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ML385 attenua la progressione maligna delle cellule di adenocarcinoma polmonare indotte dalla silice attraverso la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia

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DOI:

10.3791/69382

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31 ottobre 2025

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1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo studio utilizza modelli animali e cellulari per indagare se l'inibitore di NRF2 ML385 attenua la progressione maligna indotta dalla silice dell'adenocarcinoma polmonare attraverso la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia.

Abstract

L'esposizione alla silice è associata ad un aumentato rischio di adenocarcinoma polmonare, ma il suo meccanismo molecolare rimane poco chiaro. Questo studio mira a stabilire un protocollo sperimentale ripetibile per esplorare come l'inibitore del fattore nucleare eritroide 2 correlato al fattore 2 (NRF2) ML385 inibisce la progressione maligna indotta dalla silice dell'adenocarcinoma polmonare regolando la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia. In primo luogo, è stato stabilito un modello di silicosi mediante perfusione intranasale di sospensione di silice in topi C57BL/6. Il grado di fibrosi polmonare è stato valutato mediante colorazione di Masson, l'infiltrazione di cellule immunitarie è stata analizzata mediante immunofluorescenza e le espressioni di NRF2, chinasi ciclina-dipendente 1 (CDK1) e canale anionico voltaggio-dipendente 1 (VDAC1) nel tessuto polmonare sono state rilevate mediante immunoistochimica. Successivamente, in esperimenti in vitro , la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 è stata trattata con silice. Il flusso autofagico e i livelli di stress ossidativo sono stati valutati mediante co-localizzazione LC3-lisosoma e sonde ROS, e l'intervento è stato effettuato con l'inibitore NRF2 ML385. Infine, gli effetti di ML38 sulla migrazione, l'invasione e l'apoptosi delle cellule di adenocarcinoma polmonare sono stati analizzati mediante test scratch, cellule che passano attraverso pori di dimensioni specifiche e citometria a flusso. I risultati hanno mostrato che il silicio potrebbe indurre fibrosi polmonare, infiltrazione di cellule immunitarie e sovraregolazione di NRF2, CDK1 e VDAC1 nei topi (p < 0,001), inibire il flusso autofagico dei macrofagi e ridurre i livelli di ROS. ML385 può invertire questi effetti (p < 0,05). Questo protocollo fornisce un processo sperimentale completo dalla costruzione del modello in vivo alla ricerca sui meccanismi in vitro , offrendo un percorso tecnico operativo per lo studio del meccanismo molecolare dell'adenocarcinoma polmonare correlato alla silice e delle strategie terapeutiche mirate a NRF2.

Introduzione

L'adenocarcinoma polmonare è la principale causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, con una stima di 2 milioni di nuovi casi e 1,76 milioni di decessi ogni anno1. Negli ultimi anni, l'incidenza dell'adenocarcinoma polmonare tra le persone che non hanno mai fumato è aumentata, il che può essere correlato a fattori ambientali come l'inquinamento atmosferico2. La silice è un inquinante ambientale comune ed è stata identificata come un potenziale fattore patogeno per l'adenocarcinoma polmonare umano3. La silice può causare un'infiammazione cronica persistente, che porta all'infiltrazione di macrofagi, linfociti e neutrofili e al rilascio di specie reattive dell'ossigeno e fattori infiammatori4. Questo microambiente infiammatorio a lungo termine favorisce l'insorgenza dell'adenocarcinoma polmonare 5,6. Sebbene l'associazione tra l'esposizione alla silice e l'adenocarcinoma polmonare sia stata confermata, il suo meccanismo molecolare specifico non è stato completamente chiarito.

