Uso di equazioni per stimare le riserve totali di vitamina A utilizzando metodi isotopici stabili

Sommario

Il protocollo descrive equazioni per stimare le riserve totali di vitamina A (TBS) utilizzando la metodologia di diluizione isotopica del retinolo, e viene presentata una breve panoramica sull'uso dell'analisi compartimentale basata su modelli con un disegno di studio super-soggetto per stimare TBS di gruppo e singolo.

Abstract

I metodi di isotopi stabili per stimare quantitativamente le riserve totali di vitamina A (TBS) si basano sul principio della diluizione isotopica. In breve, viene somministrata una singola dose orale ^{di vitamina A}2 H- o ¹³vitamina C marcata a un individuo, e le concentrazioni plasmatiche di retinolo marcato e non marcato vengono misurate tramite spettrometria di massa in un tempo predefinito dopo la somministrazione, solitamente 14-21 giorni. Il TBS viene calcolato utilizzando l'equazione di diluizione isotopica del retinolo (RID) o l'equazione del bilancio di massa. Le equazioni RID e bilancio di massa richiedono informazioni sull'attività specifica del retinolo nel plasma (SA_p; cioè rapporto tracciatore/traccia), ottenute tramite misurazioni di spettrometria di massa. Entrambe le equazioni richiedono valori di coefficienti per tenere conto dell'assorbimento e della conservazione della dose orale di retinolo stabile marcato con isotopi al momento della stima del TBS. I valori pubblicati per i coefficienti possono essere utilizzati nelle equazioni. In alternativa, il TBS può essere determinato tramite analisi compartimentale basata su modelli di dati cinetici del retinolo plasmatico utilizzando software di simulazione, analisi e modellazione WinSAAM. In breve, un progetto di studio super-soggetto con analisi compartimentale basata su modelli di dati cinetici del retinolo plasmatico può essere utilizzato per determinare i valori TBS di gruppo e specifici della popolazione per il coefficiente composito (FaS), che viene successivamente utilizzato nell'equazione RID per determinare i singoli TBS. Il disegno super-soggetto richiede una stima dell'apporto medio di vitamina A dietetica per il gruppo di partecipanti e un prelievo di sangue in ~11-16 punti temporali su ~28-91 giorni, con 5-7 partecipanti per momento temporale, ma ogni partecipante fornisce solo 2-3 campioni di sangue. La concentrazione di vitamina A epatica può essere stimata dalla TBS, utilizzando un'ipotesi della proporzione di TBS trovata nel fegato e una stima del peso epatico. Lo stato della vitamina A viene valutato confrontando la concentrazione stimata di vitamina A al fegato con i valori di soglia proposti per categorizzare lo stato lungo l'intero continuum, dalle riserve di vitamina A carenti a quelle in eccesso.

Introduzione

I metodi isotopici stabili forniscono una stima quantitativa delle riserve totali di vitamina A nel corpo (TBS) e possono essere utilizzati per valutare lo stato di vitamina A di bambini e adulti in contesti^{comunitari 1}. Poiché forniscono una stima quantitativa della TBS su tutto il continuum dello stato, dalle riserve carenti a quelle in eccesso, sono considerate i migliori metodi indiretti per valutare lo stato della vitamina A negli^{esseri umani 1}. Al contrario, le concentrazioni sieriche di retinolo o proteine leganti al retinolo sono comunemente utilizzate per valutare lo stato; tuttavia, non riflettono le riserve di vitamina A nel corpo, a meno che non siano molto basse, poiché il retinolo sirico è sotto controllo omeostatico; inoltre, diminuiscono temporaneamente durante l'infiammazione, complicando l'interpretazione dei risultati nelle popolazioni con alti tassi di^{infezione 2}. Il test di risposta alla dose relativa modificata (MRDR) fornisce una stima dell'adeguatezza delle riserve di vitamina A al fegato, ma non fornisce una stima quantitativa^{della concentrazione} 2 di vitamina A epatica. Generalmente, i metodi degli isotopi stabili sono utilizzati per studiare il metabolismo della vitamina A e stimare l'impatto degli interventi sulla vitamina A nelle popolazioni a rischio di^carenza 3,4,5,6,7,8,9,10. Sono inoltre utili per valutare il rischio di eccessi di riserve di vitamina A nelle popolazioni esposte a molteplici fonti di vitamina A, come alimenti fortificati, integratori ad alto dosaggio di vitamina A e/o polveri di^{micronutrienti 1,11}. Queste applicazioni sono importanti per comprendere meglio il metabolismo della vitamina A durante tutto il ciclo vitale, affinare i requisiti di vitamina A e valutare l'efficacia e la sicurezza degli interventi legati alla vitamina A che mirano a migliorare la nutrizione e i risultati di salute tra bambini e donne in età riproduttiva nelle comunità con poche risorse. Il TBS viene stimato utilizzando la metodologia della diluizione isotopica del retinolo (RID) e sia l'equazione RID sia l'equazione del bilancio di massa. In alternativa, il TBS può essere stimato tramite analisi compartimentale basata su modelli di dati cinetici del retinolo del plasma utilizzando il software WinSAAM Simulation, Analysis, and Modeling (www.winsaam.org) con un design^{super-soggetto 12}. In breve, questi metodi richiedono 1) la somministrazione di una singola dose orale di vitamina A marcata con isotopi stabili ai partecipanti, 2) la raccolta di 1-2 campioni di sangue ~14-21 giorni dopo la somministrazione degli isotopi per i metodi RID (o la raccolta di 2-3 campioni di sangue per partecipante tra 28 e 91 giorni, e una stima dell'apporto medio di vitamina A dietetica del gruppo per un'analisi compartimentale basata su modelli), e 3) accesso a uno spettrometro di massa appropriato (GC-C-IRMS, GC/MS, LC/MS/MS) per misurare le concentrazioni plasmatiche di retinolo marcato e non marcato.

