Articolo metodologico

Imaging a fluorescenza quantitativa dell'infezione da Alphavirus per lo screening di antivirali

44 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

14 agosto 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo studio viene presentato un protocollo robusto e adattabile per la visualizzazione continua delle infezioni da alfavirus. Questo protocollo offre un approccio per studiare la replicazione degli alfavirus e valutare l'efficacia di composti antivirali a livello cellulare mediante imaging a fluorescenza.

Abstract

La microscopia a fluorescenza offre un approccio altamente sensibile e versatile per studiare l'infezione da alfavirus a livello cellulare. Combinando virus marcati con fluorescenza con un'analisi quantitativa delle immagini, questo metodo permette una caratterizzazione spaziale e temporale dettagliata della dinamica infettiva, inclusa la rilevazione di differenze sottili nei profili di replicazione e nella diffusione da cellula a cellula. Un obiettivo centrale di questo protocollo è l'applicazione in saggi di screening antivirali. La quantificazione basata sulle immagini dell'intensità di fluorescenza fornisce un metodo solido e riproducibile per valutare l'efficacia di composti antivirali, consentendo un rilevamento precoce e sensibile degli effetti inibitori nelle cellule infette. Ciò facilita l'identificazione di potenziali candidati antivirali e supporta la valutazione di risposte dipendenti dalla dose. L'approccio si presta anche a studi comparativi tra diversi ceppi o mutanti di alfavirus, poiché le variazioni nel comportamento replicativo e nei modelli di diffusione risultano facilmente evidenti. La sua flessibilità, compatibilità con diverse linee cellulari e integrazione semplice in piattaforme di imaging automatizzate rendono il metodo scalabile e adatto a campagne di screening ad alto rendimento. Nel complesso, questo protocollo favorisce la scoperta e la valutazione di strategie antivirali. Considerando che diversi alfavirus causano malattie rilevanti nell'uomo e negli animali, non esistono terapie antivirali approvate e l'espansione geografica con nuovi focolai rimane in atto, l'identificazione di nuovi antivirali rappresenta una priorità urgente. Pertanto, questo flusso di lavoro basato sulla fluorescenza costituisce un contributo prezioso e tempestivo alla ricerca moderna sugli alfavirus.

Introduzione

Gli alphavirus sono virus a RNA a filamento singolo, a senso positivo e dotati di involucro, appartenenti alla famiglia Togaviridae1,2,3. Sono trasmessi principalmente da zanzare e sono responsabili di una serie di malattie negli esseri umani e negli animali. Il genere alphavirus comprende diversi virus di rilevanza medica, come il virus Chikungunya (CHIKV), il virus Sindbis, il virus dell'encefalite equina orientale e il virus dell'encefalite equina venezuelana4,5. Questi agenti patogeni causano sintomi che vanno da febbre ed eruzioni cutanee fino a gravi complicanze neurologiche6. In particolare, il CHIKV è riemerso come una preoccupazione significativa per la salute pubblica. Solo a partire dall'inizio del 2025, sono stati segnalati oltre 220.000 casi in 14 paesi, con almeno 80 decessi7. Sebbene il tasso di mortalità sia basso, una percentuale significativa di individui infetti sviluppa dolore articolare cronico, che può portare a disabilità a lungo termine e ridotta mobilità8. Per sviluppare strategie antivirali mirate, è essenziale una comprensione più approfondita della replicazione degli alphavirus e delle interazioni tra ospite e patogeno. Allo stesso tempo, alcuni alphavirus, come il virus della foresta di Semliki (SFV), mostrano una bassa patogenicità nell'uomo, nonostante condividano un'elevata similarità genetica e strutturale con alphavirus più virulenti. Ciò rende l'SFV un modello ideale per lo studio degli alphavirus senza rappresentare un alto rischio per la salute umana9,10,11.

Saggi tradizionali come i saggi di placca, il saggio della dose infettiva del 50% in coltura tissutale (TCID50) e l'analisi della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) sono utili per quantificare i titoli virali e l'espressione genica, ma si limitano a misurazioni endpoint e richiedono la lisi o la fissazione delle cellule. Di conseguenza, non possono catturare direttamente la dinamica dell'infezione all'interno delle stesse cellule nel tempo12,13. Per superare questi limiti, l'imaging fluorescente in tempo reale offre un approccio potente e non distruttivo per monitorare la cinetica dell'infezione in diversi punti temporali. L'uso di virus marcati con fluorescenza, come il SFV etichettato con mCherry, permette la visualizzazione diretta e la quantificazione del segnale del virus reporter e della sua diffusione in cellule vive14,15. Per gli esperimenti descritti in questo studio, sono state utilizzate linee cellulari comunemente impiegate nella ricerca sugli arbovirus. Le cellule U4.4, derivate da larve di Aedes albopictus, sono cellule di zanzara che supportano una replicazione efficiente di molti arbovirus e facilitano lo studio delle interazioni vettore-virus16,17. Parallelamente, le cellule BHK-21, una linea cellulare di tipo fibroblastico di origine mammaliana derivata da tessuto renale di criceto, forniscono un sistema ospite vertebrale permissivo frequentemente utilizzato per la propagazione virale e saggi di virologia molecolare18.

