ML385 attenua la progressione maligna delle cellule di adenocarcinoma polmonare indotte dalla silice attraverso la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia

L'adenocarcinoma polmonare è la principale causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, con una stima di 2 milioni di nuovi casi e 1,76 milioni di decessi ogni anno¹. Negli ultimi anni, l'incidenza dell'adenocarcinoma polmonare tra le persone che non hanno mai fumato è aumentata, il che può essere correlato a fattori ambientali come l'inquinamento atmosferico². La silice è un inquinante ambientale comune ed è stata identificata come un potenziale fattore patogeno per l'adenocarcinoma polmonare umano³. La silice può causare un'infiammazione cronica persistente, che porta all'infiltrazione di macrofagi, linfociti e neutrofili e al rilascio di specie reattive dell'ossigeno e fattori infiammatori⁴. Questo microambiente infiammatorio a lungo termine favorisce l'insorgenza dell'adenocarcinoma polmonare ^5,6. Sebbene l'associazione tra l'esposizione alla silice e l'adenocarcinoma polmonare sia stata confermata, il suo meccanismo molecolare specifico non è stato completamente chiarito.

Il fattore di trascrizione NRF2, codificato dal gene NFE2L2, svolge un ruolo cruciale come regolatore principale nel mantenimento dell'omeostasi redox cellulare in risposta allo stress ossidativo ^7,8. In circostanze normali, NRF2 viene marcato e degradato dal complesso ubiquitina ligasi KEAP1-CUL3. Sotto la stimolazione dello stress ossidativo o di sostanze elettrofile, l'attività di KEAP1 viene inibita, consentendo a NRF2 di accumularsi stabilmente ed entrare nel nucleo, esercitando così il ruolo di difesa e regolazione del core⁹. Tuttavia, un'eccessiva attivazione di NRF2 nel microambiente tumorale può migliorare la glicolisi e la sopravvivenza delle cellule tumorali arrestando l'accumulo di ROS e aumentando la resistenza apoptotica^10,11. Gli studi hanno dimostrato che l'esposizione alla silice può provocare un'attivazione anomala della via di segnalazione NRF2 ^12,13. Pertanto, il targeting di NRF2 può essere una strategia efficace per intervenire nella progressione maligna dell'adenocarcinoma polmonare indotta dalla silice¹⁴.

Questo studio mira a chiarire se l'inibitore di NRF2 ML385 inibisce la progressione maligna indotta dalla silice dell'adenocarcinoma polmonare regolando la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia. Abbiamo stabilito un modello murino indotto da silice per riprodurre le caratteristiche chiave della malattia e abbiamo utilizzato metodi sperimentali in vitro per studiare l'interazione tra macrofagi e cellule tumorali. Abbiamo scoperto che la silice induce l'espressione di molecole infiammatorie e immunitarie e promuove ulteriormente la formazione di tumori attraverso la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia. Quando è stato utilizzato l'inibitore NRF2 (ML385), l'effetto promotore della silice sulla formazione del tumore è rallentato, suggerendo che l'inibitore NRF2 può svolgere un ruolo nel trattamento dei tumori polmonari indotti dalla silice.

Tutti i blocchi donatori sono stati ottenuti da campioni patologici d'archivio raccolti tra il 2016 e il 2018 presso l'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an NO.1 dell'Università di Medicina di Nanchino. I campioni sono stati resi anonimi prima dell'uso e processati in conformità con i protocolli approvati. Il comitato etico dell'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an No.1 dell'Università di Medicina di Nanchino, KY-2024-250-01. L'allevamento, lo smaltimento e l'applicazione di topi da esperimento seguono rigorosamente i regolamenti sulla somministrazione di animali da laboratorio e le linee guida internazionali.

Costruzione di un modello murino indotto da silice
Preparazione dei topi e sospensione di silice: Allevare topi maschi C57BL/6, di 6-8 settimane, in una stanza per animali con una temperatura ambiente di 20-25 °C e un ciclo di 12 ore luce / 12 ore buio. Per preparare la sospensione di polvere di silicio, 300 mg di polvere di polvere di silicio sono stati pesati con precisione e sospesi in 10 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato. Successivamente, la miscela è stata vigorosamente vorticata e fatta oscillare per 5 minuti, quindi trattata con gli ultrasuoni in una macchina ad ultrasuoni a bagno d'acqua per 30 minuti per garantire una dispersione uniforme delle particelle e prevenire l'aggregazione. La concentrazione finale di questa sospensione di riserva è di 30 mg/mL. Sterilizzarlo in autoclave a 121 °C per 30 min. Prima di ogni utilizzo, è necessario agitare e agitare nuovamente per 2-3 minuti per risospendere eventuali particelle depositate.