Questo protocollo è pensato per fornire indicazioni ai nuovi utenti della metodologia RID su come calcolare il TBS utilizzando sia l'equazione RID sia l'equazione del bilancio di massa. Inoltre, viene presentata una breve panoramica sull'uso dell'analisi compartimentale basata su modelli con un disegno di studio super-soggetto per stimare la TBS per un gruppo di partecipanti allo studio e per singoli partecipanti; tuttavia, i dettagli sulla modellazione compartimentale dei dati cinetici del retinolo plasmatico sono al di fuori dell'ambito di questo manoscritto (per maggiori informazioni su questo approccio, vedi Green et ^al.12). Per una panoramica dei metodi con isotopi stabili della vitamina A, vedi Lietz et ^al.1.

Equazione RID per stimare TBS
L'equazione RID viene utilizzata quando viene somministrata una dose orale di vitamina A stabile marcata con isotopi a un individuo, mentre LC/MS/MS o GC/MS viene utilizzata per misurare il retinolo marcato e non marcato nel plasma al fine di ottenere l'attività specifica del retinolo nel plasma (SA_p) (cioè il rapporto tracce/tracee nel plasma^)13,14. Un singolo campione di sangue a ~14-21 giorni dalla somministrazione dell'isotopo è necessario per stimare la TBS usando l'equazione del RID. L'equazione RID mostrata qui sotto è utilizzata per stimare la TBS in adulti e ^{bambini 15:}

TBS = Fa × S × (1/SA_p)

dove TBS è μmol di vitamina A, Fa è la frazione della dose orale di tracciante di vitamina A che viene assorbita e presente nelle riserve corporee al tempo t, e S è il rapporto tra l'attività specifica del retinolo nel plasma (SA_p) e quella nelle scorte (SA₎ al tempo t. La SA_p è l'attività specifica del retinolo plasmatico, espressa come frazione della dose nel plasma: (retinolo marcato / non marcato + retinolo marcato) nel plasma / dose orale di retinolo marcato (μmol)⁾¹². Si noti che il contributo del retinolo non marcato al retinolo totale nel denominatore è trascurabile 14-21 giorni dopo la somministrazione dell'isotopo, quando di solito si stima la TBS. Per una discussione dettagliata dell'equazione RID, vedi Green et ^al.12.

Poiché i coefficienti Fa e S sono moltiplicati nell'equazione RID, sono comunemente chiamati coefficienti compositi FaS. I valori pubblicati per il coefficiente composito FaS, basati su adulti e bambini teorici con un'ampia gamma di TBS, sono disponibili più volte dopo il dosaggio isotopico (Tabella 1; adattato da Green e^{Green 15}). Questi valori possono essere utilizzati nell'equazione RID per calcolare il TBS di individui provenienti da popolazioni simili¹⁵. In alternativa, l'analisi compartimentale basata su modelli dei dati cinetici del retinolo plasmatico può essere utilizzata per determinare valori specifici della popolazione per il coefficiente composito FaS^12,16.

