Articolo metodologico

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 dicembre 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive l'espressione e la quantificazione delle sottounità dei recettori neuronali dell'acetilcolina nicotinica utilizzando la linea cellulare Neuro-2a dei mammiferi. I tag fluorescenti sensibili al pH e la microscopia confocale permettono una valutazione precisa della localizzazione dei recettori nella membrana plasmatica rispetto a quelli espressi nei compartimenti intracellulari a pH neutro, facilitando lo studio del traffico e della modulazione farmacologica della nAChR.

Abstract

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La quantificazione dei recettori neuronali dell'acetilcolina nicotinica (nAChR) espressi sulla membrana plasmatica delle cellule mammiferiche è importante per lo sviluppo di nuove terapie selettive per il bersaglio e per lo studio delle proteine chaperone che modulano il traffico dei recettori. Questo studio presenta un solido insieme di metodologie per esprimere sia nAChR omomeriche che eteromeriche nelle cellule Neuro2a (N2a) di mammiferi e per quantificarne la localizzazione superficiale rispetto a quella intracellulare utilizzando tag fluorescenti sensibili al pH. pHuji e pHluorina supereclittica (SEP) sono proteine sensibili al pH che possono essere ingegnerizzate per etichettare proteine ricombinanti, permettendo la visualizzazione della distribuzione spaziale delle subunità di nAChR. Questi tag fluorescenti emettono a pH neutro ma vengono raffreddati in ambienti acidi. Per tracciare la localizzazione relativa interna rispetto alla membrana plasmatica delle subunità nAChR α7, α4 e β2, o pHuji o SEP sono attaccati al C-terminale di ciascun costrutto di DNA. Per esprimere α7-pHuji insieme al suo chaperone NACHO, ovvero (α4-SEP; β2-pHuji) nelle cellule N2a, viene utilizzato un reagente di trasfezione di DNA a base di lipidi. Il reagente di trasfezione e il DNA plasmidico vengono incubati separatamente in un mezzo sirico ridotto a temperatura ambiente, quindi combinati per formare complessi lipidi-DNA che facilitano la somministrazione di plasmidi nelle cellule. Dopo l'incubazione, le cellule vengono fotografate tramite microscopia confocale a cellule vive sia in condizioni di pH alto che basso sia in presenza di un ligando fluorescente selettivo per sottotipi. Le immagini vengono analizzate utilizzando la fluorescenza cellulare totale corretta nei canali fluoroforonici rilevanti, fornendo informazioni quantitative sulla distribuzione delle subunità nAChR marcate fluorescentmente tra la membrana plasmatica e i compartimenti intracellulari. L'imaging confocale a cellule vive consente il monitoraggio in tempo reale della localizzazione delle subunità nAChR per distinguere le differenze tra popolazioni interne e di recettori superficiali. L'espressione robusta della membrana plasmatica di α7-pHuji o (α4-SEP; β2-pHuji) si ottiene entro 24 ore a 37 °C. Questo metodo può essere adattato per includere chaperoni aggiuntivi, sottounità ausiliarie o liganti fluorescenti per lo studio del traffico di nAChR, della modulazione farmacologica e delle alterazioni legate alla malattia nell'espressione di nAChR.

Introduzione

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I recettori neuronali dell'acetilcolina nicotinica (nAChR) sono canali ionici transmembrana dipendenti da ligando espressi sulla membrana plasmatica di molti tipi cellulari, inclusi neuroni, cellule gliali e cellule immunitarie. Questi recettori sono composti da α (α2-α10) o β (β2-β4) subunità che si assemblano per formare sottotipi omomerici o eteromerici, con α7 e α4β2 nAChR i più abbondanti nelcervello 1,2. La disregolazione di questi sottotipi è stata associata al morbo di Alzheimer, al disturbo da uso di nicotina, all'epilessia ipermotoria legata al sonno, al morbo di Parkinson e al disturbo depressivo maggiore, tra altre condizioni neurologiche epsichiatriche 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Metodi rapidi e affidabili per esprimere e quantificare le nAChR sono essenziali per comprendere i meccanismi delle malattie e per sviluppare terapie selettive per target. Tuttavia, ottenere un'espressione solida di questi recettori nella membrana plasmatica è spesso impegnativo e richiede molto tempo. Il metodo descritto qui consente una forte espressione superficiale di nAChR entro circa 24 ore dopo la trasfezione di DNA e può essere combinato con liganti o proteine chaperone che modulano il traffico dei recettori.

