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Articolo metodologico

Imaging a fluorescenza quantitativa dell'infezione da Alphavirus per lo screening di antivirali

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DOI:

10.3791/69384

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14 agosto 2026

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo studio viene presentato un protocollo robusto e adattabile per la visualizzazione continua delle infezioni da alfavirus. Questo protocollo offre un approccio per studiare la replicazione degli alfavirus e valutare l'efficacia di composti antivirali a livello cellulare mediante imaging a fluorescenza.

Abstract

La microscopia a fluorescenza offre un approccio altamente sensibile e versatile per studiare l'infezione da alfavirus a livello cellulare. Combinando virus marcati con fluorescenza con un'analisi quantitativa delle immagini, questo metodo permette una caratterizzazione spaziale e temporale dettagliata della dinamica infettiva, inclusa la rilevazione di differenze sottili nei profili di replicazione e nella diffusione da cellula a cellula. Un obiettivo centrale di questo protocollo è l'applicazione in saggi di screening antivirali. La quantificazione basata sulle immagini dell'intensità di fluorescenza fornisce un metodo solido e riproducibile per valutare l'efficacia di composti antivirali, consentendo un rilevamento precoce e sensibile degli effetti inibitori nelle cellule infette. Ciò facilita l'identificazione di potenziali candidati antivirali e supporta la valutazione di risposte dipendenti dalla dose. L'approccio si presta anche a studi comparativi tra diversi ceppi o mutanti di alfavirus, poiché le variazioni nel comportamento replicativo e nei modelli di diffusione risultano facilmente evidenti. La sua flessibilità, compatibilità con diverse linee cellulari e integrazione semplice in piattaforme di imaging automatizzate rendono il metodo scalabile e adatto a campagne di screening ad alto rendimento. Nel complesso, questo protocollo favorisce la scoperta e la valutazione di strategie antivirali. Considerando che diversi alfavirus causano malattie rilevanti nell'uomo e negli animali, non esistono terapie antivirali approvate e l'espansione geografica con nuovi focolai rimane in atto, l'identificazione di nuovi antivirali rappresenta una priorità urgente. Pertanto, questo flusso di lavoro basato sulla fluorescenza costituisce un contributo prezioso e tempestivo alla ricerca moderna sugli alfavirus.

Introduzione

Gli alphavirus sono virus a RNA a filamento singolo, a senso positivo e dotati di involucro, appartenenti alla famiglia Togaviridae1,2,3. Sono trasmessi principalmente da zanzare e sono responsabili di una serie di malattie negli esseri umani e negli animali. Il genere alphavirus comprende diversi virus di rilevanza medica, come il virus Chikungunya (CHIKV), il virus Sindbis, il virus dell'encefalite equina orientale e il virus dell'encefalite equina venezuelana4,5. Questi agenti patogeni causano sintomi che vanno da febbre ed eruzioni cutanee fino a gravi complicanze neurologiche6. In particolare, il CHIKV è riemerso come una preoccupazione significativa per la salute pubblica. Solo a partire dall'inizio del 2025, sono stati segnalati oltre 220.000 casi in 14 paesi, con almeno 80 decessi7. Sebbene il tasso di mortalità sia basso, una percentuale significativa di individui infetti sviluppa dolore articolare cronico, che può portare a disabilità a lungo termine e ridotta mobilità8. Per sviluppare strategie antivirali mirate, è essenziale una comprensione più approfondita della replicazione degli alphavirus e delle interazioni tra ospite e patogeno. Allo stesso tempo, alcuni alphavirus, come il virus della foresta di Semliki (SFV), mostrano una bassa patogenicità nell'uomo, nonostante condividano un'elevata similarità genetica e strutturale con alphavirus più virulenti. Ciò rende l'SFV un modello ideale per lo studio degli alphavirus senza rappresentare un alto rischio per la salute umana9,10,11.