Equazione del bilancio di massa per stimare TBS:
L'equazione del bilancio di massa viene utilizzata per calcolare la TBS quando viene somministrata una dose orale di vitamina A marcata con ¹³C a un individuo, mentre il GC-C-IRMS viene utilizzato per misurare l'arricchimento ^{a 13}C (¹³C/C totale) nel siero^10,17. L'equazione del bilancio di massa richiede due campioni di sangue: un campione di base per misurare l'abbondanza naturale di ¹³C nel siero, e un secondo campione 14 giorni dopo la somministrazione per la misurazione dell'arricchimento ^{di 13}C nel siero. Tuttavia, se un ricercatore è interessato a stimare la TBS media per un gruppo di individui, il prelievo di sangue di base può essere effettuato su 5-6 partecipanti, e l'abbondanza media ^{di 13}C per quegli individui può essere utilizzata come stima dell'abbondanza di ¹³C nel siero di base per gli individui del gruppo. L'abbondanza naturale di ¹³C è ~1,1%, ma poiché può variare con la dieta, dovrebbe essere misurata accuratamente in siero al punto di base per correggere l'abbondanza ^{post-dose di 13}C, come mostrato in un esempio sotto¹⁰. L'equazione del bilancio di massa richiede misurazioni dell'abbondanza isotopica (¹³C/C totale) per: 1) la dose di ¹³vitamina A (F_a) marcata con C, 2) il retinolo sierico di base (F_b) e 3) il retinolo sierico post-dose (F_c). Le misurazioni di abbondanza isotopica vengono utilizzate per calcolare il rapporto tracciato-traccia e successivamente il TBS. Ulteriori fattori sono inclusi nell'equazione per tenere conto dell'assorbimento e dell'immagazzinamento della dose di ^{vitamina A marcata con 13}C al momento della valutazione TBS. Per una discussione dettagliata dell'equazione del bilancio di massa, vedi Gannon e Tanumihardjo¹⁰.

L'equazione del bilancio di massa mostrata di seguito è utilizzata per stimare la TBS in adulti o bambini:

TBS = a x (1/TTR) x (fattore per assorbimento x fattore per lo stoccaggio)

dove TTR è il rapporto tracciatore siero-traccia. Il fattore a tiene conto della perdita del tracciante di vitamina ^{A 13}marcato con C tra il momento della dosazione e il campionamento del sangue, ed è calcolato come ^e-kt, dove k = ln(2)/emivita del retinolo, e t = giorni dalla dose¹⁰. Si assume che il fattore di assorbimento della dose tracciante sia 0,8-1,0 (80%-100%) per gli adulti, o 0,75-0,9 (75%-90%) per i bambini^{di 10} anni. Il fattore per la conservazione (il rapporto tra TTR nel siero e le scorte) si assume essere 0,8 quando l'apporto di vitamina A nella dieta non è controllato durante il periodo di 14 giorni tra il dosaggio e il campionamento del sangue, oppure 1,0 quando l'apporto di vitamina A nella dieta è basso e^{controllato 10}.

Stima della concentrazione di vitamina A epatica
La riserva epatica totale di vitamina A può essere stimata in base alla proporzione di TBS presente nel fegato. Si presume che ~50% della TBS sia nel fegato quando lo stato di vitamina A è basso e ~80% quando lo stato di vitamina A è adeguato; Queste ipotesi si basano su dati limitati che mostrano che la vitamina A epatica in percentuale della vitamina A del corpo totale dipende dallo stato di vitamina A e può variare da ~40% al 90%^18,19. Sono necessari più dati per determinare come stimare meglio la vitamina A epatica come percentuale della vitamina A totale del corpo. Fino ad allora, le informazioni nella Tabella 2 possono essere utili per stimare lo stato di vitamina A di una popolazione studiata, al fine di determinare se assumere un valore del 50% o dell'80%. Inoltre, se la prevalenza delle concentrazioni seroniche di retinolo <0,7 μmol/L è del ≤10% tra i bambini dai 6 ai 59 mesi, si presume che lo status di vitamina A della popolazione sia adeguato; si noti che questo limite si sovrappone alla categoria OMS di carenza di vitamina A come problema lieve di salute pubblica (Tabella 2^)20,21. La concentrazione di vitamina A epatica viene calcolata dalle riserve epatiche totali in base al peso epatico, che può essere stimato come il 3% del peso corporeo per i bambini e il 2,4% del peso corporeo per gli^{adulti 22} anni. In alternativa, il peso epatico può essere stimato utilizzando l'area superficiale corporea (BSA) e un'equazione^{previsionale 23}.

