Generazione di un modello basato su organoidi prostatici di topo per studiare le interazioni ospite-patogeno

Summary

Questo protocollo descrive la generazione di un modello murino basato su organoidi prostatici coltivato in 2D. Include dissociazione organoide, semina cellulare, differenziazione, valutazione dell'integrità epiteliale e infezione in vitro con Escherichia coli uropatogeno. Il modello offre accessibilità apicale ed è adatto allo studio delle interazioni ospite-patogeno, superando le limitazioni dei tradizionali sistemi organoidi 3D.

Abstract

Gli uomini anziani sono fortemente colpiti da malattie della prostata, come l'iperplasia benigna della prostatica, la prostatite e il cancro alla prostata. Insieme, queste condizioni contribuiscono in modo significativo al carico globale della salute e rappresentano una delle principali cause di malattie negli uomini. I modelli organoidi hanno trasformato la modellazione delle malattie permettendo la replicazione in vitro di caratteristiche chiave della struttura e della funzione epiteliale. Tuttavia, la struttura del lumen chiuso degli organoidi limita l'accesso sperimentale alla superficie apicale, ostacolando gli studi delle interazioni ospite-patogeno. Per superare queste sfide, abbiamo generato un sistema di coltura fisiologicamente rilevante in cui cellule derivate da organoidi prostatici di topo vengono inserite come un modello bidimensionale (2D). Questo approccio mantiene caratteristiche epiteliali essenziali fornendo al contempo un accesso diretto alla superficie apale. Questo protocollo passo dopo passo descrive la dissociazione degli organoidi prostatici maturi del topo e le condizioni ottimali di semina per supportare l'attacco, la proliferazione e la differenziazione cellulare. La microscopia a immunofluorescenza ha confermato l'espressione di marcatori specifici della prostata nel modello basato su organoidi e ha dimostrato una rappresentazione accurata dell'organizzazione cellulare del tessuto prostatico. Le misurazioni TEER, insieme alla F-actina e alla colorazione a giunzioni strette, hanno ulteriormente confermato la differenziazione cellulare e la formazione delle barriere. L'infezione del modello con Escherichia coli uropatogena (UPEC) ha dimostrato la sua utilità nell'indagare le interazioni ospite-patogeno. Questo modello fornisce una piattaforma preziosa per indagare la biologia epiteliale della prostata e i meccanismi delle malattie, ed è particolarmente adatto per studiare le interazioni ospite-patogeno e valutare potenziali strategie terapeutiche.

Introduction

La ghiandola prostatica è un piccolo organo situato sotto la vescica, che circonda l'uretra. È un organo essenziale del tratto riproduttivo maschile e la sua funzione principale è produrre il liquido prostatico. Questo fluido rappresenta fino al 30% del plasma seminale ed è fondamentale per nutrire e proteggere lo spermatozoo durante il suo percorso attraverso il tratto riproduttivo^femminile. Le malattie della prostata, come la prostatite, l'iperplasia prostatica benigna e il cancro alla prostata, sono altamente diffuse e rappresentano un peso significativo per l'assistenza sanitaria^{a livello mondiale} 2,3,4,5. Sebbene l'iperplasia prostatica benigna e il cancro alla prostata siano ampiamente studiati, la prostatite, e in particolare la prostatite batterica, rimangono relativamente poco studiate. La prostatite colpisce fino al 16% degli uomini^{a livello globale 6,7}, con infezioni batteriche che rappresentano circa il 10% dei casi. Nonostante la sua prevalenza, la prostatite batterica è ancora poco compresa. I ceppi di Escherichia coli (E. coli), in particolare E. coli uropatogeno (UPEC), sono la principale causa di prostatite^{batterica 8,9}.