Saggi tradizionali come i saggi di placca, il saggio della dose infettiva del 50% in coltura tissutale (TCID50) e l'analisi della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) sono utili per quantificare i titoli virali e l'espressione genica, ma si limitano a misurazioni endpoint e richiedono la lisi o la fissazione delle cellule. Di conseguenza, non possono catturare direttamente la dinamica dell'infezione all'interno delle stesse cellule nel tempo12,13. Per superare questi limiti, l'imaging fluorescente in tempo reale offre un approccio potente e non distruttivo per monitorare la cinetica dell'infezione in diversi punti temporali. L'uso di virus marcati con fluorescenza, come il SFV etichettato con mCherry, permette la visualizzazione diretta e la quantificazione del segnale del virus reporter e della sua diffusione in cellule vive14,15. Per gli esperimenti descritti in questo studio, sono state utilizzate linee cellulari comunemente impiegate nella ricerca sugli arbovirus. Le cellule U4.4, derivate da larve di Aedes albopictus, sono cellule di zanzara che supportano una replicazione efficiente di molti arbovirus e facilitano lo studio delle interazioni vettore-virus16,17. Parallelamente, le cellule BHK-21, una linea cellulare di tipo fibroblastico di origine mammaliana derivata da tessuto renale di criceto, forniscono un sistema ospite vertebrale permissivo frequentemente utilizzato per la propagazione virale e saggi di virologia molecolare18.

Questo protocollo descrive nel dettaglio il monitoraggio dell'espressione del reporter virale e la caratterizzazione di composti antivirali, utilizzando inibitori della furina come esempio. La furina è una convertasi di proproteine presente in molti eucarioti e svolge un ruolo chiave nell'attivazione dei precursori di fattori della crescita, ormoni, metalloproteasi della matrice, proteine plasmatiche e recettori19,20. Molti alfavirus sfruttano la furina per scindere e attivare le loro proteine di superficie, un passaggio cruciale per una replicazione efficace20. Gli inibitori della furina sono composti progettati sinteticamente per bloccare l'attività della furina, riducendo così la replicazione virale21,22,23. Considerata la limitata disponibilità di protocolli standardizzati per l'analisi automatizzata mediante microscopia a fluorescenza delle infezioni da alfavirus, effettuata con un lettore multimodale per imaging cellulare, viene fornito un flusso di lavoro dettagliato per la caratterizzazione di composti antivirali in cellule aedine. Il protocollo illustra le fasi relative alla coltura cellulare, produzione del virus, infezione, trattamento con composti antivirali (inibitore della furina), acquisizione di immagini a fluorescenza e analisi delle immagini. Tuttavia, i metodi qui descritti possono essere facilmente adattati ad altri virus e ad altre etichette fluorescenti.

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Protocollo

1. Sicurezza biologica

NOTA: Il virus di Semliki Forest ricombinante marcato con mCherry (SFV-mCherry) utilizzato in questo protocollo è geneticamente modificato24,25,26. L'inserimento di un gene reporter fluorescente lo classifica come organismo geneticamente modificato, il che comporta requisiti aggiuntivi di contenimento e normative regolatorie. Le attività che coinvolgono altri alfavirus, in particolare virus più patogeni come CHIKV, potrebbero richiedere ulteriori misure di contenimento e autorizzazioni.

  1. Pulire la cappa biologica con un disinfettante appropriato e applicare la luce UV per almeno 30 minuti prima e dopo i saggi virali.
  2. Smaltire tutti i materiali contaminati secondo le normative locali di biosicurezza. Raccogliere i rifiuti solidi e liquidi separatamente in contenitori autoclavabili e sottoporli ad autoclave prima dello smaltimento.

2. Preparazione dei composti antivirali

NOTA: Gli inibitori della furina MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) e MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) utilizzati in questo studio sono esempi di composti antivirali selezionati per i test. L'inibitore della furina MI-1148 è stato utilizzato come controllo negativo nel saggio di citotossicità e come controllo positivo nel saggio antivirale.

  1. Sciogliere i composti antivirali in un solvente appropriato. Quando possibile, utilizzare acqua sterile per evitare effetti citotossici. È possibile utilizzare dimetilsulfossido o metanolo fino ad un massimo del 2% (v/v). Si raccomanda l'uso di soluzioni stock di 10 mM in acqua sterile.
  2. Conservare le soluzioni stock a -20 °C, in base alla stabilità e alla solubilità, salvo diversa indicazione del produttore.

