notevole nel trattamento delle neoplasie ematologiche, facilitando un rapido progresso dalla ricerca sperimentale alle applicazioni cliniche. Oltre alle cellule CAR-T, le cellule CIK sono state ampiamente utilizzate in studi clinici grazie al loro fenotipo caratteristico e all'assenza di eventi avversi correlati al trattamento e della malattia Graft-versus-Host (GvHD). Questo protocollo delinea i passaggi tecnici chiave per entrambi i tipi cellulari, a partire dall'isolamento e dall'inserimento delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). In breve, i PBMC vengono stimolati con anticorpi anti-CD3/CD28, seguiti da trasduzione lentivirale per espandere le cellule CAR-T, oppure con Interferone-γ (IFN-γ), anticorpi anti-CD3 e Interleucina 2 (IL-2) per ottenere cellule CIK. La citometria di flusso viene impiegata per monitorare la vitalità e il fenotipo delle cellule, e vengono eseguiti saggi funzionali per confermare il potenziale terapeutico del prodotto cellulare e validare la scalabilità dell'approccio. Nel complesso, questo protocollo offre una soluzione pratica per la produzione di un gran numero di cellule effettrici in un contesto preclinico, facilitando l'applicazione clinica con diverse popolazioni di cellule immunitarie. Infine, offre una soluzione scalabile per la produzione di celle effettori ad alto rendimento.

Introduzione

La terapia cellulare adottiva (ACT) è diventata un pilastro importante delle terapie avanzate per il trattamento del cancro. Questo approccio si basa sulla somministrazione di prodotti cellulari ampliati ex vivo per ottenere un'efficaciaantitumorale 1. Ad oggi, molti tipi cellulari sono stati utilizzati nell'ACT, che vanno da approcci antispecifici antigenici, ad esempio natural killer (NK)2, cytochine-doted killer (CIK)3,4, natural killer T (NKT)5 o cellule Tγδ 6, fino a cellule altamente specifiche e personalizzate, come i linfociti infiltranti tumorali (TIL)7 e terapie cellulari ingegnerizzate, ad esempio il recettore antigenico chimerico (CAR)1. 8 e cellule recettori delle cellule T (TCR) 9,10.

Le cellule CAR-T sono cellule T geneticamente modificate generate da trasduzione virale ex vivo per esprimere un recettore immunitario sintetico progettato per riconoscere un bersaglio molecolare specifico. La struttura CAR consiste in un anticorpo Fragment a catena singola (scFv) specifico per antigene, combinato con domini di segnalazione intracellulari, inclusa la catena TCRζ e molecole costimolanti. All'attivazione dell'antigene, il dominio intracellulare fornisce segnali di attivazione che promuovono la proliferazione delle cellule T e l'attivitàantitumorale 11.

Le cellule CIK sono una popolazione eterogenea di linfociti T attivati che acquisiscono l'espressione del CD56 durante l'espansione ex vivo dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) o dal sangue del cordone ombelicale (UCB)12. Questa espansione prevede la stimolazione con Interferone-γ (IFN-γ), anticorpi monoclonali anti-CD3 e Interleucina-2 (IL-2), seguita da una coltura in IL-2 per 14 giorni. Le cellule CIK somigliano funzionalmente sia alle cellule NK che a quelle T, esercitando attività antitumorale sia attraverso meccanismi indipendenti dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sia tramite meccanismi dipendenti 13,14,15,16. Queste proprietà permettono alle cellule CIK di essere utilizzate sia in contesti terapeutici allogenici che autologhi con un rischio minimo di malattia innesto contro ospite (GvHD) 17.

Nella pratica clinica, sia le terapie cellulari CAR-T che CIK richiedono la somministrazione di un gran numero di cellule. Le cellule CAR-T vengono infuse a 50-200 milioni di dosi per ognipaziente 18. Analogamente, le cellule CIK vengono tipicamente somministrate a dosi fino a 10 miliardi di cellule per infusione, con i pazienti che spesso ricevono più infusioni a seconda del protocolloterapeutico 19. I metodi tradizionali di coltura cellulare che utilizzano fiaschette o piastre sono inefficienti, richiedono tempo e richiedono un passaggio frequente, rendendo l'espansione su larga scala irrealizzabile e aumentando il rischio di contaminazione. Sistemi automatizzati o semi-automatizzati che utilizzano colture a sacchi o bioreattori permettono un'espansione su larga scala ma presentano limitazioni, cioè lo stress di taglio o la necessità di aggiustamenti di densità e la frequente perfusione del mezzo20,21, e la gestione di un lotto alla volta, portando a costi elevati sia in contesto accademico che industriale. In questa situazione difficile, un'alternativa è rappresentata dal dispositivo di espansione rapida permeabile al gas (G-Rex), un metodo di coltura statica dotato di una membrana di silicio sul fondo del pozzo, che garantisce uno scambio efficiente di ossigeno e un'altezza maggiore dei recipienti, consentendo una capacità di mezzo ad alto volume. Pertanto, il sistema supporta la crescita cellulare senza sostituzione del mezzo o aggiustamento delladensità 22,23. I sistemi G-Rex-M hanno dimostrato scalabilità fino a 5000 mL e sono compatibili con sistemi automatizzati di raccolta, fornendo una piattaforma di coltura chiusa e priva di contaminazioni, facilmente trasferibile da contesti accademici a clinici per lo sviluppo di prodotti medicinali di terapia avanzata (ATMP)24.

Nella procedura descritta, abbiamo sfruttato i vantaggi e le caratteristiche dei dispositivi G-Rex per ottimizzare il protocollo di espansione sia delle celle CAR-T che CIK. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi cellulari possono essere espansi e scalati in modo efficiente, mantenendo un fenotipo e un profilo funzionale coerenti tra diversi sistemi di coltura. Una panoramica schematica del protocollo di espansione sia per le celle CIK che per quelle CAR-T è mostrata nella Figura 1.