Il fattore di trascrizione NRF2, codificato dal gene NFE2L2, svolge un ruolo cruciale come regolatore principale nel mantenimento dell'omeostasi redox cellulare in risposta allo stress ossidativo 7,8. In circostanze normali, NRF2 viene marcato e degradato dal complesso ubiquitina ligasi KEAP1-CUL3. Sotto la stimolazione dello stress ossidativo o di sostanze elettrofile, l'attività di KEAP1 viene inibita, consentendo a NRF2 di accumularsi stabilmente ed entrare nel nucleo, esercitando così il ruolo di difesa e regolazione del core9. Tuttavia, un'eccessiva attivazione di NRF2 nel microambiente tumorale può migliorare la glicolisi e la sopravvivenza delle cellule tumorali arrestando l'accumulo di ROS e aumentando la resistenza apoptotica10,11. Gli studi hanno dimostrato che l'esposizione alla silice può provocare un'attivazione anomala della via di segnalazione NRF2 12,13. Pertanto, il targeting di NRF2 può essere una strategia efficace per intervenire nella progressione maligna dell'adenocarcinoma polmonare indotta dalla silice14.

Questo studio mira a chiarire se l'inibitore di NRF2 ML385 inibisce la progressione maligna indotta dalla silice dell'adenocarcinoma polmonare regolando la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia. Abbiamo stabilito un modello murino indotto da silice per riprodurre le caratteristiche chiave della malattia e abbiamo utilizzato metodi sperimentali in vitro per studiare l'interazione tra macrofagi e cellule tumorali. Abbiamo scoperto che la silice induce l'espressione di molecole infiammatorie e immunitarie e promuove ulteriormente la formazione di tumori attraverso la via dell'asse ROS/NRF2-autofagia. Quando è stato utilizzato l'inibitore NRF2 (ML385), l'effetto promotore della silice sulla formazione del tumore è rallentato, suggerendo che l'inibitore NRF2 può svolgere un ruolo nel trattamento dei tumori polmonari indotti dalla silice.

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Protocollo

Tutti i blocchi donatori sono stati ottenuti da campioni patologici d'archivio raccolti tra il 2016 e il 2018 presso l'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an NO.1 dell'Università di Medicina di Nanchino. I campioni sono stati resi anonimi prima dell'uso e processati in conformità con i protocolli approvati. Il comitato etico dell'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an No.1 dell'Università di Medicina di Nanchino, KY-2024-250-01. L'allevamento, lo smaltimento e l'applicazione di topi da esperimento seguono rigorosamente i regolamenti sulla somministrazione di animali da laboratorio e le linee guida internazionali.

Costruzione di un modello murino indotto da silice
Preparazione dei topi e sospensione di silice: Allevare topi maschi C57BL/6, di 6-8 settimane, in una stanza per animali con una temperatura ambiente di 20-25 °C e un ciclo di 12 ore luce / 12 ore buio. Per preparare la sospensione di polvere di silicio, 300 mg di polvere di polvere di silicio sono stati pesati con precisione e sospesi in 10 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato. Successivamente, la miscela è stata vigorosamente vorticata e fatta oscillare per 5 minuti, quindi trattata con gli ultrasuoni in una macchina ad ultrasuoni a bagno d'acqua per 30 minuti per garantire una dispersione uniforme delle particelle e prevenire l'aggregazione. La concentrazione finale di questa sospensione di riserva è di 30 mg/mL. Sterilizzarlo in autoclave a 121 °C per 30 min. Prima di ogni utilizzo, è necessario agitare e agitare nuovamente per 2-3 minuti per risospendere eventuali particelle depositate.

I topi hanno inalato la sospensione di silice attraverso il naso. La micropipetta è stata utilizzata per introdurre lentamente e goccia a goccia la soluzione nella cavità nasale dei topi. I topi sono stati divisi in 6 gruppi con 20 topi in ogni gruppo. Il volume di inalazione di ciascun gruppo è stato di 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL e 200 μL, con una concentrazione di 30 mg/mL, una volta al giorno per 40 giorni consecutivi. Durante la perfusione, afferrare la pelle dietro l'orecchio del mouse con il pollice e l'indice della mano sinistra e fissare il corpo e la coda del mouse con le altre dita. Assicurarsi che il mouse sia in posizione supina con la testa leggermente inclinata all'indietro per consentire alla sospensione di essere inalata naturalmente nelle vie respiratorie. Abbiamo scoperto che non c'è stato alcun evento di morte dopo il secondo giorno di inalazione di 10 μL, 30 μL, 50 μL e 70 μL di sospensione di silice nei topi, mentre c'è stato un evento di morte dopo il secondo giorno di inalazione di 90 μL e 200 μL di sospensione di silice nei topi. Pertanto, il volume massimo di inalazione di silice nei topi era di 70 μl al giorno.