Panoramica dell'analisi compartimentale basata su modelli con un design super-soggetto per stimare TBS di gruppo e individuali
L'analisi compartimentale basata su modelli può essere utilizzata per studiare la cinetica individuale del retinolo con campionamento frequente, ma si è rivelata particolarmente utile in popolazioni dove il campionamento frequente non è fattibile, come bambini piccoli e in età prescolare, e potenzialmente donne in gravidanza e allattamento, in contesti comunitari con poche risorse 11,24,25,26,27. L'analisi compartimentale basata su modelli viene utilizzata con un disegno di studio super-soggetto per prevedere la TBS per il gruppo di partecipanti e per stimare i valori specifici della popolazione per il coefficiente composito FaS, che possono poi essere utilizzati per determinare la TBS dei singoli partecipanti con l'equazione^{RID 12,24}. Il design super-soggetto viene utilizzato in contesti comunitari per minimizzare il numero di campioni di sangue raccolti da ogni^{singolo 12, 24, 26}. Un esempio del disegno è mostrato nella Tabella 3 per uno studio di 91 giorni con 105 soggetti e 16 tempi di prelievo di sangue. In questo esempio, ogni soggetto ingerisce una singola dose orale di vitamina A marcata da isotopo stabile e fornisce un campione di sangue 14 giorni dopo la somministrazione per stimare il TBS di ciascun individuo utilizzando l'equazione RID con il valore FaS derivato dal modello a 14 giorni; e un secondo campione di sangue in una delle restanti 15 volte per ottenere i dati cinetici del retinolo plasmatico richiesti per l'analisi compartimentale basata su modelli. In questo disegno, sono assegnati 7 individui a ciascuno dei 15 tempi aggiuntivi di prelievo del sangue. Generalmente, 5 partecipanti per volta sono considerati sufficienti, ma poiché alcuni partecipanti potrebbero perdere un orario assegnato per il prelievo del sangue, si raccomanda di fare ~7 individui per volta. Il plasma viene analizzato tramite spettrometria di massa per ottenere misurazioni del retinolo marcato e non marcato, e si calcola la frazione della dose isotopica di vitamina A nel plasma (FD_p). In breve, la media geometrica_{di FD p} rispetto al tempo viene rappresentata e adattata a un modello compartimentale utilizzando il software^WinSAAM 12,24,26. Un esempio di modello a 8 compartimenti per il metabolismo della vitamina A a tutto il corpo è mostrato nella Figura 1¹⁵. Il modello include compartimenti che rappresentano la vitamina A plasmatica (compartimento 5) e due pool di stoccaggio di vitamina A intercambiabili (compartimenti 6 (grande) e 7 (piccolo)). La somma della massa della vitamina A nei due compartimenti di stoccaggio scambiabili viene utilizzata come stima del TBS:

TBS (μmol) = M(6) + M(7)

dove M(I) è μmol vitamina A nel compartimento I

I valori specifici della popolazione per i coefficienti Fa e S possono essere calcolati in qualsiasi momento (t) durante la durata di uno studio sui super-soggetti utilizzando le seguenti equazioni^12,24:

Fa_t = F(6)_t + F(7)_t

S_t = SA_pt / SA_st = [F(5)_t / M(5)] / {[F(6)_t + F(7)_t] / [M(6) + M(7)]}

dove Fa_t è la frazione della dose di tracciante ingerita assorbita e presente nelle scorte al tempo t; F(I)_t è una frazione della dose tracciante presente nel compartimento I al tempo t; S_t è l'attività specifica nel plasma rispetto alle magazzine al tempo t; L'AC è l'attività specifica del retinolo sia nel plasma (p) sia nelle riserve (s) al momento t; e M(I) è μmol vitamina A nel compartimento I. Vedi Green et ^al.12 per una discussione dettagliata sull'analisi compartimentale basata su modelli.

Protocollo

I dati sono ipotetici; Nessun partecipante umano è stato coinvolto in questo studio.

1. Stima TBS usando l'equazione RID

1. Per stimare TBS usando l'equazione RID, si utilizzano i seguenti dati ipotetici dei partecipanti:
   Età: 25 anni
   Concentrazione di retinolo marcato nel plasma: 0,0163 μmol/L
   Concentrazione di retinolo non marcato nel plasma: 1,154 μmol/L
   Dose di vitamina A con etichetta orale: 6,838 μmol RE
   Coefficiente composito FaS pubblicato a 14^{giorni 15}: 0,727
   NOTA: La quantità della dose isotopica di vitamina A si basa sull'attività della vitamina A del composto di vitamina A marcato ^(disolito 2 H o ¹³acetatopi di retinile marcato con C) ed è espressa come μmol retinolo equivalente (RE). Ad esempio, se si usa ²H 6-acetato di retinile per la dosazione orale e si desidera una dose di 2000 μg RE, la dose di ²H_6-acetato di retinile viene calcolata sulla base dei pesi molecolari di ²H_6-acetato di retinile (328,49 μg/μmol) e ²H_6-retinolo (292,49 μg/μmol): 2000 x (328,49/292,49) = 2246 ^{μg 2}H₆-Acetato di retinile. La dose di 2000 μg di RE espressa in μmol si calcola dividendo la dose (μg RE) per il peso molecolare di ²H_6-retinolo: 2000/292,49 = 6,838 μmol.
2. Calcola SA_p usando l'equazione qui sotto:
   SA_p = [retinolo marcato / (retinolo marcato + retinolo non marcato) nel plasma] / dose (μmol)
   Usa i dati dei partecipanti sopra per risolvere l'equazione:
   SA_p = [0,0163 / (0,0163 + 1,154)] / 6,838 = 0,0020 μmol
3. Calcola TBS usando l'equazione RID mostrata di seguito:
   TBS = FaS x (1/SA_p)
   Usa i dati dei partecipanti sopra per ottenere il valore FaS e il valore_{SA p} calcolato dal passo 2:
   TBS = 0,727 x (1/ 0,0020) = 364 μmol