Figura 1
Figura 1: Panoramica dei protocolli di espansione delle celle CAR-T e CIK utilizzando dispositivi di coltura G-24 o G-6M. Le cellule CAR-T e CIK vengono espanse da PBMC isolate a partire dal Giorno 0. Per l'espansione delle cellule CAR-T, i PBMC vengono stimolati al giorno 1 con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, modificati geneticamente al giorno 2, e successivamente coltivati con integrazione di hIL-7 e hIL-15 ogni 3-4 giorni, con il prelievo finale per i test funzionali al giorno 9. Nel formato G-6M, l'integrazione di citochine è limitata al secondo giorno, senza bisogno di alimentazione aggiuntiva con citochine durante il periodo di coltura. Per l'espansione delle cellule CIK, i PBMC vengono stimolati al giorno 1 con rhIFN-γ e al giorno 2 con anticorpi anti-CD3 e rhIL-2, che vengono poi somministrati ogni 3-4 giorni. Nel G-24, è necessario un cambiamento del mezzo contemporaneamente all'integratore di citochine. Le cellule CIK vengono prelevate al giorno 14 per i test funzionali a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Cappotti buffy anonimizzati di donatori sani precedentemente testati per l'assenza di contaminazione patogeno (ad esempio, HIV, HCV, HBV, sifilide) sono stati ottenuti dalla Blood Bank of Padova Hospital prima del consenso scritto e informato. I campioni di sangue venivano manipolati all'interno di armadietti certificati per la biosicurezza e il personale indossava i dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati.

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono vettori lentivirali sono state condotte secondo condizioni di BioSafety Level 2 (BSL-2), secondo le linee guida istituzionali. La gestione del vettore lentivirale richiede ulteriori precauzioni, tra cui il doppio guante. I rifiuti biopericolosi (inclusi materiali virali, cellule trasdotte e campioni di origine umana) venivano autoclavati prima dello smaltimento, mentre i rifiuti chimici (inclusi coloranti fluorescenti e reagenti) richiedevano la segregazione secondo i protocolli istituzionali per i rifiuti pericolosi. Si noti che i requisiti specifici di biosicurezza possono variare tra le istituzioni e devono essere verificati prima dell'implementazione del protocollo.

1. Isolamento dei PBMC

  1. Isolare i PBMC da giunche buffy sane o campioni di sangue periferico tramite centrifugazione a gradiente di densità. Diluire il giallo buffy con un volume uguale di 1x Phosphate Buffer Saline (PBS) sterile e sovrapporre con cura il sangue diluito sullo stesso volume di Lymphoprep in un tubo conico da 50 mL. La diluizione con 1x PBS non è necessaria per il sangue periferico. Centrifuga a 400 x g per 20 minuti a temperatura ambiente senza freno.
  2. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato di PBMC all'interfaccia plasma-Lymphoprep e lavarlo con PBS sterile 1x. Centrifugare e risospendere PBMC in un mezzo cellulare ematopoietico (CM) integrato con penicillina/streptomicina al 1% (d'ora in poi cCM). Valutare il conteggio cellulare e la vitalità utilizzando il saggio di esclusione Trypan Blue.

2. Espansione delle cellule CAR-T da PBMC in vasi di coltura G-24

  1. Attivazione dei PBMC (Giorno 0)
    1. Risospendere 2 x 106 PBMC appena isolati in 2 mL di cCM integrati con siero bovino fetale al 5% (FBS) (d'ora in poi cCM-F), ottenendo una densità finale di semina di 1 x 106 PBMCs/cm2/mL, e trasferirlo in un pozzo di un vaso di coltura G-Rex (G-24) a 24 pozzi. Semina tanti pozzi quanti ne sono le diverse condizioni di trasduzione da eseguire al Giorno 1 (Passo 2.2 - Giorno 1).
    2. Aggiungere 4 μl di anticorpi anti-CD3 (grado funzionale puro, concentrazione finale: 0,2 μg/mL) e 20 μl di anti-CD28 (grado funzionale puro, concentrazione finale: 1 μg/mL) direttamente in ciascun pozzo per attivare le cellule T. Coltivare cellule in incubatore umidificato mantenute a 37 °C, 5% diCO2.
  2. Trasduzione delle cellule T con vettori lentivirali (Giorno 1)
    1. Dopo la stimolazione notturna, prelevare e contare le cellule T attivate utilizzando il test di esclusione Trypan Blue per valutare la vitalità. Calcolare 1 x 106 di celle attive vitali per ogni pozzo di G-24 (area pozzo di 2cm 2), corrispondenti a una densità di semina di 0,5 x 106 cellule/cm². Trasferisci le celle in un tubo e centrifuga a 300 x g per 5 minuti.
    2. Preparare il mezzo di trasduzione per ogni pozzo combinando il volume vettoriale lentivirale appropriato, basato sulla concentrazione (TU/mL) della preparazione del vettore lentivirale (qui, lentivirus CD19-CAR-BBζ ottenuto dall'Ospedale di RicercaPediatrica St. Jude 25; molteplicità di infezione (MOI) 20), con 5 μl dell'amplificatore di trasduzione protamina solfato (la soluzione stock 8 mg/mL si ottiene sciogliendo il solfato di protamina in 1x PBS e filtrandolo sterile con filtro da 0,2 μm; concentrazione finale di 50 μg/mL). Usa un mezzo CM integrato con FBS al 5% senza aggiungere penicillina/streptomicina per portare a un volume finale di 0,8 mL/pozzo (0,4 mL/cm²). Per il controllo non trasdotto (UTD), preparare il mezzo di trasduzione descritto evitando l'aggiunta del vettore lentivirale.
    3. Sospendere le cellule a pallina (passo 2.2.1) in 0,8 mL/pozzo di mezzo di trasduzione e placcarle in un nuovo pozzo G-24. Incubare durante la notte a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Se è prevista la trasduzione di più pozzi con lo stesso vettore lentivirale, preparare una miscela master del mezzo di trasduzione contenente il virus e il solfato di protamina alla concentrazione desiderata. Mescola accuratamente per garantire l'omogeneità. Poi, si aggiungono 0,8 mL di questo master mix in ogni tubo di cellule pelletate per garantire condizioni di trasduzione coerenti su tutti i campioni.
  3. Coltura e espansione delle cellule CAR-T (dal giorno 2 al giorno 9)
    1. Al secondo giorno, aumentare il volume di coltura a un volume finale di 8 mL/pozzo aggiungendo 7,2 mL di cCM-F fresco, integrato con Interleucina-7 umana (hIL-7) e Interleucina-15 umana (hIL-15) a una concentrazione finale di 10 ng/mL ciascuna (volume di citochine calcolato considerando un volume totale di 8 mL per pozzo).
    2. Al giorno 5, rinfrescare il mezzo di coltura rimuovendo con cura 6 mL di mezzo condizionato da ogni pozzo senza disturbare le cellule sul fondo del pozzo e sostituendoli con 6 mL di cCM-F fresco integrato con hIL-7 e hIL-15 (concentrazione finale: 10 ng/mL calcolati considerando un volume totale di 8 mL per pozzo). Se si lavora con più pozzi, prepara una miscela master di substrati cCM-F integrati con citochine hIL-7 e hIL-15 per garantire una distribuzione uniforme delle citochine.
    3. Al nono giorno, le celle CAR-T vengono espanse in modo efficiente e pronte per applicazioni a valle. Per prelevare le cellule CAR-T, rimuovere delicatamente e scartare 5 mL di mezzo condizionato. Utilizzando una pipetta da 1000 μL, risospezione delle cellule CAR-T nei restanti 3 mL di mezzo e spostale su un tubo da 15 mL. Contare le cellule CAR-T e verificarne la vitalità utilizzando il test di esclusione Trypan Blue. Tipicamente, da ogni pozzo G-24 si ottengono circa 3 x 10cellule CAR-T (3,24 ± 10 cellule 7 da 7 cellule (Tabella Supplementare 1).