La manipolazione della silice cristallina deve essere effettuata in una cabina di biosicurezza o in una cappa aspirante e durante tutto il processo devono essere indossate maschere N95, occhiali antipolvere, guanti in nitrile e indumenti protettivi. Quando si prepara la sospensione, i movimenti devono essere delicati e deve essere utilizzata una camera di pesata per evitare la generazione di aerosol. Tutti i rifiuti a contatto con la silice devono essere raccolti in contenitori sigillati con resistenza alla perforazione e smaltiti in conformità con le normative per i rifiuti chimici pericolosi. È severamente vietato mescolarlo con rifiuti generici o versarlo nella fogna. I rifiuti biologici, come il terreno di coltura cellulare, devono essere raccolti in appositi bidoni contenenti disinfettanti e sterilizzati ad alta pressione. Le carcasse e i tessuti degli animali devono essere collocati in sacchetti per rifiuti biologici e sterilizzati ad alta pressione per un trattamento innocuo.

Valutare il successo del modello murino indotto dalla silice. Valutare gli animali in diversi momenti dopo l'inalazione di silice, vale a dire il 3°, 14° e 40° giorno. I topi sono stati inseriti in dispositivi professionali per l'eutanasia animale e l'anidride carbonica è stata introdotta a una velocità di riempimento del 30%-50% in volume / min. Erano continuamente esposti fino a quando non smettevano di respirare. Dopo aver confermato la morte, sono state effettuate le operazioni successive. Il tessuto polmonare è stato rimosso. Il tessuto polmonare è stato fissato in una soluzione di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 48 ore. Dopo la fissazione, il tessuto è stato disidratato con alcol gradiente, reso trasparente con xilene e quindi incorporato in paraffina. Le sezioni continue sono state realizzate utilizzando una sezionatrice a paraffina con uno spessore di 4-5 μm per la successiva colorazione istologica e l'analisi immunoistochimica. Il tessuto polmonare non necessita di trattamento di decalcificazione. È stato condotto un esame patologico del tessuto polmonare per valutare il successo della generazione del modello. I criteri di successo della costruzione del modello di silicosi erano i seguenti: infiammazione polmonare significativa, fibrosi e insorgenza di noduli di silicosi.

Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel modello murino indotto da silice
I tessuti polmonari dei topi al giorno 14 dopo l'inalazione di silice sono stati colorati con marcatori fluorescenti contenenti CD3e (rapporto di diluizione 1:200), CD8a (rapporto di diluizione 1:200), CD86 (rapporto di diluizione 1:200), F4/80 (rapporto di diluizione 1:200) e Nk1.1 (rapporto di diluizione 1:200) per visualizzare le cellule immunitarie. Fissare sezioni cellulari o tissutali e bloccare con albumina sierica bovina (BSA) al 5% per 1 ora per ridurre il legame aspecifico. Utilizzare siero normale della stessa specie di origine dell'anticorpo bloccante, diluire il siero con PBS in rapporto 1:10 e aggiungere 100 μl di siero diluito al campione. Quindi, bloccare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire al siero di bloccare gli anticorpi endogeni. Dopo la sigillatura, risciacquare delicatamente 2 volte con PBS. Gli anticorpi primari contenenti CD3e (rapporto di diluizione 1:200), CD8a (rapporto di diluizione 1:200), CD86 (rapporto di diluizione 1:200), F4/80 (rapporto di diluizione 1:200) e Nk1.1 (rapporto di diluizione 1:200) sono stati incubati per una notte a 4 °C o a temperatura ambiente per 1-2 ore. Dopo il lavaggio con PBS, l'anticorpo secondario fluorescente è stato aggiunto e incubato al buio per 1 ora.