2. Stima TBS usando l'equazione del bilancio di massa

1. Per stimare la TBS utilizzando l'equazione del bilancio di massa, si utilizzano i seguenti dati ipotetici dei partecipanti:
   Età: 4 anni
   F_a (2 carboni etichettati più abbondanza naturale): 0,11
   F_b: 0,010745
   F_c: 0,0110476
   Dose applicata del tracciante: 1,0 μmol RE
   Fattori per l'assorbimento e lo stoccaggio:
   Assorbimento: 0,8
   Conservazione: rapporto di TTR nel siero rispetto al fegato (dieta non controllata): 0,8
   NOTA: per il dosaggio viene utilizzata ^{vitamina A}marcata_{13 C 2}, e l'abbondanza isotopica della dose (F_a) è calcolata come: ([¹³C₂] etichettata nella sintesi + abbondanza naturale (¹³C/20C totale⁾¹⁰. Il valore assunto per l'assorbimento in questo esempio è 0,8; un valore compreso tra 0,8 e 1,0 può essere selezionato in base a fattori che possono influenzare l'assorbimento della vitamina A nella popolazione studiata (ad esempio, i tassi di infiammazione/infezione possono ridurre^{l'assorbimento 1}). Si noti che F_a qui non è lo stesso del coefficiente Fa nell'equazione del RID.
2. Calcola il rapporto Tracer-Tracee (TTR) usando l'equazione mostrata di seguito:
   TTR = (F_{c-F b})/(F_{A-F c})
   dove, F_a = ^{abbondanza isotopica di 13}C nella dose ^{di vitamina A marcata con 13}C; F_b = ¹³C abbondanza isotopica di retinolo sierico alla linea basale; F_c = ¹³C Abbondanza isotopica del retinolo sirico dopo la somministrazione
   Usa i valori di F_a, F_b e F_c dai dati dei partecipanti sopra per calcolare TTR:
   TTR = (0,0110476 - 0,010745) / (0,11 - 0,0110476) = 0,003058035
3. Poi, calcola 1/TTR
   1/TTR = 1 / 0,003058035 = 327,01
4. Successivamente, calcola il fattore a usando l'equazione qui sotto:
   Fattore A = ¹³dose di vitamina A marcata con C (μmol) x ^e-kt
   1. Per prima cosa, calcola k usando l'equazione mostrata qui sotto:
      K=Ln(2)/Emivita del retinolo
      Il logaritmo naturale di 2 (ln(2)) è uguale a 0,693147181; L'emivita del retinolo è stimata in 32 giorni* nei bambini; Utilizzando queste informazioni, calcolare Okay
      k= 0,693147181 / 32 = 0,021660849
      *i valori stimati sono utilizzati per l'emivita del retinolo (32-136 giorni per i bambini; 140 giorni per gli adulti); oppure i valori possono essere stimati in base al tasso di decadimento della dose tracciante negli individui di un gruppo di controllo durante lo studio ^3,10.
   2. Successivamente, calcola ^e-kt, dove t è il tempo (giorni dalla dosazione dell'isotopo; t = 14 giorni per l'equazione del bilancio di massa). Usa queste informazioni con il valore calcolato per k dal passo 4.1:
      ^e-kt = ^{e-0,02166 x 14} = 0,738413073
   3. Infine, calcolare il fattore a, utilizzando l'equazione mostrata di seguito, la quantità della dose isotopica dai dati dei partecipanti sopra (1,0 μmol) e il valore calcolato per ^e-kt
      Fattore A = ¹³dose di vitamina A marcata con C (μmol) x ^e-kt
      Fattore A = 1,0 x 0,738413073 = 0,738413073
5. Calcola TBS utilizzando l'equazione del bilancio di massa mostrata di seguito:
   TBS = un x (1/TTR) x fattore per assorbimento x fattore per lo stoccaggio
   Usa il fattore calcolato a (0,738413073) e il valore calcolato di 1/TTR (327) dai passaggi sopra, e i valori fissi per assorbimento (0,8) e stoccaggio (0,8):
   TBS = 0,738413073 x 327 x 0,8 x 0,8 = 155 μmol