I topi hanno inalato la sospensione di silice attraverso il naso. La micropipetta è stata utilizzata per introdurre lentamente e goccia a goccia la soluzione nella cavità nasale dei topi. I topi sono stati divisi in 6 gruppi con 20 topi in ogni gruppo. Il volume di inalazione di ciascun gruppo è stato di 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL e 200 μL, con una concentrazione di 30 mg/mL, una volta al giorno per 40 giorni consecutivi. Durante la perfusione, afferrare la pelle dietro l'orecchio del mouse con il pollice e l'indice della mano sinistra e fissare il corpo e la coda del mouse con le altre dita. Assicurarsi che il mouse sia in posizione supina con la testa leggermente inclinata all'indietro per consentire alla sospensione di essere inalata naturalmente nelle vie respiratorie. Abbiamo scoperto che non c'è stato alcun evento di morte dopo il secondo giorno di inalazione di 10 μL, 30 μL, 50 μL e 70 μL di sospensione di silice nei topi, mentre c'è stato un evento di morte dopo il secondo giorno di inalazione di 90 μL e 200 μL di sospensione di silice nei topi. Pertanto, il volume massimo di inalazione di silice nei topi era di 70 μl al giorno.

La manipolazione della silice cristallina deve essere effettuata in una cabina di biosicurezza o in una cappa aspirante e durante tutto il processo devono essere indossate maschere N95, occhiali antipolvere, guanti in nitrile e indumenti protettivi. Quando si prepara la sospensione, i movimenti devono essere delicati e deve essere utilizzata una camera di pesata per evitare la generazione di aerosol. Tutti i rifiuti a contatto con la silice devono essere raccolti in contenitori sigillati con resistenza alla perforazione e smaltiti in conformità con le normative per i rifiuti chimici pericolosi. È severamente vietato mescolarlo con rifiuti generici o versarlo nella fogna. I rifiuti biologici, come il terreno di coltura cellulare, devono essere raccolti in appositi bidoni contenenti disinfettanti e sterilizzati ad alta pressione. Le carcasse e i tessuti degli animali devono essere collocati in sacchetti per rifiuti biologici e sterilizzati ad alta pressione per un trattamento innocuo.

Valutare il successo del modello murino indotto dalla silice. Valutare gli animali in diversi momenti dopo l'inalazione di silice, vale a dire il 3°, 14° e 40° giorno. I topi sono stati inseriti in dispositivi professionali per l'eutanasia animale e l'anidride carbonica è stata introdotta a una velocità di riempimento del 30%-50% in volume / min. Erano continuamente esposti fino a quando non smettevano di respirare. Dopo aver confermato la morte, sono state effettuate le operazioni successive. Il tessuto polmonare è stato rimosso. Il tessuto polmonare è stato fissato in una soluzione di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 48 ore. Dopo la fissazione, il tessuto è stato disidratato con alcol gradiente, reso trasparente con xilene e quindi incorporato in paraffina. Le sezioni continue sono state realizzate utilizzando una sezionatrice a paraffina con uno spessore di 4-5 μm per la successiva colorazione istologica e l'analisi immunoistochimica. Il tessuto polmonare non necessita di trattamento di decalcificazione. È stato condotto un esame patologico del tessuto polmonare per valutare il successo della generazione del modello. I criteri di successo della costruzione del modello di silicosi erano i seguenti: infiammazione polmonare significativa, fibrosi e insorgenza di noduli di silicosi.

Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel modello murino indotto da silice
I tessuti polmonari dei topi al giorno 14 dopo l'inalazione di silice sono stati colorati con marcatori fluorescenti contenenti CD3e (rapporto di diluizione 1:200), CD8a (rapporto di diluizione 1:200), CD86 (rapporto di diluizione 1:200), F4/80 (rapporto di diluizione 1:200) e Nk1.1 (rapporto di diluizione 1:200) per visualizzare le cellule immunitarie. Fissare sezioni cellulari o tissutali e bloccare con albumina sierica bovina (BSA) al 5% per 1 ora per ridurre il legame aspecifico. Utilizzare siero normale della stessa specie di origine dell'anticorpo bloccante, diluire il siero con PBS in rapporto 1:10 e aggiungere 100 μl di siero diluito al campione. Quindi, bloccare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire al siero di bloccare gli anticorpi endogeni. Dopo la sigillatura, risciacquare delicatamente 2 volte con PBS. Gli anticorpi primari contenenti CD3e (rapporto di diluizione 1:200), CD8a (rapporto di diluizione 1:200), CD86 (rapporto di diluizione 1:200), F4/80 (rapporto di diluizione 1:200) e Nk1.1 (rapporto di diluizione 1:200) sono stati incubati per una notte a 4 °C o a temperatura ambiente per 1-2 ore. Dopo il lavaggio con PBS, l'anticorpo secondario fluorescente è stato aggiunto e incubato al buio per 1 ora.

Colorazione di Masson e analisi immunoistochimica
Le sezioni di paraffina sono state decerate con xilene e idratate con alcol gradiente, quindi il recupero dell'antigene è stato effettuato in tampone citrato di sodio con pH 6,0 mediante bonifica termica ad alta pressione. Per la bonifica termica ad alta pressione, posizionare le fette di tessuto imbevute di tampone di riparazione in un forno a microonde a fuoco medio per 8-12 minuti. L'attività endogena della perossidasi è stata bloccata con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti, quindi il sito di legame non specifico è stato bloccato con BSA al 5% a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere gli anticorpi primari NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) e VDAC1 (1:500) e incubare per una notte a 4 °C. Dopo aver lavato 3 volte con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra marcato con HRP (1:500) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Le sezioni di paraffina sono state sottoposte a colorazione DAB, controcolorazione con ematossilina, trasparenza della disidratazione e sigillatura con gel neutro per ottenere i corrispondenti risultati di immunoistochimica molecolare. Quando il DAB viene utilizzato per lo sviluppo del colore, lo sviluppo moderato del colore deve essere da giallo brunastro a marrone brunastro e lo sfondo deve essere chiaro. Sia lo sviluppo eccessivo (marrone scuro) che quello insufficiente (giallo chiaro) del colore richiedono l'ottimizzazione del tempo di sviluppo del colore.

Il grado di fibrosi polmonare è stato analizzato semi-quantitativamente utilizzando il metodo di punteggio di Ashcroft¹⁵: le sezioni macchiate di Masson sono state osservate al microscopio con ingrandimento 100x e il tessuto polmonare è stato diviso casualmente in 8 regioni. Ogni regione è stata valutata in base al grado di fibrosi (0-8 punti), con il punteggio finale che è la media di tutte le regioni: 0 punti (tessuto polmonare normale), 1-2 punti (fibrosi lieve), 3-4 punti (fibrosi moderata), 5-8 punti (fibrosi grave).

I risultati immunoistochimici sono stati analizzati quantitativamente utilizzando il software Image. Sono stati selezionati casualmente cinque campi ad alto ingrandimento e il valore medio di densità ottica (MOD) di ciascun campo è stato misurato come indicatore del livello di espressione proteica.

Esame dell'impatto della silice e di ML385 sull'autofagia e sui ROS nelle cellule RAW264.7
Entrambe le cellule RAW264.7 e A549 (fornite dall'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui) sono state coltivate utilizzando DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di soluzione di anticorpi bispecifici penicillina-streptomicina. Le cellule 1 x 10⁷ sono state coltivate uniformemente in un incubatore a temperatura costante a 37 °C e 5% di CO₂. 5 μL di sospensione di silice da 30 mg/mL sono stati aggiunti a 1 x 10⁵ cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo l'incubazione per 24 ore, le cellule sono state risciacquate con PBS 3x e l'autofagia e lo stress ossidativo sono stati rilevati da sonde ROS, LC3 e lisosomi. Allo stesso tempo, ML385¹⁶, un inibitore di NRF2, è stato utilizzato per inibire l'espressione di NRF2 (concentrazione finale di ML385: 5 mM/L). L'autofagia e lo stress ossidativo sono stati rilevati secondo le fasi sperimentali di cui sopra. Lo stress ossidativo e il flusso autofagico dei due gruppi sono stati analizzati statisticamente.