Esistono diversi approcci per l'espressione delle nAChR, tra cui la trasfezione transitoria di DNA o la generazione di linee cellulari stabili che esprimono il sottotipo desiderato. Sebbene la creazione di linee cellulari stabili sia utile per studi a lungo termine che coinvolgono lo stesso sottotipo di recettore, il processo è laborioso e può richiedere diversi mesi. Una volta stabilite, tali linee cellulari possono mostrare un'espressione variabile dei recettori attraverso i passaggi, perdita di espressione nel tempo o bias di selezione per cloni con funzioneo densità 13 dei recettori subottimali. Una riduzione della temperatura di incubazione da 37 °C a 30 °C, l'aggiunta di accompagnatori molecolari come la nicotina, o un tempo di incubazione prolungato possono favorire l'espressionesuperficiale 13,14,15. Queste limitazioni sono particolarmente evidenti per le nAChR eteromeriche, che richiedono un adeguato assemblaggio e traffico di subunità, e per studi focalizzati sulla regolazione dei recettori assistiti da chaperone. Pertanto, è necessaria una validazione di routine dell'espressione dei sottotipi di recettori attraverso i passaggi quando si lavora con linee cellulari stabili che esprimono nAChR.

Spesso, i ricercatori sono interessati alle varianti delle subunità nAChR e alle sottounità di chaperone o proteine ausiliarie e quindi devono esprimere una varietà di DNA in rapida successione per consentire una rapida flessibilità nei loro saggi. L'espressione transitoria di nAChR è vantaggiosa a questo punto di vista perché il processo può essere completato rapidamente, permettendo al ricercatore di studiare più sottotipi di recettori o condizioni sperimentali senza aspettare mesi per generare linee cellulari stabili. Un evento comune, anche con espressione transitoria, è che molti nAChR rimangono all'interno della cella 24 ore dopo l'induzione a 37 °C, richiedendo ulteriori periodi di incubazione di > 48ore 16,17. Ad esempio, senza la proteina chaperone resistente agli inibitori della colinesterasi (RIC)-3, solo ~1% delle α7 nAChR sono espresse sulla membrana plasmatica delle cellule SHE-P deimammiferi 18. Con la co-espressione di RIC-3, circa il 20% degli α7 nAChR viene rilevato sulla superficie. Sebbene ciò rappresenti un miglioramento, l'abbondanza totale dei recettori rimane bassa. La co-espressione di α7 nAChR con NACHO può ulteriormente aumentare l'espressione superficiale, anche se meno del 40% della popolazione totale di recettori si trasferisce allamembrana plasmatica 19. Un altro approccio prevede l'incubazione delle cellule trasfectate a 30 °C per migliorare l'espressione della membranaplasmatica 20,21. Per α4β2 nAChR, questa riduzione della temperatura produce una regolazione al rialzo cinque volte nella densità dei recettori superficiali senza alcun corrispondente aumento della proteina totaledella subunità 21. Tuttavia, questo miglioramento richiede almeno un giorno in più e un maggiore utilizzo di consumabili, reagenti e strumentazione.