3. Stima della vitamina A epatica

1. Per calcolare le riserve totali di vitamina A epatica e la concentrazione di vitamina A, utilizzare i seguenti dati dei partecipanti:
   Età: 25 anni
   Peso: 61,0 kg
   Altezza: 156,8 cm
   TBS: 364 μmol (stimato da RID)
   La prevalenza delle concentrazioni plasmatiche di retinolo <0,7 μmol/L nella popolazione studiata è del <2%.
2. Per prima cosa, calcola il peso del fegato in base all'area superficiale corporea (BSA) usando l'equazione mostrata di seguito:
   BSA (^{m 2}) = sqrt [peso corporeo (kg) x altezza (cm)/3600]
   Usa i dati dei partecipanti sopra per calcolare la BSA:
   BSA (^{m 2}) = sqrt [61,0 x 156,8/3600] = 1,63 m²
3. Successivamente, calcola il peso del fegato usando l'equazione appropriata mostrata qui sotto e il valore BSA calcolato sopra:
   Se l'area superficiale corporea (BSA) è <1:
   Peso epatico (g) = 772 (g/^{m 2}) x superficie corporea (BSA) - 38
   Se l'area superficiale corporea (BSA) è ≥1:
   Peso epatico (g) = 772 (g/^{m 2}) x superficie corporea (BSA)
   Calcolare la BSA usando l'equazione mostrata di seguito; (nota che BSA è ≥1 rispetto al passo 2 sopra):
   Peso epatico (g) = 772 (g/^{m 2}) x superficie corporea (BSA)
   Peso epatico (g) = 772 (g/^{m 2}) x 1,63 m² = 1258 g
4. Infine, calcola la concentrazione di vitamina A epatica usando l'equazione mostrata di seguito:
   Concentrazione di vitamina A epatica = TBS (μmol) * proporzione di TBS trovata nel fegato/peso epatico (g)
   Utilizzare il valore TBS dai dati dei partecipanti sopra (364 μmol) e un valore assunto di 0,8 per la proporzione di TBS trovata nel fegato (lo stato di vitamina A della popolazione dello studio è considerato adeguato in base alla prevalenza del basso retinolo sierico <2%) e al valore calcolato del peso epatico (1258 g) sopra:
   Concentrazione di vitamina A nel fegato = 364 μmol * 0,8 / 1258 = 0,232 μmol/g di fegato

4. TBS previsto dal modello per il gruppo

1. Per calcolare la TBS prevista dal modello per il gruppo (popolazione dello studio) utilizzando un disegno di studio super-soggetto, utilizzare i seguenti risultati ipotetici di modellazione da uno studio con super-soggetti condotto tra donne in età riproduttiva (per dettagli su questo approccio, vedi Green et ^al.15):
   Output ipotetico del modello:
   M(6) = 973,281 μmol
   M(7) = 55,7646 μmol
2. Calcola TBS per il gruppo utilizzando l'output del modello super-soggetto fornito e l'equazione qui sotto:
   TBS = M(6) + M(7)
   Usa la massa di vitamina A nei compartimenti 6 e 7 (dall'output del modello):
   TBS = 973,281 + 55,7646 = 1029 μmol
   NOTA: Un esempio di come calcolare i valori del coefficiente composito FaS basandosi sull'output del modello è al di fuori dell'ambito di questa panoramica. Per ulteriori informazioni, vedi Green et ^al.12,15.

Risultati

Questo protocollo presenta esempi di come stimare quantitativamente la TBS in adulti o bambini utilizzando la metodologia della diluizione isotopica del retinolo e sia l'equazione RID sia l'equazione del bilancio di massa. L'equazione RID viene utilizzata quando si usano ²H o ¹³vitamina A marcata con C per il dosaggio, mentre LC/MS/MS o GC/MS vengono usati per misurare le concentrazioni plasmatiche di retinolo marcato e non marcato. L'equazione RID richiede informazioni sull'attività specifica del retinolo plasmatico (rapporto tracciatore-tracciatore) utilizzando le misurazioni della spettrometria di massa, la dose orale di vitamina A marcata (μmol RE) e un valore per il coefficiente composito FaS. Sono disponibili valori pubblicati per il coefficiente composito FaS ; In alternativa, i valori specifici della popolazione possono essere stimati tramite modellazione compartimentale basata su modelli dei dati cinetici del retinolo plasmamico. L'equazione RID viene solitamente applicata tra ~14 e 21 giorni dopo la dose, ma può essere applicata successivamente se è disponibile un valore corrispondente per il coefficiente composito FaS . Il valore del TBS per l'esempio mostrato qui era di 364 μmol.