3. Coltura cellulare

  1. Coltivare le cellule U4.4 in mezzo Leibovitz L-15 integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di aminoacidi non essenziali MEM, 1% di brodo di triptoso fosfato, 1% di glutammina e 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep) (densità di semina: circa 1 × 106 cellule/flacone T25, volume di coltura: 5 mL). Mantenere le cellule a 28 °C. Passaggiare le cellule U4.4 in un rapporto 1:6 una volta alla settimana, ma regolare le densità di semina in base alle esigenze sperimentali.
    NOTA: Altre linee cellulari, come le cellule C6/36, sono anch'esse compatibili con questo protocollo. È possibile utilizzare mezzi e integratori alternativi in modo appropriato. L'aggiunta di antibiotici è facoltativa e può essere omessa.
  2. Coltivare le cellule renali di criceto da neonato (BHK-21) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium integrato con 10% di FBS, 1% di glutammina o Equilibrio statico, ΣFx=0, grafico, analisi di bilancio delle forze, diagramma di stabilità meccanica.‑alanyl‑Equilibrio statico, ΣFx=0, grafico, analisi di bilancio delle forze, diagramma di stabilità meccanica.‑glutamina e 1% di Pen/Strep (densità di semina: circa 1 × 106 cellule/flacone T75, volume di coltura: 10 mL). Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO2. Passaggiare le cellule in un rapporto 1:12 ogni 4-5 giorni, con la possibilità di modificare le densità di semina secondo necessità.
  3. Assicurarsi che le cellule rimangano sane e in attiva proliferazione.

4. Produzione del virus

  1. Preparazione di scorte di SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) in cellule BHK-21.
    1. Coltivare le cellule BHK-21 (densità di semina: circa 1 × 105 cellule/pozzetto, volume di coltura: 500 µL) in una piastra da coltura cellulare trasparente a 24 pozzetti, nelle condizioni descritte in precedenza.
    2. Quando la confluenza raggiunge circa il 90% (confluenza target: circa 2 × 105 cellule), trasfettare le cellule BHK-21 con il plasmide SFV6-2SG-mCherry utilizzando un reagente di trasfezione in mezzo di infezione (DMEM integrato con 1% Pen/Strep e 0,2% di albumina sierica bovina). Per questo, diluire 1 µL di reagente di trasfezione in 25 µL di mezzo con basso contenuto di siero.
    3. In un tubo separato, diluire 0,5 µg di DNA plasmidico e 1 µL di un additivo proprietario in 25 µL di mezzo con basso contenuto di siero. Aggiungere la soluzione di DNA diluita alla soluzione contenente il reagente di trasfezione diluito e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 50 µL del complesso risultante alle cellule.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri reagenti di trasfezione, purché compatibili con la linea cellulare specifica, e le istruzioni possono variare a seconda del reagente impiegato.
    4. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il soprannatante contenente il virus mediante pipetta, aliquotare 250 µL per tubo privo di DNA/RNA e conservare a -80 °C.
  2. Titolo mediante saggio TCID50.
    1. Coltivare le cellule BHK-21 (densità di semina: circa 2 × 104 cellule/pozzetto, volume di coltura: 100 µL) in una piastra da imaging nera a 96 pozzetti, nelle condizioni descritte in precedenza.
    2. Scongelare un'aliquote di virus, preparare diluizioni seriali decrescenti del campione virale in mezzo di infezione (15 µL di campione virale + 135 µL di mezzo di infezione), scartare il vecchio mezzo e aggiungere 100 µL delle diluizioni alle cellule.
    3. Incubare le cellule per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂, quindi sostituire l'inoculo con 100 µL di mezzo di infezione fresco.
    4. 48 ore dopo l'infezione (hpi), valutare la replicazione virale mediante misurazione della fluorescenza utilizzando un lettore multimodale per piastre da imaging (descrizione dettagliata nella sezione 7) e determinare l'effetto citopatico causato dall'infezione virale. Calcolare il valore di TCID50 in base al metodo di Reed-Muench28 e convertirlo in titoli virali stimati (PFU/mL) utilizzando l'approssimazione standard basata sulla distribuzione di Poisson, secondo cui 1 TCID50 corrisponde a 0,7 PFU.