Il lavoro presentato offre un insieme di metodi ottimizzati per esprimere e quantificare sottotipi specifici di nAChR entro 24 ore dopo la trasfezione nelle cellule N2a dei mammiferi, raggiungendo circa l'83% per α7, 77% per α4 e 56% per β2 subunità localizzate alla membrana plasmatica. Nel caso di α7 nAChR, l'espressione della membrana plasmatica può essere quantificata utilizzando α-bungarotossina (αBTX) marcata fluorescentmente con α7 o tramite marcatura fluorescente ricombinante. Per etichettare ogni sottounità, le proteine fluorescenti sensibili al pH pHuji e pHluorina supereclittica (SEP)22,23,24 sono ingegnerizzate sul C-terminale delle singole subunità nAChR25,26. pHuji e SEP sono varianti sensibili al pH delle proteine fluorescenti rosse e verdi, rispettivamente, che fluorescono a pH 7,4 ma vengono spense in condizioni più acide 27,28. Poiché la fluorescenza SEP e pHuji viene soppressa al pH < 6, qualsiasi segnale intracellulare osservato riflette fluorofori situati in compartimenti neutri piuttosto che sulla membrana plasmatica. Va notato che alcuni organelli, come l'apparato di Golgi, hanno un lumen acido; pertanto, i fluorofori attaccati alla regione C-terminale delle subunità nAChR non vengono rilevati mentre le subunità transitano attraverso la viasegretaria 29. La differenza tra la fluorescenza totale al pH 7,5 e quella al pH < 6 rappresenta il segnale generato dalle nAChR situate sulla membrana plasmatica. La cattura di immagini utilizzando microscopia confocale a celle vive garantisce un'elevata risoluzione spaziale, consentendo una quantificazione precisa della localizzazione delle subunità. Inoltre, eseguire tutti gli esperimenti su cellule vive permette a ciascuna cellula di fungere da proprio controllo, tenendo conto della variabilità nell'espressione proteica tra cellule all'interno di ciascun gruppodi trattamento 30. Questo metodo può essere ulteriormente adattato per includere proteine chaperone aggiuntive, come NACHO o altre, per indagare il traffico di nAChR. Applicazioni aggiuntive includono la modulazione farmacologica, l'incorporazione di subunità ausiliarie e l'analisi dei cambiamenti associati alla malattia nell'espressione di nAChR.

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Protocollo

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NOTA: La procedura seguente descrive metodi utilizzati con successo per trasfettare temporaneamente la linea cellulare N2a con le subunità nAChR (Figura 1). L'espressione robusta della membrana plasmatica si ottiene entro 24 ore, come catturato con la microscopia confocale a cellule vive.

figure-protocol-1
Figura 1: Presentazione schematica dei singoli metodi presentati nel protocollo. Le cellule vengono coltivate fino a raggiungere il 70%-80% di confluente nelle piastre di immagini. Le cellule vengono poi trattate con il reagente di trasfezione e il complesso di DNA. (Alto) 24 ore dopo, le cellule possono essere trattate con un ligando marcato fluorescente per etichettare le subunità espresse sulla membrana plasmatica e poi fotografate con un microscopio confocale. (In fondo) In alternativa, per i geni delle subunità nAChR modificati per essere marcati con una proteina sensibile al pH 24 ore dopo la trasfezione, le cellule possono essere fotografate vive utilizzando un microscopio confocale per catturare la fluorescenza totale delle cellule. Il buffer di imaging a pH 7,4 viene poi sostituito con il buffer di tempra a pH 5,5. Questo fermerà la fluorescenza delle proteine sensibili al pH marcate alle subunità nAChR situate sulla membrana plasmatica della cellula, permettendo che solo le subunità interne rimangano fluorescenti. Le stesse cellule vengono nuovamente visualizzate. L'analisi delle immagini viene eseguita utilizzando ImageJ per quantificare l'espressione delle subunità interne ed esterne. Queste procedure possono essere modificate per incorporare chaperone e proteine ausiliarie. Creato in BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Transfezione transitoria N2a nAChR