3. Espansione CIK nelle vasi di coltura G-24

  1. Attivazione dei PBMC (Giorno 0)
    1. Seme 1 x 106 PBMC appena isolati per ogni pozzo di un vaso di coltura G-24, che corrisponde a una densità di 0,5 x 106/cm2, in 8 mL di cCM integrato con interferone-γ umano ricombinante (rhIFN-γ, concentrazione finale: 1000 IU/mL). Incubare le cellule a 37 °C, 5% diCO2.
  2. Stimolazione ed espansione delle cellule CIK (Giorno 1-Giorno 14)
    1. Al giorno 1, 22-24 ore dopo la stimolazione con rhIFNγ, aggiungere direttamente in ciascun pozzo 4 μL di anticorpo anti-CD3 (concentrazione finale: 50 ng/mL) e 4 μL di Interleucina-2 umana ricombinante (rhIL-2, concentrazione finale: 500 IU/mL). Incubare le cellule a 37 °C, 5% diCO2.
    2. Ogni 3-4 giorni (nei giorni 5, 9 e 12 di coltura cellulare), sostituire 6 mL di mezzo condizionato con cCM fresco e rhIL-2 (concentrazione finale: 500 IU/mL), calcolando la concentrazione finale di rhIL-2 rispetto al volume completo di 8 mL.
    3. Al giorno 14, prelevare le cellule CIK scartando 5 mL di mezzo condizionato e risospendendole nei restanti 3 mL di mezzo condizionato. Trasferire le cellule in un tubo da 15 mL e valutare il numero totale di cellule e la vitalità cellulare utilizzando il test di esclusione Trypan Blue. Tipicamente, da ogni pozzo si ottengono circa 8 x 107 celle CIK bulk (8,6 ± 4,58 x 10celle 7) (Tabella Supplementare 2).
      NOTA: Durante i cambiamenti del mezzo, aspirare attentamente il sovrandante, facendo attenzione a non disturbare la popolazione cellulare o a non entrare in contatto con la membrana permeabile ai gas. Il danno alla membrana può compromettere lo scambio gassoso e influire negativamente sulla vitalità cellulare.

4. Produzione su larga scala delle celle CAR-T e CIK

NOTA: I protocolli di espansione delle celle CAR-T e CIK descritti nelle Sezioni 2 e 3 possono essere facilmente scalati su dispositivi di coltura G-Rex più grandi, in particolare il formato G-6M. Durante la transizione dal formato G-24 (area superficiale: 2 cm2) al dispositivo G-6M (area superficiale: 10cm 2), tutte le concentrazioni e densità vengono mantenute costanti, mentre tutti i volumi e le quantità assolute sono aumentati proporzionalmente di un fattore 5 volte per adattarsi all'area superficiale aumentata. Ciò significa che la densità di semina cellulare, le concentrazioni di integrazione del mezzo e le concentrazioni di citochine rimangono invariate, ma i volumi totali di substrato, il numero di cellule seminate e le quantità assolute di citochine aggiunte saranno proporzionalmente aumentati. Questa caratteristica di scalabilità consente una transizione fluida dai protocolli di ricerca su piccola scala alla produzione preclinica o clinica iniziale senza richiedere modifiche significative ai protocolli, mantenendo così caratteristiche coerenti delle cellule effettrici.