Questo protocollo descrive nel dettaglio il monitoraggio dell'espressione del reporter virale e la caratterizzazione di composti antivirali, utilizzando inibitori della furina come esempio. La furina è una convertasi di proproteine presente in molti eucarioti e svolge un ruolo chiave nell'attivazione dei precursori di fattori della crescita, ormoni, metalloproteasi della matrice, proteine plasmatiche e recettori19,20. Molti alfavirus sfruttano la furina per scindere e attivare le loro proteine di superficie, un passaggio cruciale per una replicazione efficace20. Gli inibitori della furina sono composti progettati sinteticamente per bloccare l'attività della furina, riducendo così la replicazione virale21,22,23. Considerata la limitata disponibilità di protocolli standardizzati per l'analisi automatizzata mediante microscopia a fluorescenza delle infezioni da alfavirus, effettuata con un lettore multimodale per imaging cellulare, viene fornito un flusso di lavoro dettagliato per la caratterizzazione di composti antivirali in cellule aedine. Il protocollo illustra le fasi relative alla coltura cellulare, produzione del virus, infezione, trattamento con composti antivirali (inibitore della furina), acquisizione di immagini a fluorescenza e analisi delle immagini. Tuttavia, i metodi qui descritti possono essere facilmente adattati ad altri virus e ad altre etichette fluorescenti.

Protocollo

1. Sicurezza biologica

NOTA: Il virus di Semliki Forest ricombinante marcato con mCherry (SFV-mCherry) utilizzato in questo protocollo è geneticamente modificato24,25,26. L'inserimento di un gene reporter fluorescente lo classifica come organismo geneticamente modificato, il che comporta requisiti aggiuntivi di contenimento e normative regolatorie. Le attività che coinvolgono altri alfavirus, in particolare virus più patogeni come CHIKV, potrebbero richiedere ulteriori misure di contenimento e autorizzazioni.

  1. Pulire la cappa biologica con un disinfettante appropriato e applicare la luce UV per almeno 30 minuti prima e dopo i saggi virali.
  2. Smaltire tutti i materiali contaminati secondo le normative locali di biosicurezza. Raccogliere i rifiuti solidi e liquidi separatamente in contenitori autoclavabili e sottoporli ad autoclave prima dello smaltimento.

2. Preparazione dei composti antivirali

NOTA: Gli inibitori della furina MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) e MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) utilizzati in questo studio sono esempi di composti antivirali selezionati per i test. L'inibitore della furina MI-1148 è stato utilizzato come controllo negativo nel saggio di citotossicità e come controllo positivo nel saggio antivirale.

  1. Sciogliere i composti antivirali in un solvente appropriato. Quando possibile, utilizzare acqua sterile per evitare effetti citotossici. È possibile utilizzare dimetilsulfossido o metanolo fino ad un massimo del 2% (v/v). Si raccomanda l'uso di soluzioni stock di 10 mM in acqua sterile.
  2. Conservare le soluzioni stock a -20 °C, in base alla stabilità e alla solubilità, salvo diversa indicazione del produttore.

3. Coltura cellulare

  1. Coltivare le cellule U4.4 in mezzo Leibovitz L-15 integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di aminoacidi non essenziali MEM, 1% di brodo di triptoso fosfato, 1% di glutammina e 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep) (densità di semina: circa 1 × 106 cellule/flacone T25, volume di coltura: 5 mL). Mantenere le cellule a 28 °C. Passaggiare le cellule U4.4 in un rapporto 1:6 una volta alla settimana, ma regolare le densità di semina in base alle esigenze sperimentali.
    NOTA: Altre linee cellulari, come le cellule C6/36, sono anch'esse compatibili con questo protocollo. È possibile utilizzare mezzi e integratori alternativi in modo appropriato. L'aggiunta di antibiotici è facoltativa e può essere omessa.
  2. Coltivare le cellule renali di criceto da neonato (BHK-21) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium integrato con 10% di FBS, 1% di glutammina o Equilibrio statico, ΣFx=0, grafico, analisi di bilancio delle forze, diagramma di stabilità meccanica.‑alanyl‑Equilibrio statico, ΣFx=0, grafico, analisi di bilancio delle forze, diagramma di stabilità meccanica.‑glutamina e 1% di Pen/Strep (densità di semina: circa 1 × 106 cellule/flacone T75, volume di coltura: 10 mL). Mantenere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO2. Passaggiare le cellule in un rapporto 1:12 ogni 4-5 giorni, con la possibilità di modificare le densità di semina secondo necessità.
  3. Assicurarsi che le cellule rimangano sane e in attiva proliferazione.