NOTA: La linea cellulare N2a è stata scelta perché presenta un fenotipo neuronale e una bassa espressione endogena di nAChR. I geni delle subunità α7-pHuji, α4-SEP e β2-pHuji sono ciascuno ospitato individualmente nel vettore di espressione pcDNA3.1(+) dei mammiferi. La proteina chaperone NACHO è espressa da pREP9 (generosamente donata dal Dr. R. Loring, Northeastern University). In ogni fase, utilizza tecniche sterili e lavora all'interno di un armadietto di biosicurezza. Indossa un camice da laboratorio pulito, occhiali di sicurezza e guanti. Pulire tutti i materiali che entrano o escono dall'armadietto di biosicurezza con etanolo al 70%. I passaggi seguenti descrivono la trasfezione in un vaso di vetro da 35 mm rivestito di poli-D-lisina, adatto per l'imaging. I volumi possono essere regolati secondo necessità per diverse navi di coltura.

  1. Coltivare cellule N2a in una fiaschetta di coltura T25 (o simile) contenente Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) integrata con siero bovino fetale al 10% (FBS) e, se necessario, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina. Incubare a 37 °C, 5% di CO₂ fino a raggiungere il ~90% di confluenza delle cellule. Visualizza usando un obiettivo da microscopio laser 4x.
  2. Monitorare la confluenza quotidianamente con un microscopio lucico e sostituire il substrato ogni 1-2 giorni per mantenere condizioni ottimali. Quando le cellule raggiungono il ~90% di confluenza, sono pronte per essere inviate nelle piastre di imaging.
  3. Preriscalda tutti i reagenti a 37 °C in un bagno d'acqua. Pulisci l'armadio di biosicurezza e tutti i materiali con etanolo al 70% prima di iniziare la procedura.
    ATTENZIONE: L'etanolo al 70% è un liquido e vapore altamente infiammabili che può causare una grave irritazione oculare. Evita calore, scintille, fiamme aperte e altre fonti di accensione. Conserva in un'area ben ventilata con contenitori ben chiusi. Indossa guanti protettivi e protezione per occhi/viso quando la manipolazioni. In caso di contatto con pelle o occhi, risciacqua immediatamente con acqua e cerca assistenza medica se persiste l'irritazione. Al suo posto si può utilizzare un disinfettante alternativo, come una soluzione di candeggina dal 5%-10%.
  4. Aspira il vecchio mezzo dalla fiaschetta e lava le cellule con 5 mL di PBS. Aggiungi 1 mL di tripsina alla fiaschetta e fai girare delicatamente. Incubare finché le cellule non si sollevano (<5 min). Per evitare la digestione eccessiva, aggiungere immediatamente 4 mL di mezzo EMEM e pipetta delicatamente per creare una sospensione a cellula singola.
  5. Utilizzando un emocitometro, si determina la concentrazione cellulare e calcola il volume richiesto di mezzo di crescita EMEM per regolare la sospensione in modo che 1 mL contenga 0,5-2 cellule 10⁵.
  6. Stampassa 1 mL di sospensione a celle per piatto da 35 mm e aggiungi abbastanza mezzo di crescita EMEM per portare il volume totale a 2 mL. Incubare durante la notte a 37 °C, 5% di CO₂. Le cellule sono pronte per la trasfezione con una confluenza del 70%-80%.
  7. Il giorno della trasfezione, preriscaldare i reagenti a 37 °C, scongelare completamente i DNA delle subunità nAChR e portare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente. Pulisci tutti i reagenti con etanolo al 70% prima di metterli nell'armadietto di biosicurezza.
  8. Per esprimere α7 nAChR: In un tubo microcentrifuga, diluire 4 μg di DNA plasmidico α7 (1 μg/μL) e 1 μg di DNA plasmidico NACHO (1 μg/μL) goccia a goccia in un mezzo siero ridotto (senza antibiotici) fino a un volume finale di 250 μL. Mescola delicatamente pipettando dopo l'aggiunta del DNA.
    1. Per esprimere α4β2 nAChRs: Diluire 4 μg di ciascuna sottounità di DNA in un totale di 250 μL di mezzo sirico ridotto. Mescola delicatamente con la pipetta. Regolare il rapporto di ciascuna sottounità per ottimizzare l'espressione delle isoforme specifiche dei recettori.
    2. Per esprimere α4β2 nAChR con un plasmide aggiuntivo, si aggiungono quantità uguali di ciascun DNA plasmide. La proteina fluorescente blu mTagBFP2³¹ presente in pcDNA3.1(+) funge da plasmide di controllo e può essere sostituita con qualsiasi chaperone α4β2.
  9. Mescola delicatamente il reagente per la trasfezione di DNA prima dell'uso. In un tubo separato per microcentrifuga, diluire 8 μL di reagente di trasfezione goccia per goccia in 250 μL di mezzo sirico ridotto. Incuba per 5 minuti a temperatura ambiente. Procedere al passo successivo entro 25 minuti.
  10. Dopo 5 minuti, si combinano i DNA diluiti con il reagente di trasfezione diluito (totale = 500 μL) goccia a goccia. Mescola delicatamente pipettando e incuba per 20 minuti a temperatura ambiente. I complessi DNA-lipidici rimangono stabili fino a 6 ore.
  11. Durante la formazione dei complessi, rimuovere le ciotole di coltura dall'incubatore e sostituire il mezzo con 1 mL di EMEM senza siero (senza antibiotici).
  12. Aggiungere 500 μL del complesso di reagente di trasfezione del DNA a goccia su ciascun piatto (volume finale = 1,5 mL). Mescola delicatamente dondolando il piatto per garantire una distribuzione uniforme sul piatto, in particolare sulla superficie del fondo di vetro. Incubare a 37 °C per 24 ore, poi sostituire il mezzo dopo 4-6 ore per promuovere la salute cellulare.