La ricerca sui meccanismi molecolari dell'infezione prostatica rimane limitata dall'assenza di modelli in vitro fisiologicamente rilevanti. La maggior parte degli studi sulla malattia prostatica si è tradizionalmente basata su linee cellulari o modelli animali. In particolare, linee cellulari tumorali o trasformate come LNCaP o RWPE-1 sono state ampiamente utilizzate per modellare la malattia prostatica e la risposta al^trattamento 10,11,12,13. Tuttavia, questi modelli mancano della composizione cellulare e della complessità di un epitelio prostatico sano o canceroso. Inoltre, molti altri studi hanno impiegato modelli animali (principalmente modelli di topo) per studiare diverse ipotesi riguardanti infezione prostatica, risposta immunitaria, crescita del tumore prostatico e metastasi 14,15,16,17. Sebbene questi modelli siano stati i più avanzati e informativi finora, sollevano tipicamente questioni etiche, richiedono tempo e risorse considerevoli e possono essere costosi. In alternativa, espiantili tessuti ex vivo e colture cellulari primarie sono stati utilizzati anche per studi a breve termine sulle risposte tissuti a farmaci o allo sviluppo del cancro 18,19,20. Tuttavia, questi modelli hanno una durata di vita limitata e la disponibilità di tessuto umano fresco è spesso limitata.

Colture organoidi tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali adulte sono emerse come un'alternativa promettente per modellare i tessuti epiteliali in vitro. A differenza delle linee cellulari convenzionali, gli organoidi mantengono caratteristiche chiave dell'epitelio originale, come l'eterogeneità cellulare, l'architettura specifica del tessuto e le caratteristiche^funzionali 21,22,23. A differenza delle colture cellulari primarie o degli espianti ex vivo, le colture organoidi possono essere espanse e passate in un lungo periodo di tempo senza diventare senescenti. Queste proprietà rendono i sistemi organoidi particolarmente adatti allo studio delle interazioni tra malattie e ospite-patogeno in un contesto fisiologicamente rilevante. Gli organoidi prostatici sono stati generati da tessuti umani sani e cancerosi, così come da modelli murini, e utilizzati principalmente nella ricerca sul cancro^{alla prostata} 24,25,26. Tuttavia, per gli studi sulle infezioni, la struttura 3D degli organoidi rappresenta una sfida significativa, principalmente a causa dell'accesso limitato alla superficie cellulare luminale. Tradizionalmente, organoidi 3D intatti sono stati infettati o tramite microiniezione dell'agente patogeno, oppure dissociando prima l'organoide in frammenti o singole cellule prima dell'incubazione con il^{patogeno 23}. Qui, la variabilità di dimensioni e struttura 3D può influenzare la riproducibilità e la produttività. In alternativa, gli organoidi apical-out offrono un modo per superare la limitazione dell'inaccessibilità del lume. La coltivazione degli organoidi in sospensione, sia in piastre di coltura tissutale a attacco ultra-basso sia su superfici rivestite da tensioattivi non adesivi, induce un'inversione della polarità organoide. Di conseguenza, la superficie apicale è rivolta verso l'esterno, permettendo l'accesso diretto agli studi di infezione da^{patogeno 27,28}. Tuttavia, queste colture non possono essere mantenute a lungo termine e la variabilità nella dimensione degli organoidi e nel numero cellulare complica la determinazione della molteplicità delle infezioni (MOI). Inoltre, i meccanismi alla base dell'inversione della polarità e dei suoi effetti sulle cellule organoidi non sono ancora pienamente compresi. Per superare i limiti degli organoidi come modelli di infezione in vitro, sono stati sviluppati modelli a base di organoidi accessibili apicamente utilizzando organoidi provenienti da organi come stomaco, intestino o^polmone 29,30,31. Tali sistemi preservano le principali caratteristiche epiteliali e permettono una manipolazione, l'imaging e l'esposizione controllata a patogeni e/o farmaci più facili. Tuttavia, le condizioni di coltura che permettono la differenziazione cellulare non si traducono sempre dalle colture organoidi ai modelli di colture 2D^31,32.

Qui descriviamo un protocollo per generare un modello epiteliale prostatico accessibile apicamente utilizzando organoidi prostatici di topo. Questo modello era stato precedentemente sviluppato e validato nel nostro laboratorio, dove abbiamo dimostrato la sua forte somiglianza con il tessuto prostatico nativo e la sua rilevanza per studi di biologia delle infezioni che coinvolgevano UPEC³². Il sistema imita da vicino la composizione cellulare e la polarità dell'epitelio prostatico, offrendo al contempo una maggiore accessibilità per la manipolazione sperimentale. Inoltre, ne dimostriamo l'applicabilità nello studio delle interazioni ospite-patogeno nella prostata, offrendo un'alternativa più pratica ai modelli in vivo e un sistema fisiologicamente più rilevante rispetto alle linee cellulari convenzionali o ai modelli organoidi 3D.