4. Produzione del virus

  1. Preparazione di scorte di SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) in cellule BHK-21.
    1. Coltivare le cellule BHK-21 (densità di semina: circa 1 × 105 cellule/pozzetto, volume di coltura: 500 µL) in una piastra da coltura cellulare trasparente a 24 pozzetti, nelle condizioni descritte in precedenza.
    2. Quando la confluenza raggiunge circa il 90% (confluenza target: circa 2 × 105 cellule), trasfettare le cellule BHK-21 con il plasmide SFV6-2SG-mCherry utilizzando un reagente di trasfezione in mezzo di infezione (DMEM integrato con 1% Pen/Strep e 0,2% di albumina sierica bovina). Per questo, diluire 1 µL di reagente di trasfezione in 25 µL di mezzo con basso contenuto di siero.
    3. In un tubo separato, diluire 0,5 µg di DNA plasmidico e 1 µL di un additivo proprietario in 25 µL di mezzo con basso contenuto di siero. Aggiungere la soluzione di DNA diluita alla soluzione contenente il reagente di trasfezione diluito e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 50 µL del complesso risultante alle cellule.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri reagenti di trasfezione, purché compatibili con la linea cellulare specifica, e le istruzioni possono variare a seconda del reagente impiegato.
    4. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il soprannatante contenente il virus mediante pipetta, aliquotare 250 µL per tubo privo di DNA/RNA e conservare a -80 °C.
  2. Titolo mediante saggio TCID50.
    1. Coltivare le cellule BHK-21 (densità di semina: circa 2 × 104 cellule/pozzetto, volume di coltura: 100 µL) in una piastra da imaging nera a 96 pozzetti, nelle condizioni descritte in precedenza.
    2. Scongelare un'aliquote di virus, preparare diluizioni seriali decrescenti del campione virale in mezzo di infezione (15 µL di campione virale + 135 µL di mezzo di infezione), scartare il vecchio mezzo e aggiungere 100 µL delle diluizioni alle cellule.
    3. Incubare le cellule per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂, quindi sostituire l'inoculo con 100 µL di mezzo di infezione fresco.
    4. 48 ore dopo l'infezione (hpi), valutare la replicazione virale mediante misurazione della fluorescenza utilizzando un lettore multimodale per piastre da imaging (descrizione dettagliata nella sezione 7) e determinare l'effetto citopatico causato dall'infezione virale. Calcolare il valore di TCID50 in base al metodo di Reed-Muench28 e convertirlo in titoli virali stimati (PFU/mL) utilizzando l'approssimazione standard basata sulla distribuzione di Poisson, secondo cui 1 TCID50 corrisponde a 0,7 PFU.

5. Determinazione della citotossicità

  1. Coltivare le cellule U4.4 (densità di semina: circa 3 × 104 cellule/pozzetto, volume di coltura: 100 µL) in una piastra da coltura cellulare trasparente a 96 pozzetti, nelle condizioni descritte in precedenza.
    NOTA: I pozzetti periferici (righe A e H; colonne 1 e 12) sono stati seminati con cellule ma esclusi dall'analisi sperimentale per evitare effetti di bordo, tra cui l'evaporazione aumentata.
  2. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 90% (confluenza target: circa 6 × 104 cellule), trattarle con 100, 50, 25 e 12,5 µM degli inibitori della furina MI-1130 e MI-1131 in un volume totale di 100 µL. Aggiungere MI-1148 (alle stesse concentrazioni di MI-1130 e MI-1131), cellule non trattate e cellule trattate con acqua come controlli negativi, e ionomicina (100 µM nel saggio) come controllo positivo per la citotossicità.
  3. A 48 ore dal trattamento (hpt), valutare la vitalità cellulare mediante un saggio luminescente basato sulla quantificazione dell'ATP. Aggiungere un volume uguale del reagente luminescente in ogni pozzetto (1:1 rispetto al mezzo di coltura), agitare la piastra per 2 minuti per assicurare la lisi cellulare e incubare per 10 minuti al buio prima di misurare la luminescenza.
    NOTA: Possono essere utilizzati anche altri saggi di vitalità cellulare basati su principi di rilevamento differenti.
  4. Rilevare la luminescenza in una piastra a 96 pozzetti nera o bianca utilizzando un lettore multimodale.

6. Infezione virale e trattamento con un composto antivirale

  1. Coltivare le cellule U4.4 (densità di semina: circa 3 × 104 cellule/pozzetto, volume di coltura: 100 µL) in una piastra 96 pozzetti nera adatta all'imaging, nelle condizioni descritte in precedenza.
    NOTA: I pozzetti periferici (righe A e H; colonne 1 e 12) sono stati seminati con cellule ma esclusi dall'analisi sperimentale per evitare effetti di bordo, inclusa un'evaporazione aumentata.
  2. Infectare le cellule (confluenza target: circa 6 × 104 cellule) con SFV-mCherry a una multiplicità di infezione (MOI) di 0,01 in mezzo L-15 non supplementato, utilizzando un volume di inoculo di 100 µL, e incubare per 1 h a 28 °C.
    NOTA: Si dovrebbero utilizzare esclusivamente ceppi virali reporter a basso passaggio, in particolare quando si lavora con MOI molto bassi e infezioni prolungate per più giorni.
  3. Diluire gli inibitori della furina MI-1130, MI-1131 e MI-1148 a concentrazioni finali di 100, 50, 25 e 12,5 µM in una piastra separata 96 pozzetti a fondo V, utilizzando mezzo L-15 supplementato. Preparare 110 µL per pozzetto per consentire un eccesso del 10%, quindi trasferire 100 µL (volume finale) sulle cellule. Per i controlli, utilizzare cellule infette trattate con il solvente dei composti antivirali e cellule infette senza trattamento come controllo negativo. È inoltre necessario aggiungere cellule non infette e non trattate per misurare la fluorescenza di fondo.
  4. Trascorso il periodo di infezione di 1 h, rimuovere l'inoculo e trasferire 100 µL degli inibitori della furina diluiti dalle piastre a fondo V alle piastre nere adatte all'imaging.
  5. Incubare le cellule a 28 °C.