Colorazione di Masson e analisi immunoistochimica
Le sezioni di paraffina sono state decerate con xilene e idratate con alcol gradiente, quindi il recupero dell'antigene è stato effettuato in tampone citrato di sodio con pH 6,0 mediante bonifica termica ad alta pressione. Per la bonifica termica ad alta pressione, posizionare le fette di tessuto imbevute di tampone di riparazione in un forno a microonde a fuoco medio per 8-12 minuti. L'attività endogena della perossidasi è stata bloccata con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti, quindi il sito di legame non specifico è stato bloccato con BSA al 5% a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere gli anticorpi primari NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) e VDAC1 (1:500) e incubare per una notte a 4 °C. Dopo aver lavato 3 volte con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra marcato con HRP (1:500) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Le sezioni di paraffina sono state sottoposte a colorazione DAB, controcolorazione con ematossilina, trasparenza della disidratazione e sigillatura con gel neutro per ottenere i corrispondenti risultati di immunoistochimica molecolare. Quando il DAB viene utilizzato per lo sviluppo del colore, lo sviluppo moderato del colore deve essere da giallo brunastro a marrone brunastro e lo sfondo deve essere chiaro. Sia lo sviluppo eccessivo (marrone scuro) che quello insufficiente (giallo chiaro) del colore richiedono l'ottimizzazione del tempo di sviluppo del colore.

Il grado di fibrosi polmonare è stato analizzato semi-quantitativamente utilizzando il metodo di punteggio di Ashcroft15: le sezioni macchiate di Masson sono state osservate al microscopio con ingrandimento 100x e il tessuto polmonare è stato diviso casualmente in 8 regioni. Ogni regione è stata valutata in base al grado di fibrosi (0-8 punti), con il punteggio finale che è la media di tutte le regioni: 0 punti (tessuto polmonare normale), 1-2 punti (fibrosi lieve), 3-4 punti (fibrosi moderata), 5-8 punti (fibrosi grave).

I risultati immunoistochimici sono stati analizzati quantitativamente utilizzando il software Image. Sono stati selezionati casualmente cinque campi ad alto ingrandimento e il valore medio di densità ottica (MOD) di ciascun campo è stato misurato come indicatore del livello di espressione proteica.

Esame dell'impatto della silice e di ML385 sull'autofagia e sui ROS nelle cellule RAW264.7
Entrambe le cellule RAW264.7 e A549 (fornite dall'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui) sono state coltivate utilizzando DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di soluzione di anticorpi bispecifici penicillina-streptomicina. Le cellule 1 x 107 sono state coltivate uniformemente in un incubatore a temperatura costante a 37 °C e 5% di CO2. 5 μL di sospensione di silice da 30 mg/mL sono stati aggiunti a 1 x 105 cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo l'incubazione per 24 ore, le cellule sono state risciacquate con PBS 3x e l'autofagia e lo stress ossidativo sono stati rilevati da sonde ROS, LC3 e lisosomi. Allo stesso tempo, ML38516, un inibitore di NRF2, è stato utilizzato per inibire l'espressione di NRF2 (concentrazione finale di ML385: 5 mM/L). L'autofagia e lo stress ossidativo sono stati rilevati secondo le fasi sperimentali di cui sopra. Lo stress ossidativo e il flusso autofagico dei due gruppi sono stati analizzati statisticamente.