Protocol

Dichiarazione etica: Tutte le procedure animali rispettavano le linee guida per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Würzburg e sono state approvate secondo le normative istituzionali e governative pertinenti. Solo topi WT che erano stati eutanasiati nel nostro istituto da altri gruppi di ricerca per scopi indipendenti sono stati utilizzati in questo studio. Nessun animale è stato sacrificato specificamente per questo lavoro, in conformità con i principi delle 3R (sostituzione, riduzione e perfezionamento).

NOTA: Il protocollo presentato qui si basa su uno studio precedente pubblicato dagli^{autori 32}. Tutti i passaggi descritti in questo documento devono essere eseguiti in un armadietto sterile di biosicurezza, utilizzando le tecniche asettiche applicabili e l'uso di dispositivi di protezione individuale appropriati. Gli organoidi prostatici murini sono stati generati da topi C57BL/6 e mantenuti in coltura 3D, come descritto^{in precedenza 25,26}. Per seguire i principi delle 3R, la struttura veterinaria donava prostate di topo da topi WT ingenui non trattati (almeno 6 mesi) sacrificati per altri motivi. Per un breve periodo, le prostate del topo sono state tritate e digerite in due fasi utilizzando collagenasi e TrypLE Express Enzyme. Le cellule sono poi state seminate in gocce di matrice extracellulare (ECM) per generare gli organoidi 3D. Il substrato di coltura veniva aggiunto alla coltura e rifornito ogni 3 giorni. Le colture organoidi 3D venivano effettuate una volta a settimana e utilizzate per la semina 2D dal passaggio 3 in poi. Organoidi prostatici di topo di una settimana sono stati utilizzati per inserire il modello basato su organoidi su una superficie 2D seguendo il protocollo attuale. Non è necessario rivestire le piastre di coltura tissutale con proteine ECM per questo protocollo.