  1. Espansione delle celle CAR-T nei dispositivi di formato G-6M
    1. Eseguire l'attivazione dei PBMC al giorno 0 e la trasduzione lentivirale al giorno 1, come descritto nella Sezione 1, mantenendo tutte le concentrazioni e densità mentre si aumenta volumi e quantità assolute di un fattore di 5 volte.
    2. Al secondo giorno, portare il volume di coltura a un totale di 100 mL usando il mezzo cCM-F. Calcola e aggiunge hIL-7 e hIL-15 per raggiungere la concentrazione finale di 10 ng/mL di conseguenza.
      NOTA: A differenza del formato G-24, il design più alto del dispositivo G-6M consente un volume medio maggiore, consentendo un apporto costante di nutrienti e citochine durante tutto il periodo di coltura senza la necessità di sostituzione del mezzo (approccio "Riempire e Dimenticare"). Pertanto, non sono necessarie ulteriori citochine al quinto giorno.
    3. Per prelevare le cellule CAR-T al giorno 9, si eliminano circa 90 mL di mezzo da ogni pozzo utilizzando una pipetta sierologica e si risospendono le cellule nei restanti 10 mL. Trasferisci le cellule in un tubo da 15 mL e usale per i test successivi.
  2. Espansione delle celle CIK nei dispositivi di formato G-6M
    1. Effettuare la semina dei PBMC al giorno 0 seguendo il protocollo descritto nella Sezione 3 e aumentare tutti i volumi e i reagenti di un fattore di 5 volte per corrispondere al formato più grande del dispositivo (G-6M).
    2. Il primo giorno, regolare il volume di coltura a un totale di 100 mL con un substrato cCM. Aggiungi una concentrazione finale di 500 IU/mL rhIL-2 e 50 ng/mL anti-CD3 in ciascun pozzo.
    3. Integrare 500 IU/mL di rhIL-2 ogni 3-4 giorni (giorni 5, 9 e 13) in ciascun pozzo senza cambiare il medio.
    4. Prelevare le cellule CIK al giorno 14 rimuovendo circa 90 mL di mezzo da ogni pozzo con una pipetta sierologica. Sospezione delle celle dei restanti 10 mL, spostale su un tubo da 15 mL e utilizzale per i test successivi.

5. Caratterizzazione del fenotipo delle cellule effettrici tramite citometria di flusso

NOTA: Al termine del protocollo di espansione, viene effettuata un'analisi dei marcatori superficiali tramite citometria di flusso sulle cellule CAR-T e CIK per valutarne il fenotipo, inclusi stati di differenziazione distinti, cioè Naïve (CD45RA+CD62L+), Memoria Centrale (CM, CD45RA-CD62L+), Memoria Effettore (EM, CD45RA-CD62L-) e Memoria Effettore CD45RA-positivo (EMRA, CD45RA+CD62L-; Figura supplementare 1A-B).

  1. Raccogli 3 x 105 celle per ogni tubo di colorazione. Lavare le cellule in 1x PBS con 1% FBS (PBS-F), centrifugare a 300 x g per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 50 μL di soluzione di miscela anticorpale preparata in tampone di colorazione (1 parte di tampone Brilliant e 1 parte PBS-F) secondo il pannello di colorazione desiderato (Tabella 1 e Tabella 2).
  2. Incubare le cellule per 20 minuti a 4 °C protette dalla luce, poi lavare le cellule colorate e centrifugare. Se è necessario un secondo passaggio di colorazione, esegui la colorazione con la miscela specifica di anticorpi, come descritto in precedenza (passo 5.1).
  3. Infine, lavare le cellule e colorare con un colorante di vitalità, qui Fixable Viability Stain 780 (FVS780), in 50 μL di 1x PBS, incubando per 15 minuti a 4 °C protetto dalla luce. Non è necessario un passaggio di lavaggio dopo la colorazione di vitalità. Dopo l'incubazione, aggiungere 200 μL di 1x PBS a ciascun campione e procedere con l'acquisizione citometrica in flusso. La strategia dettagliata di gating è mostrata nella Figura Supplementare 1A-B.
BersaglioCloneFluorocromoConcentrazione/DiluizioneScopo
Primo passaggio di colorazionerhCD19-Lui//2 μg/mLRilevamento delle molecole CAR
Incubazione a 4 °C per 20 minuti
Fase di lavaggio
Secondo passaggio di colorazioneSuoGG11-8F3.5.1PE1/50Rilevamento delle molecole CAR
CD3UCHT1BV5101/40Lignaggio
CD4SK3BV6501/40Lignaggio
CD8RPA-T8BV4211/20Lignaggio
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Maturazione
CD62LDREG-56FITC1/10Orientamento, attivazione
Incubazione a 4 °C per 20 minuti
Fase di lavaggio
Terzo passaggio di colorazioneFVS780//1/5000Discriminazione delle cellule vive/morte
Incubazione a 4 °C per 15 minuti

Tabella 1: Pannello anticorpale utilizzato per la colorazione delle cellule CAR-T. Panel di colorazione utilizzato per valutare l'espressione di CAR, il fenotipo delle cellule T e lo stato di differenziazione. Sono riportati cloni di anticorpi, concentrazione e fluorocromo coniugato per ciascun bersaglio di interesse.

BersaglioCloneFluorocromoDiluizioneScopo
Primo passaggio di colorazioneCD56HCD56PE1/40Lignaggio
NKG2D1D11APC1/83Attivazione
CD3UCHT1BV5101/40Lignaggio
CD4SK3BV6501/40Lignaggio
CD8RPA-T8BV4211/20Lignaggio
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Maturazione
CD62LDREG-56FITC1/10Orientamento, attivazione
Incubazione a 4 °C per 20 minuti
Fase di lavaggio
Secondo passaggio di colorazioneFVS780//1/5000Discriminazione delle cellule vive/morte
Incubazione a 4 °C per 15 minuti

Tabella 2: Pannello anticorpale utilizzato per la colorazione delle cellule CIK. Panel di colorazione utilizzato per valutare le sottopopolazioni CIK, il fenotipo e lo stato di differenziazione. Sono riportati cloni di anticorpi, concentrazione e fluorocromo coniugato per ciascun bersaglio di interesse.