5. Determinazione della citotossicità

  1. Coltivare le cellule U4.4 (densità di semina: circa 3 × 104 cellule/pozzetto, volume di coltura: 100 µL) in una piastra da coltura cellulare trasparente a 96 pozzetti, nelle condizioni descritte in precedenza.
    NOTA: I pozzetti periferici (righe A e H; colonne 1 e 12) sono stati seminati con cellule ma esclusi dall'analisi sperimentale per evitare effetti di bordo, tra cui l'evaporazione aumentata.
  2. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 90% (confluenza target: circa 6 × 104 cellule), trattarle con 100, 50, 25 e 12,5 µM degli inibitori della furina MI-1130 e MI-1131 in un volume totale di 100 µL. Aggiungere MI-1148 (alle stesse concentrazioni di MI-1130 e MI-1131), cellule non trattate e cellule trattate con acqua come controlli negativi, e ionomicina (100 µM nel saggio) come controllo positivo per la citotossicità.
  3. A 48 ore dal trattamento (hpt), valutare la vitalità cellulare mediante un saggio luminescente basato sulla quantificazione dell'ATP. Aggiungere un volume uguale del reagente luminescente in ogni pozzetto (1:1 rispetto al mezzo di coltura), agitare la piastra per 2 minuti per assicurare la lisi cellulare e incubare per 10 minuti al buio prima di misurare la luminescenza.
    NOTA: Possono essere utilizzati anche altri saggi di vitalità cellulare basati su principi di rilevamento differenti.
  4. Rilevare la luminescenza in una piastra a 96 pozzetti nera o bianca utilizzando un lettore multimodale.

6. Infezione virale e trattamento con un composto antivirale

  1. Coltivare le cellule U4.4 (densità di semina: circa 3 × 104 cellule/pozzetto, volume di coltura: 100 µL) in una piastra 96 pozzetti nera adatta all'imaging, nelle condizioni descritte in precedenza.
    NOTA: I pozzetti periferici (righe A e H; colonne 1 e 12) sono stati seminati con cellule ma esclusi dall'analisi sperimentale per evitare effetti di bordo, inclusa un'evaporazione aumentata.
  2. Infectare le cellule (confluenza target: circa 6 × 104 cellule) con SFV-mCherry a una multiplicità di infezione (MOI) di 0,01 in mezzo L-15 non supplementato, utilizzando un volume di inoculo di 100 µL, e incubare per 1 h a 28 °C.
    NOTA: Si dovrebbero utilizzare esclusivamente ceppi virali reporter a basso passaggio, in particolare quando si lavora con MOI molto bassi e infezioni prolungate per più giorni.
  3. Diluire gli inibitori della furina MI-1130, MI-1131 e MI-1148 a concentrazioni finali di 100, 50, 25 e 12,5 µM in una piastra separata 96 pozzetti a fondo V, utilizzando mezzo L-15 supplementato. Preparare 110 µL per pozzetto per consentire un eccesso del 10%, quindi trasferire 100 µL (volume finale) sulle cellule. Per i controlli, utilizzare cellule infette trattate con il solvente dei composti antivirali e cellule infette senza trattamento come controllo negativo. È inoltre necessario aggiungere cellule non infette e non trattate per misurare la fluorescenza di fondo.
  4. Trascorso il periodo di infezione di 1 h, rimuovere l'inoculo e trasferire 100 µL degli inibitori della furina diluiti dalle piastre a fondo V alle piastre nere adatte all'imaging.
  5. Incubare le cellule a 28 °C.