1. Generazione del modello basato su organoidi prostatici

1. Isolamento organoide 3D
   1. Aspirare il mezzo dal numero desiderato di pozzetti di organoidi 3D da una piastra a 24 pozzi. Sostituiscilo con 500 μL di adDMEM/F12+/+ per pozzo (vedi Tabella dei Materiali).
   2. Usa una pipetta P1000 per disturbare meccanicamente la caduta dell'ECM. Raccogli la sospensione in un tubo conico da 15 mL. Raccogli al massimo due pozzi per tubo.
   3. Ricarica con adDMEM/F12+/+ fino a 10 mL. Delicatamente, inverti il tubo 3-4 volte per mescolare. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
2. Disturbo organoide 3D in singole cellule
   1. Aspira il soprandante. Risospendere il pellet in 2 mL di enzima TrypLE Express preriscaldata (37 °C) integrata con 10 μM RHOKi.
   2. Incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti. Usa una pipetta P1000 per mescolare la sospensione delle celle ogni 5 minuti.
      NOTA: Controlla la sospensione cellulare sotto un microscopio rovesciato usando un obiettivo 4x per verificare che le cellule siano per lo più singole. Piccoli gruppi di 2-3 cellule sono accettabili. Tipicamente, 15 minuti di incubazione sono sufficienti, ma questo può essere prolungato se necessario.
   3. Aggiungi 10 mL di adDMEM/F12+/+. Delicatamente, inverti il tubo 3-4 volte per mescolare. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.
3. Sospensione a piastra singola
   1. Aspira il sovrandanante senza disturbare il pellet. Risospendere la pellet cellulare in un mezzo di coltura integrato con 10 μM RHOKi (300 μL di mezzo di coltura per pozzetto di organoidi 3D utilizzati nello step 1.1.1).
      NOTA: Il mezzo di coltura è composto da: Advance Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-acetilcisteina, mezzo condizionato Noggin al 10%, 10% R-spondin 1 mezzo condizionato, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-diidrotestosterone (DHT), 0,2 μM TGFβi e 100 ng·^mL-1 Primocina (vedi Tabella dei Materiali). Per gli esperimenti di infezione, usa un mezzo di coltura senza Primocina.
   2. Contare il numero di celle nella sospensione utilizzando una camera di conteggio di Neubauer.
   3. Diluire la sospensione cellulare in mezzo colturale integrato con 10 μM RHOKi fino a una concentrazione di 62.500 cellule·^mL-1. Utilizzare 200 μL della sospensione cellulare per pozzo per seminare su piastre da 48 pozzi (coltura di tessuto trattata dal produttore, vedi Tabella dei materiali) oppure 300 μL per pozzo su vedute μ camerate (vedi Tabella dei materiali). Posizionare la lastra in un incubatore di colture cellulari a 37 °C e 5% di_CO2.
      NOTA: Ogni pozzo di organoidi 3D, utilizzato nello Passo 1.1.1. tipicamente produce circa 200.000 celle.
   4. Dopo un giorno, la maggior parte delle singole celle è attaccata alla superficie 2D. Cambia il mezzo di coltura ogni 2-3 giorni. La confluenza si raggiunge entro 7 giorni.
      NOTA: Assicurati che RHOKi venga aggiunto solo per la semina iniziale e non per i successivi cambi di substrato.
4. Differenziazione del modello basato sugli organoidi.
   NOTA: Segui i passaggi seguenti per ottenere un modello differenziato basato su organoidi arricchiti da cellule luminali.
   1. Aggiungi 10 nM di DHT alla sospensione della cella (passo 1.3.3). Usa un substrato di coltura integrato con 10 nM di DHT per i cambi successivi del mezzo (ogni 2-3 giorni).
      NOTA: Se non viene aggiunto DHT alla sospensione cellulare (e ai successivi cambiamenti di mezzo), il modello a base di organoidi sarà arricchito con cellule basali.

2. Misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

1. Seminare la sospensione della cellula organoide a una concentrazione di 62.500 cellule·^mL-1, utilizzando 300 μL (ottenuto nel passo 1.3.3.) su un vetriglione PET μ a 8 pozzi con 40 elettrodi per pozzo (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 300 μL di mezzo di coltura, descritto in 1.3.1, in uno dei pozzi senza cellule.
   NOTA: Il pozzo senza celle viene utilizzato come spazio vuoto per le misurazioni.
2. Collega il vetrino μ al sistema di analisi cellulare basato su impedenza (vedi Tabella dei materiali) con la stazione a 16 pozzi posizionata all'interno di un incubatore di coltura tissutale. Misura il TEER a 400 Hz per 7 giorni. Cambia il mezzo di coltura ogni 2-3 giorni.

3. Colorazione da immunofluorescenza

NOTA: Per questo metodo, assicurarsi che le cellule siano preparate in vedute μ a camera (vedi Tabella dei materiali), compatibili con applicazioni di microscopia ad alta risoluzione.