2. Marcatura delle cellule vive di α7 nAChR espressi in membrana plasmica usando αBTX Alexa Fluor 647

NOTA: La seguente procedura viene generalmente eseguita 24 ore dopo la trasfezione. Proteggere αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) dalla luce per prevenire la fotodistruzione del fluoroforo.

  1. Preriscaldare tutti i reagenti a 37 °C e scongelare la soluzione di stocco αBTX-AF647 (2,3 μM). Pulisci con etanolo al 70% e mettilo nell'armadietto di biosicurezza.
  2. Recupera la ciotola contenente le cellule trasfettate con DNA α7 e NACHO dall'incubatrice, pulisci l'esterno con il 70% di etanolo e mettila nell'armadietto di biosicurezza.
  3. Scartare il vecchio mezzo tramite aspirazione a vuoto. Per lavare le cellule, aggiungi 2 mL di nuovo mezzo EMEM per la crescita.
  4. Rimuovi il mezzo di lavaggio tramite aspirazione a vuoto. Aggiungi 2 mL di mezzo di crescita EMEM ai piatti.
  5. Sostituire la quantità appropriata di mezzo con αBTX-AF647 per ottenere una concentrazione finale di 80 nM. Incubare durante la notte a 37 °C.
  6. Al mattino, preriscalda PBS o un mezzo di imaging preferito e pulisci con etanolo al 70%. Trasferisci nell'armadietto di biosicurezza.
  7. Rimuovi le cellule trasfectate dall'incubatore, pulile e mettile nell'armadietto di biosicurezza.
  8. Rimuovi il vecchio mezzo contenente αBTX-AF647 e mettilo in un contenitore di rifiuti appropriato.
  9. Lava le celle con 2 mL di PBS per 3 volte, 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. I risciacqui rimuovono ligando e detriti non legati, e il tempo può essere modificato per soddisfare le esigenze del ricercatore. Rimuovi il PBS dopo ogni lavaggio.
  10. Aggiungi 2 mL di PBS o di un mezzo di imaging preferito e procedi con l'imaging delle cellule usando un microscopio confocale.