Analisi immunoistochimica delle espressioni di VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 nel tessuto dell'adenocarcinoma polmonare
Le espressioni di VDAC1, CDK1, p62 e NRF2 sono state controllate in 30 pazienti. I tessuti con adenocarcinoma polmonare e i tessuti sani adiacenti sono stati ottenuti dall'Ospedale del Popolo Affiliato Huai'an NO.1 dell'Università di Medicina di Nanchino e sono stati analizzati mediante immunoistochimica (IHC). I risultati dell'IHC e della fibrosi polmonare sono stati analizzati statisticamente. Raccogli i dati dei pazienti in base alle informazioni sui pazienti nel sistema ospedaliero. Le fasi sperimentali specifiche sono le seguenti: le sezioni di paraffina sono state decerate con xilene e idratate con alcol gradiente, quindi la bonifica dell'antigene è stata eseguita in tampone citrato di sodio con pH 6,0 mediante bonifica termica ad alta pressione. L'attività endogena della perossidasi è stata bloccata con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 20 minuti, quindi il sito di legame non specifico è stato bloccato con BSA al 5% a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere gli anticorpi primari NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) e VDAC1 (1:500) e incubare per una notte a 4 °C. Dopo aver lavato 3 volte con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario anti-coniglio di capra marcato con HRP (1:500) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Sviluppo del colore DAB, controcolorazione dell'ematossilina, trasparente disidratato, sigillatura della gomma neutra. Quando il DAB viene utilizzato per lo sviluppo del colore, lo sviluppo moderato del colore deve essere da giallo brunastro a marrone brunastro e lo sfondo deve essere chiaro. Sia lo sviluppo eccessivo (marrone scuro) che quello insufficiente (giallo chiaro) del colore richiedono l'ottimizzazione del tempo di sviluppo del colore.

Analisi della migrazione e dell'invasione cellulare
È stato studiato l'effetto di ML385 e del surnatante derivante dalla co-incubazione di silice con cellule RAW264.7 sulla migrazione e l'invasione cellulare dopo essere stati incubati con la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare A549. Il surnatante delle cellule RAW264.7 co-coltivate con silice per 24 ore è stato aggiunto alle cellule A549. Le celle sono state divise nel gruppo della silice, nel gruppo della silice+ML385 e nel gruppo PBS. Il gruppo silice: 5 μL di sospensione di silice da 30 mg/mL sono stati aggiunti a 1 x 105 cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il surnatante cellulare per un uso successivo. Il gruppo silice+ML385: 5 μL di sospensione di silice da 30 mg/mL e una concentrazione finale di 5 mM/L ML385 sono stati aggiunti a 1 x 105 cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il surnatante cellulare per un uso successivo. Gruppo PBS: 5 μL di PBS sono stati aggiunti a 1 x 105 cellule/mL di cellule RAW264.7. Dopo un'incubazione di 24 ore, rimuovere il surnatante cellulare per un uso successivo. Durante il test scratch, le cellule A549 sono state prima seminate in piastre a 12 pozzetti a una densità di 5 x 105 per pozzetto. Dopo che le cellule sono cresciute fino al 95%-100% di fusione, sono stati praticati dei graffi sulle cellule monostrato utilizzando la punta di una pipetta sterile da 200 μl. Le cellule esfoliate sono state lavate via delicatamente con PBS. Successivamente, le condizioni di coltura sono state modificate per includere l'1% del terreno di base FBS e i surnatanti di ciascun gruppo di trattamento per mantenere la vitalità cellulare durante il periodo sperimentale di 7 giorni. Le immagini della stessa posizione sono state raccolte al microscopio invertito rispettivamente alle ore 0 (Giorno 0) e al 7° Giorno (Giorno 7) dopo il graffio. Infine, l'area del graffio è stata analizzata quantitativamente e il tasso di chiusura del graffio è stato calcolato utilizzando il software ImageJ per valutare l'effetto del surnatante di diversi gruppi di trattamento sulla capacità di migrazione delle cellule A549.

Nelle cellule che passano attraverso pori di dimensioni specifiche, è stata utilizzata una camera a membrana in policarbonato da 8 μm, con la membrana della camera superiore pre-rivestita di gel che simula l'ambiente extracellulare diluito a un rapporto di 1:8 per costruire una barriera di membrana basale. Le cellule A549 sono state risospese in una sospensione ottenuta mescolando un terreno privo di siero con i surnatanti di ciascun gruppo di trattamento in un rapporto 1:1 e quindi inoculate nella camera superiore (2 x 104 cellule per camera). Nella camera inferiore, è stata aggiunta una soluzione ottenuta miscelando un mezzo contenente il 20% di FBS con i surnatanti dei corrispondenti gruppi di trattamento (gruppo Silica+ML385, gruppo Silica e gruppo PBS) nella stessa proporzione come attrattivo chimico. I surnatanti dei corrispondenti gruppi di trattamento sono stati raccolti mediante aspirazione attraverso una pistola pipettata in RAW264.7 Fagocitosi cellulare di silice. Dopo che le cellule sono state incubate continuamente a 37 °C e CO2 al 5% per 7 giorni, le cellule non invasive nella camera superiore sono state rimosse con tamponi di cotone e le cellule che erano penetrate nella membrana e hanno raggiunto la camera inferiore sono state fissate con paraformaldeide al 4% e colorate con cristallovioletto allo 0,1%. Infine, il numero di cellule invasive è stato selezionato casualmente da 5 campi visivi mediante un microscopio ottico.