6. Valutazione dell'attività citotossica specifica delle cellule CAR-T e CIK

NOTA: L'attività citotossica delle cellule CAR-T e CIK viene misurata co-colcolandole con le cellule target al rapporto desiderato effettore-bersaglio (E:T). Il tipo di saggio dipende dal tipo di cellule bersaglio, se derivino da tumori solidi o da neoplasie ematologiche. In questo protocollo, descriviamo un saggio di citometria a flusso basato su coloranti fluorescenti per cellule in sospensione e un saggio di Real-Time Cell Analysis (RTCA) basato su impedenza per cellule aderenti.

  1. Saggio di citometria a flusso basato su coloranti fluorescenti
    NOTA: La citotossicità antigenica specifica contro le neoplasie ematologiche può essere valutata utilizzando un saggio di citometria a flusso basato su coloranti fluorescenti. Prima della co-coltura, le cellule bersaglio vengono etichettate con un colorante fluorescente per facilitarne l'identificazione. Dopo la co-coltura con cellule effettrici, la morte cellulare bersaglio viene valutata tramite colorazione con un colorante di vitalità. L'analisi citometrica a flusso consente la quantificazione della uccisione specifica dell'antigene, basandosi sulla proporzione di cellule fluorescenti positive al colorante non vitali.
    1. Per ogni condizione di co-coltura, si raccoglie 2 x 10 celluletarget da 5 e si risospendono in 400 μL di mezzo colturale completo per raggiungere una concentrazione finale di 5 x 10cellule da 5 mL. Aggiungere colorante fluorescente a una concentrazione finale di 5 μM (qui Cell Trace Violet dye, CTV). Incubare per 30 minuti a 37 °C, protetto dalla luce. Dopo l'incubazione, lavare le cellule una volta con mezzo intero e risospendere la pellet a una concentrazione finale di 4 x 105 cellule/mL.
    2. Distribuire 500 μL della sospensione a celle target colorate (qui 2 x 105 di celle Raji come modello di cella target a sospensione CD19+ ) in tubi puliti da 5 mL secondo l'impostazione sperimentale. Confermare la colorazione efficace tramite citometria a flusso identificando le cellule bersaglio come cellule positive al colorante fluorescente (SSC-A contro CTV). Si raccomanda circa il 98% delle cellule fluorescenti positive a coloranti.
    3. In parallelo, contare e preparare le cellule effettrici (qui 5 x 106 di cellule CAR-T CD19) per ogni condizione di co-coltura. Lavare le cellule e risospendere in un mezzo di coltura completo alla concentrazione appropriata per raggiungere il rapporto effettore-bersaglio (E:T) desiderato. Aggiungere 500 μL della sospensione della cella effettore a ciascun tubo corrispondente contenente celle bersaglio.
      1. Per ottenere un rapporto E:T di 25:1, aggiungere 5 cellule CAR-T CD19da 10 6 effettori a 2 x 10 5celle Raji in ciascuna provetta, e preparare quanti tubi richiesti dal disegno sperimentale.
    4. Incubare le co-colture per 6 ore a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2. Includere una condizione di controllo che contenga solo cellule bersaglio per misurare la morte cellulare spontanea. Questo controllo è importante per distinguere la morte di fondo dalla citotossicità specifica delle cellule effettrici.
    5. Lava le cellule co-colture e colorale con il colorante vitale FVS780 diluito in 1x PBS (diluizione finale 1:5000). Incubare per 15 minuti a 4 °C, protetto dalla luce. Lavare le cellule e risospendere il pellet cellulare finale in 600 μL di buffer PBS-F. Procedere con l'acquisizione della citometria a flusso per valutare la citotossicità specifica della cellula effettore.
      1. Eseguire la strategia di gating del citometro a flusso come segue: identificare le cellule target come cellule positive al colorante fluorescente (SSC-A contro CTV) e poi, all'interno di questa popolazione, calcolare la percentuale di cellule target morte (SSC-A contro FVS780, Figura supplementare 1C). Calcolare la Lisi Specifica sottraendo la morte cellulare spontanea target (%FVS780+ all'interno di CTV+ nella condizione solo target) dalla citotossicità specifica della cellula effettrice (%FVS780+ all'interno di CTV+ nella condizione di co-coltura effettore-bersaglio).
  2. Analisi cellulare in tempo reale (RTCA)
    NOTA: Il saggio RTCA è un metodo per valutare l'attività citotossica delle cellule effettrici rispetto alle cellule targetaderenti 26. La morte della cellula bersaglio viene rilevata come una differenza nel segnale di impedenza dovuta al distacco delle cellule dal pozzo della piastra E attivate nel dispositivo xCELLigence. Eseguire il test RTCA seguendo il protocollo raccomandato dal produttore per garantire prestazioni ottimali e riproducibilità del saggio.
    1. Subcoltura delle cellule target un giorno prima del test (Giorno -1) per assicurarsi che raggiungano una confluenza del 60%-80% entro il Giorno 0. Questo passaggio è fondamentale per mantenere le cellule in proliferazione attiva all'inizio dell'esperimento. Si preferisce utilizzare cellule bersaglio tra i passaggi 5-20, con un minimo di 1 settimana (3-4 passaggi) dopo lo scongelamento per garantire prestazioni ottimali delle cellule.
    2. Nel giorno 0, aggiungere con cura 50 μL di mezzo di coltura a ciascun po' della piastra E, attivare la piastra all'interno del dispositivo e acquisire il segnale di fondo. Poi, trasferire la piastra di nuovo sul cappuccio per la fase di semina delle celle.
    3. Contare le cellule target e trasferire il numero totale richiesto in un tubo pulito. Risospendere le cellule in un volume appropriato di mezzo colturale per raggiungere la concentrazione desiderata per la semina nella piastra E, e trasferire 100 μL di cellule bersaglio in ciascun pozzetto (qui 4 x 104 cellule MCF-7 come modello di linea cellulare tumorale aderente). Tieni la piastra all'interno del cappuccio a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per garantire un attacco uniforme delle celle bersaglio. Innesta la piastra all'interno del dispositivo a 37 °C in un incubatore aCO2 e avvia l'acquisizione in tempo reale (intervallo di acquisizione di 15 min per 22 ore).
      NOTA: Eseguire la titolazione della cellula target prima di utilizzare una nuova linea cellulare target, come suggerito dal produttore.
    4. Il giorno 1 (circa 20-22 ore dopo la semina delle cellule target), contare le cellule effettrici e risospenderle in un mezzo di coltura fresco, regolando la concentrazione cellulare per ottenere il rapporto effettore-obiettivo desiderato (E:T). Ad esempio, per ottenere un rapporto E:T di 10:1, si aggiungono 4 celle CIK da 10a 5 effettori a 4 celle target da 10 da4 MCF-7 per ogni pozzo.
    5. Preparare ogni condizione di trattamento in duplicati tecnici utilizzando una piastra sterile a U a 96 pozzi e bilanciarla per 15 minuti a 37°C. Erogare 50 μL della sospensione della cella effettore per ogni condizione utilizzando una pipetta multicanale. Riinserire la piastra E nello strumento e continuare l'acquisizione in tempo reale (intervallo di acquisizione di 15 minuti per 24 ore). Calcola la Lisi Specifica usando la seguente equazione:
      Equazione 1