7. Imaging a fluorescenza su cellule vive, analisi quantitativa delle immagini e presentazione dei dati

  1. Misurazione dell'espressione del reporter virale mediante microscopia a fluorescenza (vedere Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 e Supplementary Figure 7 per la configurazione del programma).
    1. Alle 24 e alle 48 hpi, colorare i nuclei cellulari aggiungendo 8 µL di una soluzione di controcolorante nucleare permeabile alle cellule per ogni pozzetto. Incubare per 30 min a 28 °C.
      NOTA: L'infezione può essere monitorata in diversi punti temporali. Tuttavia, le misurazioni effettuate a 48 ore post-infezione forniscono il segnale più intenso (vedere Supplementary Figure 8) e permettono di valutare gli effetti antivirali in modo più affidabile. È possibile effettuare letture a 24 ore o a punti temporali intermedi, ma prolungare l'incubazione oltre le 48 ore aumenta il rischio di sovraccrescita cellulare. Selezionare una confluenza cellulare appropriata all'inizio dell'esperimento per garantire che le cellule non diventino sovraccresciute al momento scelto per la lettura. Ciò eviterà ostacoli a un conteggio cellulare accurato.
    2. Dopo l'incubazione (e oltre al coperchio trasparente), aggiungere un foglio sigillante trasparente che copra la parte superiore della piastra per motivi di sicurezza.
      NOTA: Quando si utilizza un dispositivo di imaging, è essenziale selezionare il tipo corretto di piastra. L'illuminazione, il tempo di integrazione e le impostazioni del guadagno variano a seconda del gene reporter. Si raccomanda vivamente di eseguire misurazioni preliminari per determinare i parametri ottimali. Le impostazioni iniziali di illuminazione, integrazione e guadagno utilizzate per stabilire il protocollo nelle condizioni specificate sono riportate in Supplementary Figure 2, dove la configurazione del programma è descritta in dettaglio.
    3. Acquisire immagini dell'intero pozzetto utilizzando la funzione di assemblaggio delle immagini (quattro campi per pozzetto a 4x di ingrandimento) mediante il lettore multimodale.
    4. Misurare l'intensità della fluorescenza rossa utilizzando un cubetto filtro Texas Red (Eccitazione: 586/15 nm; Emissione: 647/57 nm).
    5. Determinare il conteggio totale delle cellule utilizzando il canale DAPI con le seguenti impostazioni (Eccitazione: 377/50 nm; Emissione: 447/60 nm).
  2. Analisi quantitativa delle immagini (vedere Supplementary Table 1 per i dati grezzi).
    NOTA: Per le misurazioni di fluorescenza è stato utilizzato un lettore di micropiastre con funzione di imaging. I parametri dettagliati utilizzati per questo saggio sono disponibili in Supplementary Figure 2.
    1. Elaborare le immagini utilizzando un software di imaging appropriato.
    2. Utilizzando il pannello di riduzione dei dati, selezionare l'assemblaggio delle immagini per i canali DAPI e Texas Red per creare un'immagine unica dai pozzetti.
    3. Aggiungere le statistiche delle immagini e selezionare l'intensità totale sul canale Texas Red assemblato. Applicare la pre-elaborazione delle immagini per rimuovere il rumore di fondo dal canale DAPI assemblato.
    4. Eseguire l'analisi cellulare sul canale DAPI assemblato pre-elaborato.
    5. Calcolare l'intensità media della fluorescenza rossa per cellula sottraendo l'intensità media di fluorescenza dei pozzetti di controllo non infetti e non trattati da ciascun pozzetto trattato, quindi dividendo il risultato per il conteggio totale delle cellule nel pozzetto corrispondente.
  3. Risoluzione dei problemi
    1. Monitorare la stabilità del fuoco durante la misurazione, in particolare per acquisizioni di imaging prolungate o quando si utilizzano piastre sensibili alla temperatura.
    2. Abilitare l'autofocus e aumentarne la frequenza se si osserva una deriva del fuoco. Ridurre la velocità di acquisizione o consentire alle piastre di equilibrarsi alla temperatura dello strumento prima dell'imaging, se la deriva persiste.
    3. Utilizzare piastre di qualità per imaging per garantire una qualità del segnale costante durante l'acquisizione. Evitare il passaggio incrociato (bleed-through) e la sovraesposizione evitando un'eccessiva illuminazione e tempi di integrazione troppo lunghi.
    4. Ridurre l'intensità di eccitazione, accorciare il tempo di integrazione o diminuire il guadagno fino a evitare la saturazione del segnale. Verificare che i canali del fluorocromo siano ben separati e regolare le impostazioni dei filtri secondo necessità.
      NOTA: Il passaggio incrociato tra DAPI e mCherry è generalmente basso, ma dipende dal costrutto reporter utilizzato (ad esempio, GFP).
    5. Evitare una confluenza eccessiva delle cellule per mantenere una corretta cinetica di infezione e la sensibilità del saggio. Se si verifica una confluenza eccessiva, ridurre il tempo di incubazione prima della misurazione.
    6. Monitorare gli effetti del colorante sulla vitalità cellulare e sulla qualità del segnale, in particolare a concentrazioni elevate. Ridurre la concentrazione del colorante o accorciare i tempi di incubazione se si osserva tossicità dovuta al colorante o un fondo eccessivamente saturo.
    7. Preparare e conservare i coloranti seguendo le raccomandazioni del produttore per mantenere la stabilità del segnale.