Analisi dell'impatto della silice e di ML385 sull'apoptosi delle cellule A549 mediante citometria a flusso
Preparazione e raggruppamento cellulare: sono state raccolte A549 cellule trattate con i surnatanti di ciascun gruppo di trattamento (gruppo PBS, gruppo silice, silice + gruppo ML385). Le cellule sono state lavate delicatamente 2 volte con PBS pre-raffreddato, quindi risospese in un tampone di legame 1x e la densità cellulare è stata regolata a 1 x 106 cellule per provetta/100 μL. Quindi, 5 μL di annessina V-FITC e 5 μL di soluzione colorante PI sono stati aggiunti alla sospensione cellulare, delicatamente agitati per mescolarsi e incubati a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, 400 μl di tampone legante 1x sono stati aggiunti a ciascuna provetta e immediatamente testati sulla macchina. Il rilevamento è stato effettuato utilizzando un citometro a flusso. Eccitato da un laser a 488 nm, il segnale di fluorescenza dell'annessina V-FITC è stato raccolto attraverso il canale FITC e il segnale di fluorescenza del PI è stato raccolto attraverso il canale PE. Prima dell'esperimento, sono stati utilizzati campioni a colorazione singola per la regolazione della compensazione della fluorescenza per eliminare la sovrapposizione spettrale. Quando si esegue l'analisi dei dati, delineare prima la popolazione di cellule target nel grafico a dispersione FSC-A/SSC-A ed eliminare i frammenti. Successivamente, le aderenze cellulari sono state escluse utilizzando il grafico a dispersione FSC-H/FSC-A; Infine, è stato istituito un cancello per distinguere tra cellule viventi, cellule apoptotiche precoci, cellule apoptotiche/necrotiche tardive e cellule danneggiate meccanicamente. I dati sono stati ottenuti e analizzati utilizzando il software FlowJo V10.

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Risultati

Modello murino di silice
Nella Figura 1, ai topi è stata somministrata silice per via intranasale a un dosaggio di 30 mg/mL e 70 μL per 40 giorni consecutivi, il che ha assicurato che non si verificassero eventi di morte nei topi e che il modello murino di silice potesse essere stabilito con successo. Nel frattempo, i topi con PBS sono stati utilizzati come controlli negativi. L'obiettivo era quello di eliminare l'influenza dell'operazione e del solvente stesso e garantir...