Risultati

Il protocollo descritto qui fornisce un flusso di lavoro efficiente e robusto per l'espansione e l'ingegnerizzazione ex vivo delle celle effettrici da PBMC isolate, ovvero celle CAR-T e CIK. Questo metodo richiede una manipolazione cellulare minima e sfrutta la capacità di scambio gassoso dei dispositivi G-Rex, offrendo una migliore disponibilità di nutrienti e ossigenazione rispetto ai sistemi di coltura staticaconvenzionali 23,24. Un vantaggio chiave di questo protocollo è la sua scalabilità intrinseca da dispositivi su piccola scala a 24 pozzi (G-24), adatti per studi preclinici, a dispositivi più grandi da 6M (G-6M), compatibili con esigenze di produzione traslazionale o cliniche, senza richiedere modifiche al protocollo se non la scalabilità proporzionale.

Utilizzando questo protocollo, sia le cellule CAR-T che CIK sono state espanse con successo in parallelo da PBMC di donatore sano nei formati G-24 e G-6M, come descritto nelle Sezioni 2-4. Al termine del periodo di coltura, entrambi i tipi cellulari mostravano un'elevata espansione e vitalità di ripiegamenti, con una proliferazione comparabile tra i due formati di dispositivi (Figura 2, Tabella Supplementare 1, Tabella Supplementare 2), evidenziando la riproducibilità del protocollo su diverse scale di coltura.

Per validare la scalabilità dei dispositivi di coltura, le cellule effettrici sono state ulteriormente caratterizzate fenotipicamente e funzionalmente. Per le cellule CAR-T CD19, abbiamo quantificato l'espressione di CAR e valutato i sottoinsiemi CD4+ e CD8+, osservando una predominanza di cellule T CD19 CD8+ (Figura 3A-B, Tabella Supplementare 1). Per le cellule CIK, abbiamo valutato la frequenza delle popolazioni T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) e CIK (CD3+CD56+) (Figura 3D), così come l'espressione del recettore attivante NKG2D (Figura 3E, Tabella supplementare 2). Inoltre, abbiamo osservato fenotipi e espressioni complessivamente comparabili di specifici marcatori di popolazione tra i formati di coltura G-24 e G-6M sia per le cellule CAR-T che per quelle CIK. Lo stato di differenziazione sia dei prodotti cellulari CAR-T che CIK CD19 è stato analizzato tramite colorazione CD62L e CD45RA (Figura 3C-F, Tabella Supplementare 1, Tabella Supplementare 2), rivelando fenotipi simili di memoria ed effettori tra cellule coltivate nei formati G-24 e G-6M. Questi risultati dimostrano che l'espansione del processo non compromette l'integrità fenotipica o lo stato di differenziazione delle popolazioni cellulari effettrici ampliate.

Infine, per valutare la potenza funzionale, abbiamo utilizzato saghi di citotossicità specifica per target. Sia le cellule CD19 CAR-T che CIK espanse in entrambi i dispositivi hanno mostrato una potente attività citolitica, confermando il mantenimento delle proprietà funzionali su scala (Figura 4). Nel complesso, questi risultati supportano l'idoneità dei prodotti ampliati per applicazioni a valle nei modelli preclinici e potenzialmente nei test clinici.