1. Nel momento selezionato, rimuovere il substrato e lavare le celle 3 volte con 1x PBS. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (evitare l'esposizione alla luce).
   ATTENZIONE: Il paraformaldeide al 4% può causare una reazione allergica cutanea, gravi danni agli occhi ed è sospettato di causare il cancro. Usa sempre l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata. Evita l'inalazione di polvere, fumi, gas, nebbie, vapori o spruzzi. Indossa guanti protettivi e assicurati che i vestiti contaminati rimangano all'interno del laboratorio fino alla corretta decontaminazione. Smaltire i contenuti e i contenitori tramite un impianto di smaltimento dei rifiuti approvato.
2. Dopo la fissazione, lava le cellule 3 volte con 1 buco di soppressione (5 min ciascuno). Permeabilizza le celle con 0,5% di Triton X-100 (vedi Tabella dei Materiali) per 15 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: Il Triton X-100 provoca irritazione cutanea e gravi danni agli occhi. È molto tossico per la vita acquatica con effetti duraturi e può causare disturbi endocrini nell'ambiente. Durante la maneggiazione, indossa guanti protettivi, protezione per occhi e viso. Smaltire i contenuti e i contenitori tramite un impianto di smaltimento dei rifiuti approvato. Evita di essere rilasciato nell'ambiente.
3. Lava le cellule due volte con 1 PBS (5 min ciascuno). Bloccare le celle con un buffer bloccante (1% di BSA in PBS, vedi Tabella dei Materiali) per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Diluire gli anticorpi primari nel tampone bloccante (1% di BSA in 1x PBS) e incubare con le cellule durante la notte a 4 °C su una piattaforma oscillante. Il giorno seguente, incubare 1 ora a temperatura ambiente. (vedi Tabella dei materiali per le diluizioni degli anticorpi).
   NOTA: Per la colorazione della F-actina con falloidina o membrana plasmatica con CellMask (vedi Tabella dei materiali), saltare il passo 3.4.
5. Lava le cellule 3 volte con 1 soffio di soffio (5 min ciascuno). Diluire gli anticorpi secondari, falloidina o CellMask (vedi Tabella dei materiali) in un tampone bloccante (1% di BSA in 1x PBS) e incubare con le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lava le cellule 3 volte con 1 soffio di soffio (5 min ciascuno). Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente con Hoechst (vedi Tabella dei Materiali) diluito in 1x PBS per colorare i nuclei.
7. Lava le cellule 3 volte con 1x PBS (5 min ciascuno) e lascia le celle con 1x PBS. Conserva a 4 °C.
8. Immagini le vetri a camera di μ (vedi Tabella dei Materiali) in una microscopia confocale a scansione laser o in un microscopio a fluorescenza.
   NOTA: Le immagini panoramiche potrebbero essere acquisite utilizzando un obiettivo 20x su un microscopio a fluorescenza per valutare l'efficienza e la distribuzione complessiva dell'infezione. Immagini ad alta risoluzione sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo di immersione in acqua di 40x per visualizzare i singoli batteri attaccati o interiorizzati all'interno delle cellule epiteliali. I fluorofori venivano eccitati usando linee laser a 405, 499, 590 e 653 nm, a seconda dei fluorofori utilizzati. L'emissione è stata rilevata con finestre di emissione impostate a 415-516 nm per Hoechst, 509-573 nm per GFP o Alexa 488, 600-651 nm per mcherry o Alexa 594, e 663-720 nm per Alexa 647. Gli stack Z sono stati acquisiti con una dimensione di passo di 0,5 μm e coprendo tutto lo spessore dello strato epiteliale. Le immagini sono state acquisite a una risoluzione di 1024 per 1024 pixel, con una frequenza di scansione di 400 Hz e una media dei fotogrammi impostata su 4, che garantisce una buona qualità dell'immagine. La potenza del laser e il guadagno del rilevatore sono stati mantenuti costanti in tutte le condizioni all'interno dello stesso esperimento. Tutti i parametri di immagini, inclusi potenza laser, guadagno del rilevatore, velocità di scansione e media, devono essere ottimizzati e regolati secondo necessità a seconda del microscopio confocale utilizzato.

4. Infezione batterica da E. coli uropatogeno (UPEC)

NOTA: Assicurarsi di utilizzare un modello a base di organoidi mantenuto per 7 giorni senza Primocin (vedi Tabella dei Materiali) per i passaggi seguenti.

In questo studio è stato utilizzato il ceppo uropatogeno di E. coli UTI89, che esprime costitutivamente una proteina mCherry dal plasmide pFPV-mCherry (resistente all'ampicillina).

ATTENZIONE: Quando si maneggiano patogeni infettivi (Livello di Biosicurezza 2), indossa guanti e una protezione adeguata per occhi e viso. Indossa sempre un camice da laboratorio completamente abbottonato. Esegui tutte le procedure all'interno di un armadietto certificato per la sicurezza biologica. Decontamina le superfici di lavoro e lava accuratamente le mani dopo aver maneggiato materiali biologici. Raccogliere i rifiuti BSL-2 in contenitori designati per il biopericolo, adatti all'autoclavaggio. Decontaminare i materiali di scarto prima dello smaltimento tramite autoclavaggio o altri metodi di decontaminazione adeguati.