L'equazione del bilancio di massa viene utilizzata quando si usa vitamina A marcata ^{con 13}C per il dosaggio, e GC-C-IRMS viene utilizzata per misurare l'abbondanza di ^{isotopi 13}C nel plasma. L'equazione del bilancio di massa richiede il rapporto tracciato/traccia (misurato l'abbondanza isotopica ^{di 13}C nel plasma) e i valori dei fattori (coefficienti) per tenere conto dell'assorbimento e dell'immagazzinamento della dose di ^{vitamina A marcata con 13}C al momento della valutazione TBS. I valori pubblicati per i coefficienti sono disponibili per l'uso nell'equazione. L'equazione del bilancio di massa viene applicata 14 giorni dopo la dosazione. Il valore di TBS per l'esempio mostrato qui era di 155 μmol.

L'analisi compartimentale basata su modelli di dati cinetici del retinolo plasmatico con un design super-soggetto viene utilizzata per stimare la TBS per un gruppo di partecipanti allo studio e per determinare i valori del coefficiente FaS per la successiva determinazione della TBS per singoli partecipanti. La TBS per il gruppo è calcolata come la massa di vitamina A nelle riserve di vitamina A intercambiabili dell'organismo; e la TBS per i singoli partecipanti allo studio viene calcolata 14 giorni dopo la somministrazione e/o in tempi successivi utilizzando il valore specifico di attività del retinolo plasmatico (SA_p) di ciascun partecipante e il corrispondente valore derivato dal modello per il coefficiente FaS nel tempo o nei momenti scelti con l'equazione RID. Il valore di TBS per l'esempio mostrato qui era di 1029 μmol.

I risultati della TBS possono essere interpretati convertendo la TBS in concentrazione di vitamina A epatica e confrontando le concentrazioni di vitamina A con valori di soglia per categorizzare lo stato della vitamina A lungo il continuum; Si noti che i valori di soglia da negozi carenti a tossici proposti nel 2015 probabilmente verranno perfezionati man mano che saranno disponibili più^{dati 2}. La concentrazione di vitamina A nel fegato nell'esempio mostrato qui era di 0,232 μmol/g di fegato

Figura 1: Modello compartimentale per il metabolismo della vitamina A a tutto il corpo negli esseri umani. I cerchi rappresentano i compartimenti; i rettangoli sono elementi di ritardo; le frecce tra i componenti sono i coefficienti di trasferimento frazionari [L(I,J), ovvero la frazione di retinolo nel compartimento J trasferita ogni giorno al compartimento I] e i tempi di ritardo [DT(I), o giorni trascorsi nell'elemento di ritardo I]. Il Compartimento 1 è il sito di introduzione del tracciante ingerito (*) e della vitamina A alimentare [U(1)]. I componenti 1 - 4 rappresentano digestione, assorbimento e elaborazione del chilomicron fino all'assorbimento da parte degli epatociti (compartimento 4), con la successiva secrezione di retinolo legata alla proteina che lega il retinolo nel compartimento plasmatico 5, che è il sito di campionamento (triangolo). Il componente 8 consente un'assorbimento irreversibile del retinolo plasmatico da parte di tessuti da cui il retinolo non viene riciclato. Il retinolo nel plasma può anche scambiarsi con la vitamina A in 2 pozze extravascolari (un compartimento più grande 6 e un compartimento più piccolo 7), con i compartimenti 6 e 8 i siti di perdita irreversibile dal sistema. VA = vitamina A. Questa cifra è stata modificata rispetto^{a 15}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Valori stimati per il coefficiente composito FaS per adulti e bambini teorici in momenti selezionati. Si raccomandano 14 giorni o più per applicare l'equazione RID per la stima della TBS negli adulti. Abbreviazioni: GM = media geometrica; NA = non applicabile. Questa tabella è stata modificata rispetto^{a 15}. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Soglie di prevalenza della popolazione per la carenza di vitamina A. Abbreviazioni: VAD = carenza di vitamina A; MRDR = test di risposta alla dose relativa modificata; OMS = Organizzazione Mondiale della Sanità. Questa tabella è stata modificata rispetto^{al 21}. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Numero di partecipanti per volta per uno studio super-soggetto di 91 giorni. Il prelievo di sangue viene effettuato su tutti i partecipanti (n=105) al giorno 14, e ogni partecipante viene assegnato casualmente a un secondo punto temporale durante lo studio di 91 giorni, così che ci siano almeno 7 partecipanti alla volta e ciascuno fornisca un totale di 2 campioni di sangue. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