Figura 2
Figura 2: Proliferazione e vitalità delle cellule CAR-T e CIK CD19. Le cellule CAR-T (n = 5) e CIK (n = 6) espanse da PBMC nelle placche G-24 e G-6M sono state raccolte rispettivamente al giorno 9 e al giorno 14 di espansione per effettuare il conteggio cellulare e la valutazione dell'aumento del pieghe (A-C) e della percentuale (B-D) delle cellule vitali. Gli istogrammi rappresentano l'espressione media ± deviazione standard (SD), e i punti indicano i singoli donatori (vedi Tabella Supplementare 1 e Tabella Supplementare 2 per i valori individuali). I dati sono stati analizzati tramite il test t a doppia coda (A-C) o il test di rango a coppie abbinate multiple a due code Wilcoxon (B-D), con correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (*p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: La valutazione del fenotipo delle cellule CD19 CAR-T e CIK si è ampliata nei dispositivi G-24 e G-6M. L'espressione delle molecole CAR sulle cellule CAR-T CD19 (n = 5) è stata analizzata tramite citometria di flusso per valutare (A) l'efficienza di trasduzione nei protocolli di espansione G-24 e G-6M, nonché l'espressione delle sottopopolazioni (B) CD4+/CD8+ e (C) naive/memory nel sottoinsieme CD3+CAR+. Il fenotipo delle cellule CIK di massa (n = 6) è stato analizzato tramite citometria a flusso per indagare (D) la percentuale di CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) e T (CD3+CD56-), nonché l'espressione di (E) NKG2D e (F) la sottopopolazione ingenua/memoria nel sottoinsieme CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Naïve (CD45RA+CD62L+), memoria centrale (CM, CD45RA-CD62L+), memoria effettore (EM, CD45RA-CD62L-) e memoria effettore CD45RA-positivo (EMRA, CD45RA+CD62L-). Gli istogrammi rappresentano l'espressione media ± SD, e i punti indicano donatori singoli (vedi Tabella Supplementare 1 e Tabella Supplementare 2 per valori individuali). I dati sono stati analizzati tramite il test t a doppia coda (B-C-D-F) o il test di rango abbinato di Wilcoxon a due code (A-E), con correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (*p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Valutazione della citotossicità delle cellule CAR-T e CIK CD19. (A) La lisi specifica delle cellule CAR-T CD19 (arancioni, n = 5) o delle cellule non trasdotte (UTD) (grigie, n = 5) contro la linea cellulare Raji del linfoma di Burkitt (come modello di linea cellulare a sospensione) è stata eseguita tramite un saggio di uccisione basato su citometria a flusso di 6 ore. I risultati sono mostrati come la lisi specifica media ± SD. (B) La citotossicità delle cellule CIK coltivate in G-24 (azzurro chiaro, n = 7) o G-6M (blu scuro, n=6) contro la linea cellulare MCF-7 del cancro al seno (come modello di linea cellulare aderente) è stata monitorata ogni 15 minuti per 24 ore utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale. I risultati sono mostrati come la lisi specifica media ± SEM. I dati sono stati analizzati tramite test di Mann-Whitney, correzione di Holm-Sidak per confronti multipli (*p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Strategia di gating utilizzata per le analisi della citometria a flusso. Grafici rappresentativi che illustrano le strategie di gating per (A) la caratterizzazione fenotipica delle cellule CAR-T e (B) la caratterizzazione fenotipica delle cellule CIK, e (C) il saggio di citotossicità basato su coloranti fluorescenti. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 1: Crescita, vitalità e fenotipo delle colture di cellule CAR-T CD19 da donatori individuali. Per ciascun donatore vengono mostrati il numero totale di cellule, l'aumento della piega, la vitalità e la caratterizzazione fenotipica delle cellule T CD19-CAR prelevate al giorno 9 di coltura in dispositivi G-24 e G-6M. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 2: Crescita, vitalità e fenotipo delle colture cellulari CIK da singoli donatori. Il numero totale di cellule, l'aumento del piegamenti, la vitalità e la caratterizzazione fenotipica delle cellule CIK prelevate al giorno 14 di coltura in dispositivi G-24 e G-6M sono mostrati per ciascun donatore. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Questo protocollo delinea l'implementazione di una piattaforma efficiente e scalabile per la generazione di due diversi prodotti ACT, ovvero le celle CAR-T e CIK, da PBMC che utilizzano sistemi di coltura G-Rex. Abbiamo implementato saghi funzionali e fenotipici proof-of-concept per validare la scalabilità dell'approccio. Abbiamo dimostrato che sia il fenotipo che l'attività delle cellule espanse vengono mantenuti durante la scala, garantendo l'idoneità del sistema per applicazioni di ricerca e traduzione clinica diretta. Infatti, abbiamo dimostrato con successo che sia le cellule CAR-T che CIK possono essere espanse efficacemente con elevata resa cellulare, mantenendo un fenotipo funzionale dell'effettore e una potente citotossicità specifica per antigene su diversi dispositivi di coltura.

Combinato con la tecnologia a membrana permeabile al gas dei dispositivi di coltura, questo protocollo di espansione porta a una cinetica di espansione più rapida, riduce la maneggezione manuale e consente rese elevate e costanti tra i donatori. Queste caratteristiche rendono il protocollo altamente riproducibile e meno laborioso rispetto ai sistemi di colturastandard 20,21, che spesso comportano scambi multipli di media e un aumento del rischio di perdita e contaminazione cellulare.

Inoltre, questo protocollo consente una transizione fluida tra scale produttive: da sistemi aperti su piccola scala (G-24, adatto per la ricerca preclinica e lo screening, ad esempio di costrutti CAR, combinazioni di citochine o variabilità del donatore) a sistemi aperti su scala più ampia (G-6M, per la validazione pre-GMP), e infine a sistemi chiusi su scala più ampia (per la produzione GMP). Come descritto in questo studio, la progressione da sistemi aperti su piccola scala a sistemi aperti su scala più ampia richiede solo aggiustamenti proporzionali di volumi e input di celle rispetto alla dimensione del dispositivo, il che rappresenta un vantaggio pratico significativo. Allo stesso modo, l'unica implementazione necessaria per la transizione da sistemi aperti a sistemi chiusi per la produzione GMP, e quindi per adattare il protocollo G-6M alla produzione su larga scala di GMP, è l'utilizzo di reagenti di grado GMP appropriati e dispositivi di sistema chiuso (G-10M-CS con una superficie di 10 cm2, corrispondente a un singolo pozzo G-6M, o G-100M-CS con una superficie di 100 cm², corrispondenti alla controparte aperta G-100M) senza ulteriori modifiche del protocollo stesso. Questi dispositivi chiusi si differenziano dai loro corrispettivi aperti per l'integrazione di connessioni sterili a tubi per la gestione automatica dei media, che funzionano in combinazione con una pompa per la movimentazione liquidi (GatheRex) per creare un ambiente completamente chiuso. Questo approccio a sistema chiuso elimina gli scambi manuali di supporti e riduce i rischi di contaminazione, rendendolo ideale per ambienti produttivi conformi alle GMP dove sterilità e riproducibilità sono fondamentali. In particolare, la scalabilità rappresenta una caratteristica fondamentale per colmare il divario tra la scoperta nelle prime fasi e la traduzione clinica, in particolare in contesti accademici o biotecnologici con risorse limitate.