3. Imaging a cellule vive delle nAChR α7-pHuji totali e interne

NOTA: La procedura seguente utilizza un plasmide α7-pHuji pcDNA3.1 prodotto internamente, co-trasfetato con il chaperone NACHO. Un protocollo simile è stato utilizzato per esprimere α4-SEP e β2-pHuji in pcDNA3.1 con il plasmide di controllo mTagBFP2 pcDNA3.1, come descritto nella sezione Risultati. Proteggi i campioni dalla luce durante tutta la procedura per prevenire la fotodistruzione del fluoroforo.

  1. Preparare il tampone di imaging al pH 7,4 (Tabella 1) e il tampone di tempra al pH 5,5 (Tabella 2) comedescritto 23.
  2. Preriscaldare i reagenti a 37 °C, pulire con etanolo al 70% e trasferirlo nell'armadietto di biosicurezza. Rimuovi le cellule trasfectate dall'incubatrice, pulisci con il 70% di etanolo e mettile nell'armadietto di biosicurezza.
  3. Rimuovi il vecchio mezzo tramite aspirazione. Risciacqua il piatto con 2 mL PBS per 3 volte 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Aggiungi 2 mL di buffer di imaging pH 7.4.
  4. Porta il piatto al microscopio confocale. Inserire la piastra di imaging con tampone di pH 7,4 nel portavetri e posizionare il supporto nella camera ambientale preriscaldata sul microscopio confocale.
  5. Collega il tubo della pompa peristaltica al portapiatti per immagini e chiudi la camera.
  6. Apri il software di imaging e seleziona i laser per i fluorofori di interesse (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm e mTagBFP2 359/461 nm).
  7. Scansiona la parabola per localizzare le cellule da immagini usando un obiettivo 10x-60x. Aumenta l'ingrandimento se desiderato e regola la profondità di messa a fuoco secondo necessità.
  8. Regolare l'intensità del laser e la sensibilità del rilevatore per visualizzare la fluorescenza senza un segnale di fondo. Regolare l'apertura per aumentare il segnale di fluorescenza, se necessario.
  9. Seleziona la risoluzione preferita e cattura l'immagine singola usando l'obiettivo desiderato (ad esempio, 60x).
  10. Registra la posizione sulla mappa della parabola per spostare le stesse celle dopo il cambio del tampone al tampone di temprare pH 5.5.
  11. Ripeti il processo di imaging per diverse aree della parabola, registrando ogni nuova posizione. Usa le stesse impostazioni di cattura per tutte le immagini (gruppi sperimentali e di controllo) per consentire confronti validi.
  12. Mantenendo solo la linea di uscita collegata alla pompa peristaltica, aspira lentamente il tampone pH 7.4 dalla piattaforma in un contenitore di rifiuti.
  13. Quando la maggior parte del tampone viene rimossa (senza asciugare le cellule), trasferire la linea di ingresso al tampone di tempra a pH 5,5.
  14. Accendi la pompa peristaltica per aggiungere lentamente un tampone di pH 5,5 (1,5 mL/min) alla piatta, assicurandoti che le cellule rimangano attaccate.
  15. Fai funzionare la pompa per 20 minuti, osservando che il tampone scorra correttamente dentro e fuori dalla parabola.
  16. Spegni la pompa e incuba le cellule con il tampone di temprare pH 5,5 per ulteriori 20 minuti per permettere l'equilibrio.
  17. Per ripetere l'immagini, carichi le posizioni salvate dalla sessione precedente per tornare alle stesse regioni.
  18. Conferma che la profondità e la posizione focale siano corrette, poiché potrebbero spostarsi dopo lo scambio del buffer.
  19. Ripeti l'imaging in tutte le località salvate usando la condizione di pH-quenched.
ReagenteConcentrazione (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
D-glucosio1
Regolare la soluzione a pH 7,4

Tabella 1: Ricetta del tampone di immagini. I seguenti reagenti sono stati sommati insieme e la soluzione è stata regolata al pH 7,4.