Analisi immunoistochimica delle espressioni di VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 nel tessuto dell'adenocarcinoma polmonare
Le espressioni di VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 sono state controllate in 30 pazienti. I tessuti con adenocarcinoma polmonare e i tessuti sani adiacenti sono stati ottenuti dall'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an NO.1 dell'Università di Medicina di Nanchino e sono stati analizzati mediante immunoistochimica (IHC). I risultati dell'IHC e della fibrosi polmonare sono stati analizzati statisticamente. Raccogli i dati dei pazienti in base alle informazioni sui pazienti nel sistema ospedaliero. Le fasi sperimentali specifiche sono le seguenti: le sezioni di paraffina sono state decerate con xilene e idratate con alcol gradiente, quindi la bonifica dell'antigene è stata eseguita in tampone citrato di sodio con pH 6,0 mediante bonifica termica ad alta pressione. L'attività endogena della perossidasi è stata bloccata con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti, quindi il sito di legame non specifico è stato bloccato con BSA al 5% a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere gli anticorpi primari NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) e VDAC1 (1:500) e incubare per una notte a 4 °C. Dopo aver lavato 3 volte con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra marcato con HRP (1:500) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Sviluppo del colore DAB, controcolorazione dell'ematossilina, trasparente disidratato, sigillatura della gomma neutra. Quando il DAB viene utilizzato per lo sviluppo del colore, lo sviluppo moderato del colore deve essere da giallo brunastro a marrone brunastro e lo sfondo deve essere chiaro. Sia lo sviluppo eccessivo (marrone scuro) che quello insufficiente (giallo chiaro) del colore richiedono l'ottimizzazione del tempo di sviluppo del colore.

Analisi della migrazione e dell'invasione cellulare
È stato studiato l'effetto di ML385 e del surnatante derivante dalla co-incubazione di silice con cellule RAW264.7 sulla migrazione e l'invasione cellulare dopo essere stati incubati con la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare A549. Il surnatante delle cellule RAW264.7 co-coltivate con silice per 24 ore è stato aggiunto alle cellule A549. Le celle sono state divise nel gruppo della silice, nel gruppo della silice+ML385 e nel gruppo PBS. Il gruppo silice: 5 μL di sospensione di silice da 30 mg/mL sono stati aggiunti a 1 x 10⁵ cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il surnatante cellulare per un uso successivo. Il gruppo silice+ML385: 5 μL di sospensione di silice da 30 mg/mL e una concentrazione finale di 5 mM/L ML385 sono stati aggiunti a 1 x 10⁵ cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il surnatante cellulare per un uso successivo. Gruppo PBS: 5 μL di PBS sono stati aggiunti a 1 x 10⁵ cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il surnatante cellulare per un uso successivo. Durante il test scratch, le cellule A549 sono state prima seminate in piastre a 12 pozzetti a una densità di 5 x 10⁵ per pozzetto. Dopo che le cellule sono cresciute fino al 95%-100% di fusione, sono stati praticati dei graffi sulle cellule monostrato utilizzando la punta di una pipetta sterile da 200 μl. Le cellule esfoliate sono state lavate via delicatamente con PBS. Successivamente, le condizioni di coltura sono state modificate per includere l'1% del terreno di base FBS e i surnatanti di ciascun gruppo di trattamento per mantenere la vitalità cellulare durante il periodo sperimentale di 7 giorni. Le immagini della stessa posizione sono state raccolte al microscopio invertito rispettivamente alle ore 0 (Giorno 0) e al 7° Giorno (Giorno 7) dopo il graffio. Infine, l'area del graffio è stata analizzata quantitativamente e il tasso di chiusura del graffio è stato calcolato utilizzando il software ImageJ per valutare l'effetto del surnatante di diversi gruppi di trattamento sulla capacità di migrazione delle cellule A549.