7. Imaging a fluorescenza su cellule vive, analisi quantitativa delle immagini e presentazione dei dati

  1. Misurazione dell'espressione del reporter virale mediante microscopia a fluorescenza (vedere Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 e Supplementary Figure 7 per la configurazione del programma).
    1. Alle 24 e alle 48 hpi, colorare i nuclei cellulari aggiungendo 8 µL di una soluzione di controcolorante nucleare permeabile alle cellule per ogni pozzetto. Incubare per 30 min a 28 °C.
      NOTA: L'infezione può essere monitorata in diversi punti temporali. Tuttavia, le misurazioni effettuate a 48 ore post-infezione forniscono il segnale più intenso (vedere Supplementary Figure 8) e permettono di valutare gli effetti antivirali in modo più affidabile. È possibile effettuare letture a 24 ore o a punti temporali intermedi, ma prolungare l'incubazione oltre le 48 ore aumenta il rischio di sovraccrescita cellulare. Selezionare una confluenza cellulare appropriata all'inizio dell'esperimento per garantire che le cellule non diventino sovraccresciute al momento scelto per la lettura. Ciò eviterà ostacoli a un conteggio cellulare accurato.
    2. Dopo l'incubazione (e oltre al coperchio trasparente), aggiungere un foglio sigillante trasparente che copra la parte superiore della piastra per motivi di sicurezza.
      NOTA: Quando si utilizza un dispositivo di imaging, è essenziale selezionare il tipo corretto di piastra. L'illuminazione, il tempo di integrazione e le impostazioni del guadagno variano a seconda del gene reporter. Si raccomanda vivamente di eseguire misurazioni preliminari per determinare i parametri ottimali. Le impostazioni iniziali di illuminazione, integrazione e guadagno utilizzate per stabilire il protocollo nelle condizioni specificate sono riportate in Supplementary Figure 2, dove la configurazione del programma è descritta in dettaglio.
    3. Acquisire immagini dell'intero pozzetto utilizzando la funzione di assemblaggio delle immagini (quattro campi per pozzetto a 4x di ingrandimento) mediante il lettore multimodale.
    4. Misurare l'intensità della fluorescenza rossa utilizzando un cubetto filtro Texas Red (Eccitazione: 586/15 nm; Emissione: 647/57 nm).
    5. Determinare il conteggio totale delle cellule utilizzando il canale DAPI con le seguenti impostazioni (Eccitazione: 377/50 nm; Emissione: 447/60 nm).
  2. Analisi quantitativa delle immagini (vedere Supplementary Table 1 per i dati grezzi).
    NOTA: Per le misurazioni di fluorescenza è stato utilizzato un lettore di micropiastre con funzione di imaging. I parametri dettagliati utilizzati per questo saggio sono disponibili in Supplementary Figure 2.
    1. Elaborare le immagini utilizzando un software di imaging appropriato.
    2. Utilizzando il pannello di riduzione dei dati, selezionare l'assemblaggio delle immagini per i canali DAPI e Texas Red per creare un'immagine unica dai pozzetti.
    3. Aggiungere le statistiche delle immagini e selezionare l'intensità totale sul canale Texas Red assemblato. Applicare la pre-elaborazione delle immagini per rimuovere il rumore di fondo dal canale DAPI assemblato.
    4. Eseguire l'analisi cellulare sul canale DAPI assemblato pre-elaborato.
    5. Calcolare l'intensità media della fluorescenza rossa per cellula sottraendo l'intensità media di fluorescenza dei pozzetti di controllo non infetti e non trattati da ciascun pozzetto trattato, quindi dividendo il risultato per il conteggio totale delle cellule nel pozzetto corrispondente.
  3. Risoluzione dei problemi
    1. Monitorare la stabilità del fuoco durante la misurazione, in particolare per acquisizioni di imaging prolungate o quando si utilizzano piastre sensibili alla temperatura.
    2. Abilitare l'autofocus e aumentarne la frequenza se si osserva una deriva del fuoco. Ridurre la velocità di acquisizione o consentire alle piastre di equilibrarsi alla temperatura dello strumento prima dell'imaging, se la deriva persiste.
    3. Utilizzare piastre di qualità per imaging per garantire una qualità del segnale costante durante l'acquisizione. Evitare il passaggio incrociato (bleed-through) e la sovraesposizione evitando un'eccessiva illuminazione e tempi di integrazione troppo lunghi.
    4. Ridurre l'intensità di eccitazione, accorciare il tempo di integrazione o diminuire il guadagno fino a evitare la saturazione del segnale. Verificare che i canali del fluorocromo siano ben separati e regolare le impostazioni dei filtri secondo necessità.
      NOTA: Il passaggio incrociato tra DAPI e mCherry è generalmente basso, ma dipende dal costrutto reporter utilizzato (ad esempio, GFP).
    5. Evitare una confluenza eccessiva delle cellule per mantenere una corretta cinetica di infezione e la sensibilità del saggio. Se si verifica una confluenza eccessiva, ridurre il tempo di incubazione prima della misurazione.
    6. Monitorare gli effetti del colorante sulla vitalità cellulare e sulla qualità del segnale, in particolare a concentrazioni elevate. Ridurre la concentrazione del colorante o accorciare i tempi di incubazione se si osserva tossicità dovuta al colorante o un fondo eccessivamente saturo.
    7. Preparare e conservare i coloranti seguendo le raccomandazioni del produttore per mantenere la stabilità del segnale.