1. Tre giorni prima dell'esperimento di infezione, si fa stirare il ceppo UPEC su una piastra agar LB integrata con l'antibiotico corrispondente (in questo protocollo è stata utilizzata ampicillina 100 μg·^mL-1 ) e incubare 16-24 ore a 37 °C.
   ATTENZIONE: Alcuni antibiotici possono causare reazioni allergiche o irritazioni al contatto e contribuire alla resistenza antimicrobica se scartati in modo improprio. Preparate e aggiungete sempre gli antibiotici all'interno di un armadietto di sicurezza biologica indossando l'attrezzatura di protezione personale adeguata (guanti e protezione oculare). Smaltire le soluzioni contenenti antibiotici come rifiuti chimici tramite un impianto di smaltimento dei rifiuti approvato.
2. Due giorni prima dell'esperimento di infezione, inoculare 3 mL di brodo LB integrato con l'antibiotico corrispondente (ampicillina 100 μg·^mL-1) utilizzando una singola colonia UPEC dalla piastra agar (passo 4.1). Incubare staticamente a 37 °C per 12-16 ore.
3. Un giorno prima dell'esperimento di infezione, si vortice la coltura batterica dello step 4.2 e si misura il suo OD₆₀₀. Calcola il volume di questa coltura necessario per inoculare 3 mL di brodo LB integrato con ampicillina (100 μg·^mL-1) fino a un OD_{iniziale di 600} di 0,05 usando la seguente formula: Volume (μL) = (0,05 * 3.000 μL) / OD_{misurato 600}. Aggiungi il volume calcolato della cultura dal passo 4.2. al brodo fresco LB e incubare staticamente a 37 °C per 24 ore.
   NOTA: L'OD₆₀₀ della coltura notturna del passaggio 4.2 dovrebbe essere compresa tra 1.7 e 2.2.
4. Il giorno dell'infezione, si vortice la coltura batterica dal passaggio 4.3 e si misura il suo OD₆₀₀. Raccogli OD₆₀₀ 1 dalla coltura, poi centrifuga a 12.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovi il soprannatante.
5. Risospendere in 1 mL di mezzo organoide privo di primocina senza DHT. Diluisci a un MOI di 100.
   NOTA: Ogni pozzo in una piastra da 48 pozzi è considerato avere circa 150.000 celle al giorno 7. Questa stima è stata ottenuta contando cellule in un periodo ben prima dell'infezione attraverso più esperimenti. Per regolare accuratamente il MOI, si consiglia di seminare un pozzo extra per il conteggio cellulare prima dell'infezione. Per determinare il volume di sospensione batterica (passo 4.4) richiesto, moltiplicare il numero di cellule per pozzo per il MOI per ottenere il numero totale di batteri necessari per pozzo, poi dividere questo numero per la concentrazione batterica (8 × 10⁵ batteri/μL) per ottenere il volume in μL.
6. Sostituire il mezzo di coltura del modello a base di organoidi con un mezzo di coltura contenente batteri. Regolare il volume in base alla superficie di coltura: utilizzare 200 μL per pozzo per piastre da 48 pozzi e 300 μL per pozzo per μ vetrine. Incubare per 1 ora in un incubatore di colture cellulari a 37 °C e al 5% di_CO2.
7. Dopo il periodo di incubazione, aspirare il mezzo contenente batteri dal modello a base di organoidi. Lava il pozzo 3 volte con adDMEM/F12+/+ per rimuovere i batteri extracellulari.
8. Aggiungi un mezzo di coltura contenente 50 μg·^mL-1 gentamicina per uccidere i batteri extracellulari. Incubalo per 30 minuti.
   NOTA: La concentrazione di gentamicina potrebbe dover essere regolata a seconda del ceppo batterico utilizzato. Se si utilizza una concentrazione superiore a 50 μg·^mL-1, si consiglia di verificare la citotossicità cellulare.
9. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con un substrato fresco integrato con 10 μg·^mL-1 gentamicina per il tempo rimanente dell'infezione.
   Processare le cellule infette per la colorazione a fluorescenza, seguendo la sezione 3, oppure per la quantificazione tramite citometria di flusso, seguendo la sezione 5.