In sintesi, i metodi isotopici stabili forniscono stime quantitative della TBS in adulti e bambini e possono essere applicati in contesti^{comunitari 1}. La TBS di adulti e bambini può essere stimata utilizzando la metodologia di diluizione degli isotopi del retinolo con l'equazione RID o l'equazione del bilancio di massa. Sebbene entrambe le equazioni si basino sul principio della diluizione isotopica, ci sono alcune differenze. In breve, l'equazione RID richiede un singolo campione di sangue ed è applicata a ~14-21 giorni, ma può essere applicata anche in tempi successivi se è disponibile un valore corrispondente per il coefficiente composito FaS . I valori pubblicati per il coefficiente composito FaS sono disponibili in momenti diversi dopo la dosazione per l'uso nell'equazione^{RID 15}; In alternativa, i valori specifici della popolazione possono essere determinati tramite analisi compartimentale basata su modelli. L'equazione del bilancio di massa richiede 2 campioni di sangue, uno al punto di partenza e l'altro 14 giorni dopo la dose. Tuttavia, come già accennato, se la TBS media per un gruppo viene stimata, il prelievo di sangue di base può essere effettuato in 5-6 partecipanti e l'abbondanza media ^{di 13}C per quegli individui può essere utilizzata come stima dell'abbondanza di ¹³C nel siero.

Quando si applica l'equazione del RID, considerazioni importanti includono l'espressione della dose come attività di vitamina A (μmol RE) invece che μmol dell'estere retinilico marcato, e se si utilizzano valori pubblicati per il coefficiente FaS , è importante selezionare valori di FaS derivati da una popolazione simile (bambini o adulti) e che corrispondano al momento (giorno di studio) in cui la SA_p è stata misurata per stimare il TBS. Quando si applica l'equazione del bilancio di massa, è fondamentale considerare l'abbondanza naturale ^{di 13}°C nella dose di vitamina A marcata ^{con 13}°C e correggere l'abbondanza sirica ^{di 13}°C post-dose per l'abbondanza naturale di ¹³°C nel siero al momento di base, per ottenere stime accurate di TBS¹⁰.

La modellazione compartimentale basata su modelli viene utilizzata con un disegno di studio super-soggetto in contesti comunitari per stimare i valori TBS di gruppo e specifici per popolazione per il coefficiente composito FaS durante la durata dello^{studio 12,24}. Un vantaggio di questo approccio è che i valori derivati dal modello per il coefficiente composito FaS probabilmente forniranno una stima più accurata della TBS per gli individui del gruppo rispetto a un valore pubblicato derivato da una popolazione diversa. Questo approccio offre anche maggiore flessibilità per la tempistica del prelievo del sangue negli studi sul campo. Ad esempio, se un partecipante non è disponibile al momento assegnato per il prelievo di sangue RID, il campione potrebbe essere raccolto in un momento successivo e il corrispondente valore derivato dal modello per il coefficiente composito FaS potrebbe essere usato nell'equazione RID per stimare il TBS ^12,24.

I risultati della TBS possono essere interpretati convertendo la TBS in concentrazione di vitamina A epatica e confrontando i valori con i limiti proposti per la concentrazione di vitamina A epatica per categorizzare lo stato di vitamina A lungo l'intero continuum, da riserva carente a^{tossica 2}. Sebbene i limiti proposti suggerissero che >1 μmol/g di fegato indichi ipervitaminosi A, studi recenti non hanno mostrato effetti avversi tra 1 e 3 μmol/g, e che le alterazioni istopatologiche compaiono a >3 μmol/^{g 11,28}. Sono necessari ulteriori dati sulle concentrazioni di vitamina A nel fegato e sui loro effetti fisiologici negli esseri umani per affinare i valori di soglia per le categorie di stato subtossico e tossico.

Sebbene gli approcci isotopici stabili per valutare lo stato della vitamina A forniscano stime quantitative della TBS e siano considerati i metodi migliori per valutare lo stato, non sono ancora ampiamente utilizzati a causa del costo relativo elevato rispetto ad altri metodi di valutazione e dell'accesso limitato a: vitamina A marcata da isotopi stabili e competenze per preparare e somministrare dosi; spettrometria di massa e competenze per condurre analisi del plasma; competenza nella progettazione di studi e nell'applicazione di equazioni per stimare TBS; e competenza nell'analisi compartimentale basata su modelli di dati cinetici del retinolo plasmatico. Per i nuovi utenti, la consulenza/collaborazione da esperti è fondamentale durante le fasi di pianificazione, implementazione e analisi di uno studio per garantire il successo.

Nonostante le difficoltà, negli ultimi anni ci sono stati progressi nella metodologia degli isotopi stabili che hanno facilitato il loro utilizzo in contesti^{comunitari 12,29}. Studi futuri che adotteranno questa metodologia probabilmente genereranno nuove informazioni importanti sul metabolismo e le esigenze della vitamina A durante tutto il ciclo vitale, sulla bioefficacia dei carotenoidi della provitamina A dietetica e sull'efficacia e sicurezza degli interventi per migliorare lo status della vitamina A nelle popolazioni a rischio di carenza.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Excel	Microsoft	Microsoft Excel
Calcolatrice scientifica Texas Instruments TI-30XIIS	Texas Instruments	TI-30XIIS