Risultati

In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per monitorare la diffusione degli alphavirus e valutare composti antivirali (ad esempio inibitori della furina) mediante microscopia a fluorescenza in formato di piastre multipozzetto. Per dimostrare la visualizzazione degli effetti inibitori sull'espressione del reporter virale, sono stati selezionati tre inibitori della furina precedentemente sintetizzati per essere testati nella linea cellulare aedina U4.4: MI-1148, MI-1130 e MI-1131. Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Prima di valutare l'efficacia antivirale, è essenziale analizzare la citotossicità per assicurarsi che una riduzione della replicazione virale non sia dovuta alla morte cellulare indotta dal composto. Pertanto, le cellule U4.4 sono state trattate al 90% di confluenza con gli inibitori a concentrazioni di 100, 50, 25 o 12,5 µM. Le cellule non trattate e quelle trattate con acqua (controllo del solvente) sono state utilizzate come controlli negativi, mentre l'ionomicina è stata impiegata come controllo positivo. La vitalità cellulare è stata valutata a 48 ore dal trattamento mediante un saggio luminescente basato sulla quantificazione dell'ATP. Per gli inibitori della furina testati, non è stata osservata alcuna riduzione significativa della vitalità cellulare (Figura 2).

Data l'assenza di citotossicità, i composti sono stati successivamente valutati per l'attività antivirale. A tale scopo, le cellule U4.4 sono state infettate con SFV-mCherry per 1 h, seguite dal trattamento con gli stessi inibitori della furina alle stesse concentrazioni. Le cellule infette non trattate e le cellule infette trattate con acqua sono state utilizzate come controlli negativi per l'attività antivirale, mentre le cellule non infette non trattate sono state impiegate per valutare la fluorescenza di fondo. A 48 h dal trattamento, l'espressione del reporter virale è stata quantificata mediante microscopia a fluorescenza. Prima dell'acquisizione delle immagini, sono stati aggiunti a ciascuna pozzetta 8 µL di una soluzione colorante nucleare permeabile alle cellule, che è stata incubata per 30 minuti per colorare i nuclei cellulari. Il segnale di fluorescenza rossa corrispondente all'espressione del reporter virale e il numero totale di nuclei sono stati quantificati a partire dalle immagini di fluorescenza elaborate. Tra gli inibitori testati, MI-1148 ha dimostrato una potente attività antivirale, riducendo in modo significativo l'espressione del reporter virale in maniera dose-dipendente (Figura 3). Al contrario, MI-1130 e MI-1131 non hanno mostrato alcuna inibizione osservabile dell'espressione del reporter virale a nessuna delle concentrazioni testate. I dati grezzi e l'analisi del saggio antivirale sono riportati in Tabella Supplementare 1.

I risultati rappresentativi dimostrano che il protocollo identifica in modo affidabile composti con attività antivirale, come evidenziato dalla marcata riduzione del segnale del reporter osservata con MI-1148. Al contrario, gli inibitori MI-1130 e MI-1131 non hanno ridotto l'espressione del reporter, indicando che la loro potente inibizione della furina, riflessa dalle costanti di inibizione nell'ordine dei picomoli, non si è tradotta in attività antivirale in queste condizioni (Figura 4). Questi risultati evidenziano la capacità del saggio di distinguere composti attivi da quelli inattivi e di supportare l'identificazione di strutture principali potenti e rilevanti.