5. Quantificazione dell'infezione tramite citometria di flusso

1. Aspira il mezzo di coltura e lava le cellule 3 volte con 1x PBS. Usa 100 μL di enzima TrypLE Express per staccare le cellule. Incuba per 5-10 minuti finché tutte le cellule non si staccano.
   NOTA: Un pozzo da una piastra da 48 pozzi è sufficiente per condizione.
2. Raccogli la sospensione della cella e trasferiscila in un pozzo di una piastra a 96 pozzi (fondo conico). Aggiungi 100 μL di buffer citometro a flusso (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA) sopra per inattivare l'enzima TrypLE Express.
3. Centrifuga la piastra da 96 pozzi a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet in 150 μL di buffer citometro a flusso.
4. Acquisire e quantificare le cellule infette utilizzando il citometro a flusso (vedi Tabella dei Materiali).
   NOTA: La citometria a flusso è stata eseguita utilizzando un laser di eccitazione da 488 nm e un filtro di emissione da 615/20 nm per la rilevazione delle cellule mCherry-positive. I dati sono stati acquisiti a un alto flusso (66 μL·min⁻¹), raccogliendo almeno 10.000 eventi per campione e includendo solo eventi con valori di altezza di scatter in avanti superiori a 80.000. Le cellule infette sono state identificate sulla base della fluorescenza di mCherry rispetto a un controllo non infetto (ingenuo), dopo l'esclusione di detriti e doppietti. Un marcatore di vitalità (ad esempio, iodio di propidio o altre colorazioni vive/morte) può essere incluso nella strategia di gating per valutare la vitalità cellulare. Questo può essere particolarmente utile quando si lavora per la prima volta con il modello per garantire che la dissociazione cellulare non influisca negativamente sulle cellule.

Results

Questo protocollo descrive la generazione di un modello organoide dell'epitelio prostatico del topo che riproduce il tipo cellulare e l'espressione trascrizionale del compartimento epiteliale del tessuto nativo. Questo modello viene generato utilizzando organoidi 3D di cellule staminali adulte generati da tessuto prostatico di topo adulto. Queste colture organoidi vengono poi mantenute in coltura e passate settimanalmente. Per il modello basato su organoidi, il primo passo del flusso di lavoro (Figura 1A) inizia utilizzando organoidi 3D vecchi di 7 giorni. Questo periodo di tempo è necessario affinché raggiungano una dimensione e una densità cellulare appropriate per la successiva semina su una superficie 2D. Dopo il passaggio di scena, piccoli frammenti di organoidi (Figura 1B, Giorno 0) venivano seminati nell'ECM e lasciati crescere. Col tempo, crescono fino a diventare grandi strutture sferiche con un lumen interno definito entro il settimo giorno (Figura 1B). Dopo aver dissociato gli organoidi di 7 giorni in singole cellule, le cellule sono state seminate su una piastra trattata con coltura tissutale (Figura 1C, Giorno 0) utilizzando lo stesso mezzo di coltura delle colture organoidi 3D (1nM DHT) per formare un monostrato. Al primo giorno, le cellule aderite avevano iniziato a proliferare. Nei giorni successivi, il monostrato si è espanso e ha raggiunto la confluenza tra il Giorno 3 e il Giorno 5, come osservato dalla microscopia a campo chiaro (Figura 1C). Per caratterizzare i cambiamenti morfologici nel tempo e monitorare il momento in cui il modello basato sull'organoide raggiunge la confluenza, abbiamo colorato la membrana plasmatica con CellMask ed eseguito immagini di fluorescenza in più momenti temporali (Figura 1D).