Nelle cellule che passano attraverso pori di dimensioni specifiche, è stata utilizzata una camera a membrana in policarbonato da 8 μm, con la membrana della camera superiore pre-rivestita di gel che simula l'ambiente extracellulare diluito a un rapporto di 1:8 per costruire una barriera di membrana basale. Le cellule A549 sono state risospese in una sospensione ottenuta mescolando un terreno privo di siero con i surnatanti di ciascun gruppo di trattamento in un rapporto 1:1 e quindi inoculate nella camera superiore (2 x 10⁴ cellule per camera). Nella camera inferiore, è stata aggiunta una soluzione ottenuta miscelando un mezzo contenente il 20% di FBS con i surnatanti dei corrispondenti gruppi di trattamento (gruppo Silica+ML385, gruppo Silica e gruppo PBS) nella stessa proporzione come attrattivo chimico. I surnatanti dei corrispondenti gruppi di trattamento sono stati raccolti mediante aspirazione attraverso una pistola pipettata in RAW264.7 Fagocitosi cellulare di silice. Dopo che le cellule sono state incubate continuamente a 37 °C e CO₂ al 5% per 7 giorni, le cellule non invasive nella camera superiore sono state rimosse con tamponi di cotone e le cellule che erano penetrate nella membrana e hanno raggiunto la camera inferiore sono state fissate con paraformaldeide al 4% e colorate con cristallovioletto allo 0,1%. Infine, il numero di cellule invasive è stato selezionato casualmente da 5 campi visivi mediante un microscopio ottico.

Analisi dell'impatto della silice e di ML385 sull'apoptosi delle cellule A549 mediante citometria a flusso
Preparazione e raggruppamento cellulare: sono state raccolte A549 cellule trattate con i surnatanti di ciascun gruppo di trattamento (gruppo PBS, gruppo silice, silice + gruppo ML385). Le cellule sono state lavate delicatamente 2 volte con PBS pre-raffreddato, quindi risospese in un tampone di legame 1x e la densità cellulare è stata regolata a 1 x 10⁶ cellule per provetta/100 μL. Quindi, 5 μL di annessina V-FITC e 5 μL di soluzione colorante PI sono stati aggiunti alla sospensione cellulare, delicatamente agitati per mescolarsi e incubati a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, 400 μl di tampone legante 1x sono stati aggiunti a ciascuna provetta e immediatamente testati sulla macchina. Il rilevamento è stato effettuato utilizzando un citometro a flusso. Eccitato da un laser a 488 nm, il segnale di fluorescenza dell'annessina V-FITC è stato raccolto attraverso il canale FITC e il segnale di fluorescenza del PI è stato raccolto attraverso il canale PE. Prima dell'esperimento, sono stati utilizzati campioni a colorazione singola per la regolazione della compensazione della fluorescenza per eliminare la sovrapposizione spettrale. Quando si esegue l'analisi dei dati, delineare prima la popolazione di cellule target nel grafico a dispersione FSC-A/SSC-A ed eliminare i frammenti. Successivamente, le aderenze cellulari sono state escluse utilizzando il grafico a dispersione FSC-H/FSC-A; Infine, è stato istituito un cancello per distinguere tra cellule viventi, cellule apoptotiche precoci, cellule apoptotiche/necrotiche tardive e cellule danneggiate meccanicamente. I dati sono stati ottenuti e analizzati utilizzando il software FlowJo V10.

Modello murino di silice
Nella Figura 1, ai topi è stata somministrata silice per via intranasale a un dosaggio di 30 mg/mL e 70 μL per 40 giorni consecutivi, il che ha assicurato che non si verificassero eventi di morte nei topi e che il modello murino di silice potesse essere stabilito con successo. Nel frattempo, i topi con PBS sono stati utilizzati come controlli negativi. L'obiettivo era quello di eliminare l'influenza dell'operazione e del solvente stesso e garantire che il fenotipo fosse specificamente indotto dalla silice. La replicazione di successo di questo modello di danno polmonare indotto dalla silice fornisce una base necessaria in vivo per la successiva ricerca sul meccanismo della progressione maligna e dell'intervento farmacologico.

Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nei noduli di topi indotti da silice
Nella Figura 2, rilevando l'infiltrazione di cellule immunitarie nei noduli di topi, si è scoperto che c'era un gran numero di infiltrazioni di cellule immunitarie (cellule CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ e Nk1.1+) nei noduli, che erano coinvolte nella formazione e nello sviluppo della malattia polmonare da silice. Ciò indica che la silice induce un microambiente tumorale infiammatorio persistente, che è un fattore chiave per l'insorgenza e lo sviluppo del tumore, e anche la base fisiopatologica per la partecipazione della via ROS/NRF2.

Relazione tra fibrosi polmonare indotta da silice e NRF2, CDK1 e VDAC1 nei topi
Rilevando l'espressione di molecole immunitarie nei noduli, è stato riscontrato che NRF2 (bersaglio inibitorio ML385), CDK1 (correlato al ciclo cellulare) e VDAC1 (coinvolto nello stress ossidativo mitocondriale) erano altamente espressi intorno e all'interno dei noduli ed erano correlati alla fibrosi polmonare (Figura 3).