Processo di screening antivirale; coltura cellulare, infezione virale, trattamento con composti; grafico di analisi dati.
Figura 1: Flusso sperimentale. Una panoramica schematica della procedura sperimentale utilizzata per valutare l'attività antivirale degli inibitori della furina nella linea cellulare aedina U4.4. Il flusso comprende la preparazione dei composti, la semina delle cellule, l'infezione con il virus Semliki Forest marcato con mCherry, il trattamento con composti, la microscopia a fluorescenza per la visualizzazione in tempo reale e la quantificazione dell'espressione del reporter virale. Questa illustrazione è stata creata con BioRender. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre della vitalità cellulare, confronto della concentrazione del farmaco; trattamenti con MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Figura 2: Effetti citotossici degli inibitori della furina in cellule U4.4. A circa il 90% di confluenza, le cellule U4.4 sono state trattate con MI-1148, MI-1130 e MI-1131 a concentrazioni di 100, 50, 25 e 12,5 µM. Le cellule non trattate e quelle trattate con acqua sono state utilizzate come controlli negativi, mentre l'ionomicina (100 µM) è stata usata come controllo positivo. Dopo 48 ore dal trattamento, la vitalità cellulare è stata valutata mediante quantificazione dell'ATP. I dati sono stati normalizzati rispetto al controllo non trattato ed espressi come percentuale (%). È mostrata la vitalità cellulare media (n=3) e le barre di errore rappresentano il coefficiente di variazione. La linea tratteggiata indica la soglia di citotossicità stabilita all'80%. n.d. = non rilevabile. La rappresentazione dei dati è stata effettuata con GraphPad Prism v9.5.1. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre dell'intensità rossa delle cellule rispetto alla concentrazione del farmaco; analisi statistica dei composti della serie MI.
Figura 3: Attività antivirale degli inibitori della furina contro il virus Semliki Forest (SFV) marcato con mCherry nella linea cellulare aedina U4.4. Quando le cellule raggiungevano circa il 90% di confluenza, venivano infettate con SFV-mCherry per 1 h, seguite dal trattamento con MI-1148, MI-1130 e MI-1131 a concentrazioni di 100, 50, 25 e 12,5 µM. A 48 h dal trattamento, l'espressione del reporter virale è stata quantificata mediante microscopia a fluorescenza. Prima dell'acquisizione delle immagini, sono stati aggiunti 8 µL di una soluzione colorante nucleare permeante alle cellule in ogni pozzetto e incubati per 30 minuti per colorare i nuclei cellulari. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un filtro Texas Red per il segnale virale e un filtro DAPI per i nuclei. È stata eseguita un'analisi delle immagini per quantificare l'intensità totale di fluorescenza rossa (indicativa della replicazione virale) e il numero totale di cellule per pozzetto. I dati (n = 4) sono espressi come intensità rossa totale per cellula (segnale virale totale / conteggio totale delle cellule). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La significatività statistica rispetto al controllo infettato con SFV, calcolata mediante ANOVA a un fattore e il test di confronti multipli di Dunnett: **** = P<0,0001; ns = P>0,05. La rappresentazione dei dati e l'analisi statistica sono state effettuate con GraphPad Prism v9.5.1. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Immagine al microscopio di colture cellulari infette da SFV a diverse concentrazioni, che mostra i livelli di infezione.
Figura 4: Immagini di fluorescenza rappresentative che mostrano l'attività antivirale degli inibitori della furina contro il virus Semliki Forest (SFV) marcato con mCherry nella linea cellulare aedina U4.4. Le cellule, a circa il 90% di confluenza, sono state infettate con SFV-mCherry per 1 h, seguite dal trattamento con MI-1148, MI-1130 e MI-1131 alle concentrazioni di 100, 50, 25 e 12,5 µM. Le cellule infette non trattate e quelle infette trattate con acqua sono state utilizzate come controlli negativi, mentre le cellule non infette non trattate sono state incluse come controlli di fondo. Il segnale del reporter è stato valutato 48 h dopo il trattamento mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un filtro Texas Red per rilevare il segnale di mCherry. Barra della scala = 2000 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare 1: Dati grezzi dell'intensità totale del segnale virale e del conteggio cellulare. Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 1: Passaggi della procedura eseguiti sul lettore di immagini per i risultati rappresentativi. Innanzitutto, un'impostazione della temperatura (rosso) corrispondente alle condizioni di coltura delle cellule U4.4. Successivamente, tre passaggi indipendenti di acquisizione delle immagini (arancione) per le misurazioni di DAPI, Texas Red e campo chiaro. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Impostazioni dell'immagine nei passaggi della procedura utilizzati sul lettore di immagini per i risultati rappresentativi. Le prime impostazioni da modificare sono: ingrandimento (4x) e dimensione dell'immagine (Full WFOV). È necessario selezionare il fluorocromo da misurare e modificare di conseguenza i parametri di illuminazione, tempo di integrazione e guadagno. Infine, vanno selezionati il montaggio dell'immagine (2x2) e l'overlap (30 µm x 30 µm). Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Passaggi di riduzione dei dati utilizzati sul lettore di immagini per i risultati rappresentativi. Il primo passaggio è l'unione delle immagini (blu) per i canali DAPI e Texas Red. In secondo luogo, le statistiche dell'immagine (viola) forniscono la misurazione dell'intensità totale. Successivamente, è necessario un passaggio di pre-elaborazione dell'immagine (verde) per rimuovere il rumore di fondo dal canale DAPI. Infine, viene effettuata l'analisi cellulare (giallo) sull'immagine unita pre-elaborata del canale DAPI. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Composizione delle immagini nei passaggi di riduzione dei dati utilizzati sul lettore di immagini per i risultati rappresentativi. L'impostazione più rilevante è la riduzione delle dimensioni dell'immagine finale (80%), poiché se è inferiore, influisce sulla risoluzione dell'immagine e quindi sulla misurazione finale dei parametri. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: Statistiche delle immagini nei passaggi di riduzione dei dati utilizzati sul lettore di immagini per i risultati rappresentativi. È importante selezionare il canale corretto (Stitched: Fluorophore), scegliere una soglia minima (2500) e infine il parametro da misurare (Intensità totale). Per una misurazione più accurata, è possibile creare un Image Plug. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6: Pre-elaborazione delle immagini nei passaggi di riduzione dei dati utilizzati nell'apparecchio per immagini per i risultati rappresentativi. Il parametro più rilevante è quello della sfera rotolante (30 µm), che privilegia risultati fini. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura Supplementare 7: Analisi cellulare nei passaggi di riduzione dei dati utilizzati sul lettore di immagini per i risultati rappresentativi. È importante scegliere il canale che presenta l'immagine preelaborata. Scegliere di dividere gli oggetti in contatto e riempire i fori con maschere. È fondamentale selezionare l'intervallo corretto di dimensioni degli oggetti (5-50 µm). Infine, per risultati più accurati, è possibile creare un Image Plug. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 8: Attività antivirale degli inibitori della furina contro il virus Semliki Forest (SFV) marcato con mCherry nella linea cellulare aedina U4.4. A circa il 90% di confluenza, le cellule sono state infettate con SFV-mCherry per 1 h, seguita dal trattamento con MI-1148, MI-1130 e MI-1131 a 100, 50, 25 e 12,5 µM. A 24 h (barre rosse) e 48 h (barre verdi) dal trattamento, l'espressione del reporter virale è stata quantificata mediante microscopia a fluorescenza. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 4). Cliccare qui per scaricare questo file.