ReagenteConcentrazione (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
D-glucosio1
Regola la soluzione a pH 5,5

Tabella 2: Ricetta per la tempina del tampone. I seguenti reagenti sono stati miscelati insieme e la soluzione risultante è stata regolata a un pH di 5,5.

4. Quantificazione dell'immagine

NOTA: Questa procedura spiega come analizzare le immagini cellulari utilizzando ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) e il metodo32 della fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF).

  1. Apri ImageJ e apri l'immagine da analizzare. L'immagine apparirà come una pila con ogni canale catturato separato nello stesso fotogramma.
  2. Naviga sul canale Fase. Se l'immagine è troppo luminosa (comune per aree vuote o di sfondo), seleziona Processa > Aumenta contrasto, poi clicca OK.
  3. Usando lo strumento della lente d'ingrandimento, ingrandisci (+) su una cella. Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, traccia il contorno della cella nel canale di fase.
  4. Passa al canale fluorescente corrispondente al fluoroforo di interesse. Imposta le misurazioni desiderate selezionando Analizza > Imposta Misurazioni. Assicurati che vengano controllati l'Area, il Valore Grigio Medio e la Densità Integrata .
  5. Per misurare la regione selezionata, scegli Analizza > Misura oppure premi Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. Fai tre misurazioni di fondo tracciando aree vuote vicino alla cella. Ripeti i passaggi per il numero desiderato di celle.
  7. I dati di misurazione appariranno in una finestra separata dei Risultati in ImageJ. Copia e incolla questi dati in Excel per l'analisi.
  8. Calcola la media di fondo media dalle tre misure di fondo.
  9. Calcola il valore CTCF per ogni cella usando la seguente formula:
    CTCF=Densità integrata−(Area della cella x Fluorescenza di fondo media)
  10. Ripeti questo processo per più cellule e immagini per ogni gruppo sperimentale (e per la condizione del pH, se applicabile). Esporta tutti i risultati in un software di analisi dei dati per l'elaborazione statistica.

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Risultati

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Seguendo le procedure di trasfezione sopra descritte, α7 nAChR e la proteina del chaperone NACHO sono stati co-espressi nelle cellule N2a. Sia le cellule non trasfettate che quelle trasfettate sono state marcate con αBTX-AF647 24 ore dopo la trasfezione del DNA. Poiché αBTX non è permeabile alla membrana, tutta la fluorescenza rilevata proviene dai recettori presenti sulla membrana plasmatica. Nella Figura 2A, A′, è stata osservata una debol...