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Discussione

L'adenocarcinoma polmonare è una delle principali cause di decessi correlati al cancro in tutto il mondo e la sua incidenza e i tassi di mortalità aumentano di anno in anno17. La silice è classificata come cancerogeno per l'uomo di classe 1 dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro e il rischio di adenocarcinoma polmonare aumenta con l'esposizione professionale cumulativa 18,19,20,21.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Grazie ai membri del team per il loro sostegno e contributo a questo studio. Questo studio è stato supportato dal Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes (NO. AYZJSGXLK202202006), Shanghai Pudong New Area People's Hospital Talent Introduction Start-up Fund (NO. PRYYH202501).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BeyoGold TranswellBeyotime Biotechnology FTW067-48lnsTranswell
CD3eBD in Biologia561827FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)
CD86BD in Biologia105013CD86
CD8aBD in Biologia100713CD8a
CDK1Abcamab133327Anti-CDK1
Kit di rilevamento dell'apoptosi cellulareBeyotime Biotechnology C1062LRilevamento dell'apoptosi
DAPIBeyotime Biotechnology P0131-25mlDAPI
Macchina di incorporamentoP.S.J MEDICALBM450AMacchina di incorporamento
F4/80BD in Biologia123109F4/80
Disidratatore di tessuti completamente automaticoLeica BiosystemsASP3005Disidratatore di tessuti completamente automatico
Vetri per microscopio in vetroCitotest250124A1Vetri per microscopio in vetro
H& Tinta EBeyotime Biotechnology C0105MH& Tinta E
IHC KitBiotecnologia dell'Assinoabs996-5mlIHC Kit
Sonda LC3Beyotime Biotechnology C3018MSonda LC3
Lame microtomi a profilo bassoThermo Fisher3052835Lame microtomi a profilo basso
Sonda lisosomicaBeyotime Biotechnology C1046Sonda lisosomica
MarcatoreDeliSK109Marcatore
Colorante MassonBeyotime Biotechnology C0189MColorante Masson
Matrix-GelBeyotime Biotechnology C0371-5mlAdesivo a matrice
MicrotomoLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMicrotomo
ML385Abcamab287109Inibitore NRF2
NK1.1BD in Biologia561117NK1.1
NRF2Abcamcirca 1809YAnti-NRF2
p62Abcamab20735Anti-p62
ParaffinaSolarbioYA0012Paraffina
Specie ossigeno reattive Kit di analisiBeyotime Biotechnology S0033MSonda ROS
SiliceSigma AldrichS5631Silice cristallina
VDAC1Abcamab34726Anti-VDAC1