Discussione

La capacità di osservare la replicazione degli alphavirus in tempo reale offre una prospettiva sequenziale e cumulativa rispetto ai tradizionali test endpoint. Questo protocollo di imaging in tempo reale su cellule vive multiplo è un modello utile per lo studio degli alphavirus, in quanto fornisce una piattaforma dinamica per osservare la diffusione virale.

Il successo di questo protocollo dipende da diversi parametri. Innanzitutto, è importante valutare la citotossicità dei composti prima di un saggio antivirale, per escludere risultati falsamente positivi dovuti alla morte cellulare. Una volta effettuata la valutazione degli effetti citotossici, l'attività antivirale dei composti può essere successivamente analizzata. Per i composti in esame, non è stata osservata alcuna citotossicità. MI-1130 e MI-1131 non hanno mostrato un impatto significativo sull'espressione del reporter virale, mentre MI-1148, utilizzato come controllo positivo, l'ha efficacemente soppressa. Inoltre, il momento dell'infezione rispetto al seeding cellulare è cruciale. Le cellule devono raggiungere una confluenza adeguata per garantire un'infezione riproducibile senza sovraproliferazione. È inoltre fondamentale ottimizzare la multiplicità di infezione in base alla linea cellulare, al fine di osservare un'infezione graduale senza compromettere la vitalità cellulare. Infine, la frequenza di acquisizione delle immagini deve essere attentamente determinata per permettere la visualizzazione di un'espressione graduale del reporter virale, evitando salti eccessivi. Per la maggior parte delle applicazioni, acquisire immagini ogni otto ore, ad esempio, fornisce un equilibrio efficace tra dettaglio temporale e integrità del campione.

Il principale punto di forza di questo protocollo è la sua adattabilità. In questo esperimento, abbiamo utilizzato il virus SFV-mCherry e le cellule U4.4 per dimostrare il monitoraggio dell'espressione del marcatore virale e della sua inibizione dopo il trattamento con inibitori della furina. Tuttavia, il protocollo può essere ottimizzato per l'analisi fluorescente di virus alternativi con marcatori reporter diversi, come GFP, nonché per altri tipi cellulari ospiti, inclusi cellule primarie e linee cellulari differenziate. Sebbene il protocollo si concentri sul trattamento con composti dopo l'infezione, il flusso di lavoro può essere facilmente adattato anche per esperimenti di "time-of-addition", inclusi pre-trattamento, co-trattamento, trattamento immediatamente successivo all'infezione o trattamento ritardato, al fine di approfondire il meccanismo d'azione degli antivirali. Inizialmente, il protocollo è stato utilizzato per confrontare la funzionalità del sistema RNAi nelle cellule C6/36 e U4.414. Successivamente è stato esteso per esaminare in che modo l'RNA a doppio filamento (dsRNA) diretto contro il virus inibisce l'espressione del marcatore virale15.

Possono sorgere alcune difficoltà nell'utilizzo di questo protocollo. I virus reporter, sebbene molto utili per numerose applicazioni in vivo29 e in vitro30, possono presentare una minore virulenza31 e instabilità genetica dei geni reporter32. Il distacco cellulare causato da una sovraconfluenza può ostacolare una chiara visualizzazione e acquisizione delle immagini, influendo così sul conteggio cellulare. Un'esposizione prolungata a coloranti per cellule vive (ad esempio, Hoechst 33342 per i nuclei) può alterare il comportamento o la vitalità cellulare15. Inoltre, esperimenti che coinvolgono alphavirus altamente patogeni, come il CHIKV, potrebbero richiedere misure di biosicurezza più rigorose e le corrispondenti modifiche al protocollo. Inoltre, in alcuni casi può verificarsi una deriva del fuoco a causa della variabilità delle piastre o dell'utilizzo di piastre diverse. Ad esempio, nei piatti trasparenti per colture cellulari i segnali di fluorescenza possono fuoriuscire da un pozzetto all'altro adiacente, mentre le piastre bianche possono causare sovraesposizione. In entrambi i casi, l'accuratezza della misurazione del segnale fluorescente risulterà compromessa.