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Risultati

In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per monitorare la diffusione degli alphavirus e valutare composti antivirali (ad esempio inibitori della furina) mediante microscopia a fluorescenza in formato di piastre multipozzetto. Per dimostrare la visualizzazione degli effetti inibitori sull'espressione del reporter virale, sono stati selezionati tre inibitori della furina precedentemente sintetizzati per essere testati nella linea cellulare aedina U4.4: MI-1148, MI-1130 e MI-1131. Una panoramica del flus...

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Discussione

La capacità di osservare la replicazione degli alphavirus in tempo reale offre una prospettiva sequenziale e cumulativa rispetto ai tradizionali test endpoint. Questo protocollo di imaging in tempo reale su cellule vive multiplo è un modello utile per lo studio degli alphavirus, in quanto fornisce una piattaforma dinamica per osservare la diffusione virale.

Il successo di questo protocollo dipende da diversi parametri. Innanzitutto, è importante valutare la citotossicità dei composti prima di ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Prof. Dr. Andres Merits, dell'Università di Tartu, Estonia, e il Prof. Dr. Andreas Pichlmair, dell'Università Tecnica di Monaco, Germania, per aver fornito il plasmide pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Ringraziamo la Prof. Dr. Stefanie Becker, dell'Università di Medicina Veterinaria di Hannover, Germania, per le cellule C6/36. Ringraziamo il Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, dell'Università di Marburgo, Marburgo, Germania, per aver fornito gli inibitori della furina. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz del Ministero della Formazione Superiore, della Ricerca e degli Affari Culturali dello stato della Renania-Palatinato attraverso il LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG) con codice di finanziamento: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, e dal BMFTR (Progetto ASCRIBE - Numero di Borsa 01KI2024).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina Bovina Frakzione V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
Cellule BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Germania603126
FLASKO PER COLTURA CELLULARE, 50 ML, 25 cm2, PS, tappo a vite con filtro rosso, trasparente, CELLSTAR, TC, sterileGreiner Bio-One690175
Piastra micro per coltura cellulare, 24 pozzetti, PS, fondo F, (pozzetto a ciminiera), trasparente, CELLSTAR, TC, coperchio con anelli anticondensa, sterileGreiner Bio-One662160
Piastra micro per coltura cellulare, 96 pozzetti, PS, fondo F, (pozzetto a ciminiera), µCLEAR, nera, CELLSTAR, TC, coperchio con anelli anticondensa, sterileGreiner Bio-One655090
Piastra micro per coltura cellulare, 96 pozzetti, PS, fondo F, (pozzetto a ciminiera), trasparente, CELLSTAR, TC, coperchio con anelli anticondensa, sterileGreiner Bio-One655180
Piastra micro per coltura cellulare, 96 pozzetti, PS, fondo V, trasparenteGreiner Bio-One651101
Scalpello per celluleVWR734-2602
Saggio di Viabilità Cellulare Chemiluminescente CellTiter-GloPromegaG7573
Lettore multimodale per imaging cellulare Cytation 5Biotek
Cubo filtro DAPI 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
Mezzo Dulbecco Modificato di Eagle (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Siero Fetale BovinoFisher Scientific11550356
Inibitore della furina MI-1130Questo studio
Inibitore della furina MI-1131Questo studio
Inibitore della furina MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Software Gen5 PrimeBiotek
Sale di calcio ionomicina, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Mezzo L-15 di Leibovitz, integrato con GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Reagente per trasfezione Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Aminoacidi non essenziali MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Piastra micro, PS, 96 pozzetti, fondo F, (pozzetto a ciminiera), nera, Fluotrac, legame medioGreiner Bio-One655076
Reagente NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Università di Tartu, Estonia) e Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Università Tecnica di Monaco, Germania)
Cubo filtro Texas Red 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Brodo Tryptose Fosfato Thermo Fisher Scientific18050039
Cellule U4.4Istituto Friedrich-Loeffler, Istituto Federale di Ricerca per la Salute Animale, Greifswald, Germania
Sigillante Viewseal, trasparenteGreiner Bio-One676070

Riferimenti

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