Un'ulteriore implementazione di questo protocollo verso la piena conformità alle GMP dovrebbe considerare la transizione da supporti contenenti FBS a formulazioni senza siero/xeno-libere, in linea con le attuali tendenze normative della FDA e dell'EMA, al fine di eliminare la variabilità da lotto a lotto, eliminare potenziali rischi di contaminazione xenogenica e migliorare la conformitànormativa 27.

Inoltre, l'intervento minimo richiesto dal sistema di espansione proposto fornisce una piattaforma ideale per implementare il profiling fenotipicomultidimensionale 28, riducendo artefatti indotti dalla procedura che potrebbero confondere l'analisi fenotipica durante le procedure di produzione. Inoltre, oltre alle cellule CAR-T e CIK, il sistema potrebbe essere altamente adattabile ad altre popolazioni di linfociti e cellule immunitarie ingegnerizzate, ampliandone l'utilità nello sviluppodell'immunoterapia 29,30.

Sebbene il protocollo sia robusto e non richieda modifiche, alcuni passaggi sono particolarmente critici per il successo. Per l'espansione delle cellule CIK, il momento dell'aggiunta delle citochine è essenziale per garantire una differenziazione ed espansione ottimale. Per le cellule CAR-T, la trasduzione dovrebbe avvenire a 24 ore dall'attivazione per massimizzare l'efficienza, e le aliquote lentivirali dovrebbero essere scongelate solo una volta, poiché i cicli ripetuti di congelamento-scongelamento riducono significativamente l'efficienza dellatrasduzione 31.

La variabilità biologica tra le preparazioni cellulari primarie contribuisce naturalmente alle differenze nei tassi di espansione e nell'attività funzionale, riflettendo la diversità dei donatori. Questa inevitabile e intrinseca variabilità può essere gestita efficacemente effettuando espansioni parallele da parte di più donatori, garantendo risultati robusti e riproducibili tra gli esperimenti.

In conclusione, questo protocollo consente un'espansione rapida, scalabile e affidabile dei linfociti effettori funzionali direttamente dai PBMC, offrendo flessibilità sia per la ricerca in fase iniziale sia per la traduzione clinica su larga scala. Questo sistema può essere facilmente adattato a vari tipi cellulari e modifiche genetiche, fornendo una piattaforma versatile per lo sviluppo dell'immunoterapia.

Ringraziamenti

La costruzione CAR è stata fornita tramite MTA dallo St. Jude Children's Research Hospital. Questo lavoro è stato supportato dalla ScaleReady G-Rex Grant 2025; Università di Padova - SOMMAGGIO_BIRD24_01; Fondazione AIRC sotto 5x1000 2019 - ID. 22759 programma; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Questa ricerca ha ricevuto finanziamenti "Ricerca Corrente" dal Ministero della Salute italiano per coprire i costi di pubblicazione. Le figure sono state create con il software GraphPad Prism 9 e BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Brillante Buffer di TintaBD in Biologia566349
Anticorpo CD28, anti-umanoMiltenyi Biotech130-093-375Clone 15E8
Anticorpo CD3, anti-umanoMiltenyi Biotech130-093-387Clona OKT3
CD3 BV510BD in Biologia740147Clone UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Biolegend320808Clone 1D11
CD4 BV650BD in Biologia563875Clone SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD in Biologia563429Clone HI100
CD56 PEBiolegend318306Clone HCD56
CD62L FITCBD in Biologia555543Clone FREG-56
CD8 BV450BD in Biologia562428Clone RPA-T8
Kit di proliferazione delle cellule violette CellTraceThermoFisher scientificoC34557
Dimetilsolossido (DMSO)ThermoFisher scientificoD2650
Dulbecco & prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato (D-PBS)Sigma AldrichD5652
E-plate 16Agilent5469813001
Siero Fetale Bovino (FBS), ValoreThermoFisher ScientificA5256701
Stain di Vitalità Riparabile 780 (FVS780)BD in Biologia565388
Piastra G-Rex a 24 Pozzi  Wilson Wolf80192M
Piastra del pozzo G-Rex 6M  Wilson Wolf80660M
Soluzione buffer HEPESLonzaECM0180D
Il suo anticorpoMiltenyi Biotech130-120-718
Albumina umana 20%CSL Behring
Proteina ricombinante IL-15 umanaPeproTech200-15
Proteina ricombinante IL-7 umanaPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD in Biologia
LymphoprepTecnologie STEMCELL18060
MCF-7ATCCHTB-22Linea cellulare del cancro al seno  
Penicillina e StreptomicinaLonzaECB3001D
Soluzione fisiologica (0,9% Cloruro di sodio)Monico
Solfato di protaminaSigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Linea cellulare del linfoma di Burkitt  
IFN-gamma umana ricombinanteR& Sistemi D285-IF-100/CF
IL-2 ricombinante (Proleucina)Novartis
rhCD19-LuiInvitrogenA42607
Istituto Memoriale Roswell Park 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
L-Glutamina stabileLonzaECB3004D
Soluzione Trypan-BlueSigma AldrichT8154
Analisi delle celle in tempo reale xCELLigenceAgilent
Mezzo Cellulare Ematopoietico Privo di Siero X-VIVO 15Lonza02-053Q

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