Questo protocollo presenta diversi vantaggi rispetto ai saggi virologici convenzionali. Ad esempio, i saggi di formazione di placche e i saggi TCID50 forniscono dati finali sulle titolazioni virali12. Inoltre, la qPCR consente una rilevazione sensibile dell'RNA virale, ma non è in grado di distinguere tra virus con capacità replicativa e particelle virali non infettive o acidi nucleici residui. Al contrario, questo tipo di imaging fluorescente in tempo reale permette una valutazione continua e non invasiva della progressione virale, della diffusione e degli effetti dei trattamenti all'interno della stessa popolazione cellulare nel tempo.

Oltre allo studio degli inibitori della furina come composti antivirali, il nostro protocollo può essere adattato per altre applicazioni. È particolarmente adatto per lo screening di farmaci antivirali, consentendo la quantificazione di risposte dose-dipendenti a diversi composti. Fornisce una piattaforma per lo studio delle interazioni ospite-patogeno, inclusi i tempi e la localizzazione dell'ingresso virale, della replicazione e della diffusione. Può essere utilizzato per confrontare virus reporter, diverse ceppi o diversi alfavirus. Inoltre, può essere abbinato ad approcci come il silenziamento genico mediante siRNA o dsRNA. Pertanto, questo sistema può contribuire all'identificazione e alla validazione di bersagli critici e di composti antivirali per la replicazione virale. Tuttavia, questo saggio basato sulla fluorescenza rappresenta un approccio di screening iniziale piuttosto che un metodo confermativo autonomo; ulteriori indagini, inclusi saggi con virus selvatici, saranno necessarie per confermare i risultati dello screening.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Prof. Dr. Andres Merits, dell'Università di Tartu, Estonia, e il Prof. Dr. Andreas Pichlmair, dell'Università Tecnica di Monaco, Germania, per aver fornito il plasmide pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Ringraziamo la Prof. Dr. Stefanie Becker, dell'Università di Medicina Veterinaria di Hannover, Germania, per le cellule C6/36. Ringraziamo il Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, dell'Università di Marburgo, Marburgo, Germania, per aver fornito gli inibitori della furina. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz del Ministero della Formazione Superiore, della Ricerca e degli Affari Culturali dello stato della Renania-Palatinato attraverso il LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG) con codice di finanziamento: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, e dal BMFTR (Progetto ASCRIBE - Numero di Borsa 01KI2024).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina Bovina Frakzione V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
Cellule BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Germania603126
FLASKO PER COLTURA CELLULARE, 50 ML, 25 cm2, PS, tappo a vite con filtro rosso, trasparente, CELLSTAR, TC, sterileGreiner Bio-One690175
Piastra micro per coltura cellulare, 24 pozzetti, PS, fondo F, (pozzetto a ciminiera), trasparente, CELLSTAR, TC, coperchio con anelli anticondensa, sterileGreiner Bio-One662160
Piastra micro per coltura cellulare, 96 pozzetti, PS, fondo F, (pozzetto a ciminiera), µCLEAR, nera, CELLSTAR, TC, coperchio con anelli anticondensa, sterileGreiner Bio-One655090
Piastra micro per coltura cellulare, 96 pozzetti, PS, fondo F, (pozzetto a ciminiera), trasparente, CELLSTAR, TC, coperchio con anelli anticondensa, sterileGreiner Bio-One655180
Piastra micro per coltura cellulare, 96 pozzetti, PS, fondo V, trasparenteGreiner Bio-One651101
Scalpello per celluleVWR734-2602
Saggio di Viabilità Cellulare Chemiluminescente CellTiter-GloPromegaG7573
Lettore multimodale per imaging cellulare Cytation 5Biotek
Cubo filtro DAPI 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
Mezzo Dulbecco Modificato di Eagle (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Siero Fetale BovinoFisher Scientific11550356
Inibitore della furina MI-1130Questo studio
Inibitore della furina MI-1131Questo studio
Inibitore della furina MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Software Gen5 PrimeBiotek
Sale di calcio ionomicina, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Mezzo L-15 di Leibovitz, integrato con GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Reagente per trasfezione Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Aminoacidi non essenziali MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Piastra micro, PS, 96 pozzetti, fondo F, (pozzetto a ciminiera), nera, Fluotrac, legame medioGreiner Bio-One655076
Reagente NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Università di Tartu, Estonia) e Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Università Tecnica di Monaco, Germania)
Cubo filtro Texas Red 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Brodo Tryptose Fosfato Thermo Fisher Scientific18050039
Cellule U4.4Istituto Friedrich-Loeffler, Istituto Federale di Ricerca per la Salute Animale, Greifswald, Germania
Sigillante Viewseal, trasparenteGreiner Bio-One676070

Riferimenti

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

Ristampe e permessi

Tag

Screening antiviralemicroscopia a fluorescenzaanalisi dell immaginedinamica dell infezionecinetica di replicazionediffusione cellula cellulascreening ad alta produttivitcomposti antivirali
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.