Impatto della silice e di ML385 sull'autofagia e sui ROS nelle cellule RAW264.7
Attraverso la co-coltura di silice e cellule RAW264.7, si è scoperto che la silice potrebbe indurre la produzione di autofagosomi. Dopo 24 ore di coltura, la co-localizzazione di autofagosoma e lisosoma è stata ridotta, il flusso autofagico è stato inibito e anche la produzione di ROS è stata ridotta. Quando è stato aggiunto ML385 (inibitore di NRF2 ), la co-localizzazione di autofagosoma e lisosoma è stata migliorata, anche il flusso autofagico è stato migliorato e anche i ROS sono stati aumentati di conseguenza (Figura 4).

Analisi dell'espressione di VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 nel tessuto di adenocarcinoma polmonare mediante IHC
Come mostrato nella Figura 5, NRF2 (un bersaglio inibitorio di ML385), CDK1 (correlato al ciclo cellulare), VDAC1 (coinvolto nello stress ossidativo mitocondriale) e p62 (coinvolto nell'autofagia) sono altamente espressi nei tessuti dell'adenocarcinoma polmonare e mostrano differenze significative rispetto ai tessuti adiacenti.

Effetto dell'ML385 e del surnatante della co-incubazione di silice con cellule RAW264.7 sulla migrazione e l'invasione delle cellule A549
Il silice e il surnatante di colture cellulari RAW264.7 possono promuovere la migrazione e la proliferazione delle cellule A549, mentre ML385 può inibire significativamente questi processi (come mostrato nella Figura 6). Questo risultato indica che l'effetto di promozione del tumore del microambiente macrofagico indotto dalla silice dipende dalla via NRF2 . L'inibizione di NRF2 può bloccare efficacemente questo effetto di promozione del tumore, riducendo così la progressione maligna delle cellule tumorali.

Impatto della silice e di ML385 sull'apoptosi delle cellule A549
La Figura 7 mostra che il silice e il surnatante di coltura cellulare RAW264.7 hanno un certo effetto inibitorio sull'apoptosi cellulare A549 e ML385 può promuovere l'apoptosi cellulare A549.

Questo studio ha rivelato il percorso meccanicistico attraverso il quale l'esposizione alla silice promuove la progressione maligna dell'adenocarcinoma polmonare attraverso l'asse ROS/NRF2/autofagia utilizzando metodi sia in vivo che in vitro . Esperimenti su animali hanno confermato che le molecole chiave della via di segnalazione NRF2 sono significativamente attivate nel microambiente della fibrosi polmonare indotta dalla silice. Esperimenti cellulari hanno dimostrato che la silice inibisce direttamente il flusso autofagico nei macrofagi e riduce i livelli di ROS, e questo effetto può essere specificamente invertito dall'inibitore NRF2 ML385. Studi sul meccanismo hanno dimostrato che i macrofagi trattati con silice promuovono la migrazione, l'invasione e l'inibizione dell'apoptosi delle cellule di adenocarcinoma polmonare da parte di fattori secernenti, e questo effetto di promozione del tumore è completamente dipendente dall'attivazione della via NRF2.

Disponibilità dei dati:
I set di dati a supporto della conclusione di questo articolo sono inclusi all'interno dell'articolo.