Riferimenti

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Liang, D., et al. Lung Cancer in Never-Smokers: A Multicenter Case-Control Study in North China. Front Oncol. 9, 1354(2019).
  3. Olsson, A., et al. Lung Cancer Risks Associated with Occupational Exposure to Pairs of Five Lung Carcinogens: Results from a Pooled Analysis of Case-Control Studies (SYNERGY). Environ Health Perspect. 132 (1), 017005(2024).
  4. Sato, T., Shimosato, T., Klinman, D. M. Silicosis and lung cancer: current perspectives. Lung Cancer Targets Ther. 9, 91-101 (2018).
  5. Nakano-Narusawa, Y., et al. Single Intratracheal Quartz Instillation Induced Chronic Inflammation and Tumourigenesis in Rat Lungs. Sci Rep. 10 (1), 6647(2020).
  6. Hornung, V., et al. Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome through phagosomal destabilization. Nat Immunol. 9 (8), 847-856 (2008).
  7. Dodson, M., et al. Modulating NRF2 in Disease: Timing Is Everything. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 59, 555-575 (2019).
  8. Bae, T., Hallis, S. P., Kwak, M. K. Hypoxia, oxidative stress, and the interplay of HIFs and NRF2 signaling in cancer. Exp Mol Med. 56 (3), 501-514 (2024).
  9. Yamamoto, M., Kensler, T. W., Motohashi, H. The KEAP1-NRF2 System: a Thiol-Based Sensor-Effector Apparatus for Maintaining Redox Homeostasis. Physiol Rev. 98 (3), 1169-1203 (2018).
  10. Weiss-Sadan, T., et al. NRF2 activation induces NADH-reductive stress, providing a metabolic vulnerability in lung cancer. Cell Metabol. 35 (3), 487-503.e7 (2023).
  11. Rojo de la Vega, M., Chapman, E., Zhang, D. D. NRF2 and the Hallmarks of Cancer. Cancer Cell. 34 (1), 21-43 (2018).
  12. Chen, G., et al. n-BuOH extract of Bletilla striata exerts chemopreventive effects on lung against SiO2 nanoparticles through activation of Nrf2 pathway. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 82, 153445(2021).
  13. Song, J., Meng, H., Deng, G., Lin, H. Sustainable Release Selenium Laden with SiO2 Restoring Peripheral Nerve Injury via Modulating PI3K/AKT Pathway Signaling Pathway. Int J Nanomed. 19, 7851-7870 (2024).
  14. Zuo, L., et al. The Nrf2-HMOX1 pathway as a therapeutic target for reversing cisplatin resistance in non-small cell lung cancer via inhibiting ferroptosis. Cell Death Disc. 11 (1), 287(2025).
  15. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
  16. Xu, C., et al. ML385, an Nrf2 Inhibitor, Synergically Enhanced Celastrol Triggered Endoplasmic Reticulum Stress in Lung Cancer Cells. ACS Omega. 9 (43), 43697-43705 (2024).
  17. Qiu, Z., et al. Proteomic characteristics of lung adenocarcinoma tumors that are small but highly invasive. Med Adv. 1 (4), 340-352 (2023).
  18. Christiani, D. C. Occupational Exposures and Lung Cancer. Am J Respirat Crit Care Med. 202 (3), 317-319 (2020).
  19. Requena-Mullor, M., et al. Association between Crystalline Silica Dust Exposure and Silicosis Development in Artificial Stone Workers. Int J Environ Res Public Health. 18 (11), 5625(2021).
  20. Wang, Z., et al. Erchen decoction alleviates silicosis by attenuating ferroptosis and fibrosis in alveolar macrophages via modulating the P53/HMOX1 pathway. J Ethnopharmacol. 352, 120227(2025).
  21. Zhou, Y., Zhang, W., Wu, D., Fan, Y. The effect of silica exposure on the risk of lung cancer: A meta-analysis. J Biochem Mol Toxicol. 37 (4), e23287(2023).
  22. Liu, W., et al. Nrf2 Protects Against Oxidative Stress Induced By SiO2 Nanoparticles. Nanomedicine. 12 (19), 2303-2318 (2017).
  23. Li, S., et al. SiO2 particles induce pulmonary fibrosis by modulating NLRP3 through the ROS/Keap1/Nrf2 signaling pathway in rats. Food Chem Toxicol Int J Published Brit Ind Biol Re Associat. 202, 115520(2025).
  24. Wang, G., et al. Nrf2 mediates the effects of shionone on silica-induced pulmonary fibrosis. Chinese Med. 19 (1), 88(2024).
  25. Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Controlled Release. 364, 618-631 (2023).
  26. Baird, L., Yamamoto, M. The Molecular Mechanisms Regulating the KEAP1-NRF2 Pathway. Mol Cell Biol. 40 (13), e00099-e00120 (2020).
  27. Kreß, J. K. C., et al. The integrated stress response effector ATF4 is an obligatory metabolic activator of NRF2. Cell Rep. 42 (7), 112724(2023).
  28. Xie, B., Wang, S., Jiang, N., Li, J. J. Cyclin B1/CDK1-regulated mitochondrial bioenergetics in cell cycle progression and tumor resistance. Can Lett. 443, 56-66 (2019).
  29. Odle, R. I., Florey, O., Ktistakis, N. T., Cook, S. J. CDK1, the Other "Master Regulator" of Autophagy. Trends Cell Biol. 31 (2), 95-107 (2021).
  30. Liu, Y., et al. Hypoxia-induced GPCPD1 depalmitoylation triggers mitophagy via regulating PRKN-mediated ubiquitination of VDAC1. Autophagy. 19 (9), 2443-2463 (2023).
  31. Yuan, M., et al. IP3R1/GRP75/VDAC1 complex mediates endoplasmic reticulum stress-mitochondrial oxidative stress in diabetic atrial remodeling. Redox Biol. 52, 102289(2022).
  32. Shi, Q., et al. SPOP mutations promote p62/SQSTM1-dependent autophagy and Nrf2 activation in prostate cancer. Cell Death Differentiat. 29 (6), 1228-1239 (2022).
  33. Zheng, Y., et al. Melatonin Alleviates the Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion-Induced Pyroptosis of HEI-OC1 Cells and Cochlear Hair Cells via MT-1,2/Nrf2 (NFE2L2)/ROS/NLRP3 Pathway. Mol Neurobiol. 60 (2), 629-642 (2023).
  34. Cords, L., et al. Cancer-associated fibroblast phenotypes are associated with patient outcome in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 42 (3), 396-412.e5 (2024).
  35. Wu, F., et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nat Comm. 12 (1), 2540(2021).

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