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Discussione

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Le metodologie presentate per esprimere e quantificare le subunità di nAChR nelle cellule di N2a di mammiferi affrontano sfide di lunga data nel raggiungere un'espressione rapida (~24 ore) e abbondante di nAChR (> 60%) per studi di scoperta, localizzazione e traffico di farmaci. Un punto di forza chiave di questo insieme di protocolli è la sua adattabilità sia per nAChR omomerici (α7) che eteromerici (α4β2), e probabilmente è applicabile ad altri sottotipi di nAChR, insieme alla co-espre...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare James Janoso per la sua esperienza in microscopia tecnica e il Center for Transformative Research in Metabolism (National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health con il Premio Numero P20GM130443) per aver supportato il Microscopy Core presso l'Università dell'Alaska Fairbanks. Gli sforzi di LW sono stati parzialmente sostenuti dal finanziamento del Higher Education Investment Fund, fornito dallo stato dell'Alaska tramite l'Università dell'Alaska. Gli sforzi di SMS sono stati supportati dall'Institutional Development Award (IDeA) del National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health sotto il numero di sovvenzione P20GM103395. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Mental Health dei National Institutes of Health (MMW con il numero di premio R03MH135358) e dal National Institute of General Medical Sciences (MMW con il numero di premio R16GM150455) dei National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTA (1X) Gibco25200-056Reagente di distacco cellulare
Alpha-Bungarotoxin Alexa Fluor 647InvitrogenB35450Coniugato di alfa-bungarotossina
Cabinet di biosicurezza BSL-livello 1 & nbsp;NuaireNU-425-400Area di lavoro per colture cellulari sterili
Cloruro di calcioAventor/VWRBDH9224Componente buffer
D-(+)-GlucosioMilliPore Sigma G8270Componente buffer
EMEM con L-glutaminaATCC30-2003Mezzo cellulare
DNA privo di endotossineRealizzato in casa con kit ZymoNon applicabileDNA nAChR da utilizzare per trasfezioni transitorie cellulari
Tubi microcentrifughe privi di endotossina, 0,5 mL Aventor/VWR89000-010DNA e preparazione della trasfezione
Tubi microcentrifughe privi di endotossine, 1,5 mL Aventor/VWR20170-038DNA e preparazione della trasfezione
Siero bovino fetaleAventor/VWR97068-085Integratore siero
Fluoview FV10iOlympusFV10iMicroscopio Confocale
Piatti MatTek con fondo di vetroMatTekP35GC-0-10-CAntenni di imaging
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prismhttps://www.graphpad.com/featuresSoftware di analisi dei dati
HEPESMilliPore Sigma H3375Componente buffer
Lipofectamina 2000Invitrogen11668019Reagente di trasfezione
Cloruro di magnesio esaidratoTermoscientifica413410025Componente buffer
Idrato MESMilliPore Sigma M5287Componente buffer
mTagBFP2-pBADAddGene 54572DNA di controllo da utilizzare per la trasfezione di transitori cellulari  
Cellule Neuro 2 A (N2A)Collezione della Cultura di Tipo AmericanoCCL-131Cellule utilizzate per trasfezioni di DNA ed espressione di nAChR
Opti-MEMGibco31985-070Mezzo sirico ridotto
Penicillina/StreptomicinaAventor/VWRK952-100mLAntibiotico
Pompa per peristalsiGilsonMiniPuls3Il buffer cambia durante l'imaging  
Soluzione salina tamponata con fosfatoQualità Biologica119-069-131Buffer fisiologico
Aiuto a pipetteDrummond 140084Trasferimento preciso del liquido
Punte di pipette (sterili e senza endotossine, 1000uL)Rainin30389216Trasferimento preciso del liquido
Punte per pipette (sterili e prive di endotossine, 20uL)Rainin30389229Trasferimento preciso del liquido
Punte per pipette (sterili e prive di endotossine, 250uL)Rainin30389246Trasferimento preciso del liquido
Pipettes, P10Rainin & nbsp;L-10XLSTrasferimento preciso del liquido
Pipettes, P100Rainin & nbsp;L-100XLSTrasferimento preciso del liquido
Pipettes, P1000Rainin & nbsp;L-1000XLSTrasferimento preciso del liquido
Cloruro di potassioMilliPore Sigma P3911Componente buffer
Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 10 ML)Aventor/VWR89130-898Trasferimento preciso del liquido
Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 25 mL)Aventor/VWR89130-900Trasferimento preciso del liquido
Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 5 mL)Aventor/VWR76201-710Trasferimento preciso del liquido
Pipete sierologiche (sterili e prive di endotossine, 50 mL)Aventor/VWR75816-088Trasferimento preciso del liquido
Cloruro di sodioAventor/VWRBDH9286Componente buffer
Fiaschetta per coltura tissutaleFalcon353109Piatti in coltivazione
Kit Maxiprep per plasmidi ZymoPure IIRICERCA SU ZYMOD4203-A + D4203-BProduzione di DNA privo di endotossine
α 4-SET Servizi di sintesi genica ThermoFisher Scientific GeneArt    https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlServizi personalizzati di sintesi genica
α 7-pHujiTwist Biosciencehttps://www.twistbioscience.com/Servizi personalizzati di sintesi genica
β 2-pHujiServizi di sintesi genica ThermoFisher Scientific GeneArt    https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlServizi personalizzati di sintesi genica

Riferimenti

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