Figura 1: Costruzione di un modello di silice nei topi. (A) Trattare i topi con inalazione nasale di silice (30 mg/mL) a diversi volumi (10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL e 200 μL). 20 topi per dose di inalazione. (B) Curva di sopravvivenza del topo. La quantità massima per inalazione è di 70 μl/die. (C) Risultati dell'osservazione della colorazione istopatologica polmonare dell'HE nei topi del gruppo silice e del gruppo PBS il giorno 3, il giorno 14 e il giorno 40. (D) Risultati statistici del numero di noduli polmonari osservati nei topi a basso ingrandimento, t-test, ***p <0,001, p= 0,004, t = 10,61 (giorno 14), p = 0,0006, t = 10,02 (giorno 40). N = 9. Le barre di errore mostrano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Osservazione dell'infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto nodulare dei topi attraverso la colorazione a fluorescenza. Elevata infiltrazione di cellule immunitarie (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ e NK1.1+) nei noduli di noduli polmonari indotti da silice nei topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi della relazione tra le espressioni di NRF2, CDK1, VDAC1 e la fibrosi indotta dalla silice attraverso l'immunoistochimica (IHC) e la colorazione di Masson. (A) Le espressioni di NRF2, CDK1 e VDAC1 e i risultati della colorazione di Masson. (B) I risultati dell'IHC. (C) L'analisi statistica della fibrosi polmonare è stata condotta tra il gruppo della silice e il gruppo dei topi PBS. t-test, ***p <0,001, p =0,0002, t =13,42 (NRF2), p=0,0008, t =9,247 (CDK1), p =0,0009, t =8,944 (VDAC1), p =0,0003, t =11,76 (fibrosi polmonare). N = 9. Le barre di errore mostrano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetto della silice sull'autofagia nelle cellule RAW264.7 e l'effetto di regolazione dell'autofagia dell'inibitore di NRF2 ML385. (A) Dopo la co-incubazione della silice con cellule RAW264.7 per 24 ore, la co-localizzazione degli autofagosomi (LC3) e dei lisosomi è diminuita (Green). Tuttavia, con l'aggiunta di ML385, la co-localizzazione di autofagosomi e lisosomi è aumentata (giallo). (B) Dopo la co-incubazione della silice con le cellule RAW264.7 per 24 ore, i ROS generati dal gruppo silice sono diminuiti, ma sono aumentati dopo l'aggiunta di ML385. (C) Analisi statistica dei ROS e del flusso autofagico dei due gruppi, t-test, ***p <0,001, p = 0,0005, t = 10,59 (ROS), p <0,0001, t = 17,08 (Autofagolisoma). N = 6. Le barre di errore mostrano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi immunoistochimica delle espressioni di VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 nel tessuto di adenocarcinoma polmonare umano. (A) Espressioni differenziali (VDAC1, CDK1, p62 e NRF2) tra il tessuto di adenocarcinoma polmonare umano e il tessuto non canceroso adiacente. (B) Analisi statistica dell'espressione differenziale tra 30 casi di cancro e tessuti non cancerosi adiacenti dall'Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, t-test, ***p <0,001, p <0,0001, t = 8,322 (CDK1), p <0,0001, t = 16,4 (NRF2), p <0,0001, t = 15,47 (p62), p <0,0001, t = 17,75 (VDAC1). N = 30. Le barre di errore mostrano l'errore standard. (C) Analisi statistica della fibrosi nel tessuto dell'adenocarcinoma polmonare e nel tessuto non canceroso adiacente, t-test, ***p <0,001, p = 0,0009, t = 8,854 (fibrosi). N = 30. Le barre di errore mostrano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Effetto di ML385 e surnatante dalla co-incubazione di silice con cellule RAW264.7 sulla migrazione e l'invasione cellulare dopo essere stati incubati con la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare A549. (A) I risultati del graffio cellulare sono il giorno 0 e il giorno 7 dopo la co-incubazione del surnatante e di ML385 con le cellule A549. (B) I risultati di invasività cellulare il giorno 7 dopo la co-incubazione del surnatante e di ML385 con cellule A549. (C) Conduzione di analisi statistiche sui risultati del saggio di graffio cellulare. *p <0,05, **p <0,01. t-test, p = 0,0020, t = 22,43 (silice + ML385 contro silice), p = 0,0135, t = 8,510 (silice + ML385 contro PBS), p = 0,0143, t = 8,281 (silice contro PBS). N = 6. Le barre di errore mostrano l'errore standard. (D) Conduzione di analisi statistiche sui risultati del test invasivo cellulare. *p <0,05, **p <0,01, t-test, p =0,0097, t =10,06 (silice+ML385 rispetto a silice), p =0,0472, t =4,437 (silice+ML385 rispetto a PBS), p =0,0125, t =8,857 (silice rispetto a PBS). N = 6. Le barre di errore mostrano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Analisi dell'impatto della silice e di ML385 sull'apoptosi delle cellule A549 mediante citometria a flusso. (A) Rilevare i risultati dell'apoptosi delle cellule A549 attraverso la citometria a flusso. (B) Effettuare analisi statistiche sulla percentuale di cellule apoptotiche. *p <0,05, **p <0,01, t-test, p =0,0013, t =27,29 (silice+ML385 rispetto a silice), p =0,0022, t =6,973 (silice+ML385 rispetto a PBS), p =0,0048, t =5,649 (silice rispetto a PBS). N = 6. Le barre di errore mostrano l'errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.