Poiché la segnalazione dei recettori degli androgeni (AR) è un regolatore chiave della differenziazione cellulare nella prostata, e la modulazione della concentrazione di testosterone (o DHT) nel mezzo di coltura organoide ha dimostrato di indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in cellule basali o^{luminali 32}, abbiamo modificato i livelli di DHT nel mezzo di coltura per promuovere l'arricchimento delle cellule luminali (DHT 10 nM) o delle cellule basali (nessuna DHT, Controllo; Metodo1, Figura 2A). Come mostrato nella Figura 2 (B-F), non sono state osservate differenze significative nella crescita o confluenza cellulare. Come previsto, nella condizione di controllo (mezzo di coltura organoide senza DHT), la maggior parte delle cellule ha espresso citocheratina 5 (KRT5), un marcatore delle cellule staminali basali prostatiche (Figura 2B,E). Al contrario, solo poche cellule hanno espresso bassi livelli di CD24a, un marcatore delle cellule prostatiche luminali differenziate (Figura 2B,F).

L'integrazione con 1 nM di DHT, come abbiamo descritto^{in precedenza con 32}, ha portato a una popolazione mista contenente sia cellule basali che luminali. Tuttavia, l'espressione di CD24a è rimasta bassa, indicando una differenziazione incompleta in cellule luminali (Figura 2C,F³²). L'aumento della DHT a 10 nM ha promosso la piena differenziazione delle cellule luminali, mantenendo comunque alcune cellule basali dopo 7 giorni di coltura (Figura 2D-F). La differenziazione dei modelli basati su organoidi può essere valutata anche tramite microscopia a campo chiaro. Sebbene le differenze tra le condizioni non siano molto chiare quando le cellule sono rade (Giorno 0 - 5, Figura 1C, Figura Supplementare 1A), la morfologia e l'aspetto cellulare diventano distinti e evidenti tra le tre condizioni di coltura tramite microscopia da campo chiaro al Giorno 7 (Figura 1C, Figura Supplementare 1A,B). In assenza di DHT, le cellule apparivano più piatte e di forma più irregolare, mentre nella DHT a 10 nM le cellule erano compattamente compatte con una disposizione poligonale, simile a una morfologia di ciottoli (Figura Supplementare 1B).

In particolare, anche le colture organoidi 3D subirono cambiamenti morfologici quando coltivate a diverse concentrazioni di DHT. In particolare, è stato osservato un chiaro aumento della dimensione organoide dipendente dalla dose, con i maggiori organoidi formati in presenza di 10 nM DHT (Figura 1B, Figura Supplementare 2A,B). Questi risultati indicano che la via AR è fondamentale non solo per la differenziazione cellulare, ma anche per modulare la dinamica di crescita degli organoidi prostatici del topo.

Per valutare l'integrità epiteliale e la polarizzazione dei modelli, abbiamo effettuato misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) nel modello a base di organoidi coltivato con DHT senza o 10 nM. I valori TEER aumentarono nel tempo in entrambe le condizioni ma risultavano sostanzialmente più alti in presenza di DHT a 10 nM (Figura 3A), indicando un aumento della funzione della barriera epiteliale. Questi risultati sono stati supportati dalla colorazione con falloidina dei filamenti di actina, che sono tipicamente organizzati in un anello apicale nelle giunzioni cellula-cellula nelle cellule epiteliali della prostata luminale. Nella condizione DHT a 10 nM, l'anello di actina appariva più definito rispetto alla condizione di controllo, coerente con un aumento della polarità cellulare e dell'organizzazione epiteliale (Figura 3B). Inoltre, l'immunocolorazione per zonula occludens 1 (ZO-1) ha rivelato un aumento delle giunzioni strette nella condizione DHT a 10 nM (Figura 3C), supportando ulteriormente l'integrità della barriera epiteliale rafforzata e la differenziazione verso un fenotipo luminale. Le proiezioni ortogonali rivelano che gli organoidi coltivati con DHT a 10 nM presentano una polarità epiteliale ben definita (Figura supplementare 3A). Le cellule basale KRT5⁺ si trovano nella parte inferiore, mentre le cellule luminali CD24a⁺ sono distribuite lungo lo strato epiteliale, mostrando una maggiore intensità di colorazione verso il lato apicale. Questa architettura è simile a quella osservata nel tessuto prostatico del topo (Figura supplementare 3B). Da segnalare che i dati dell'Human Protein Atlas mostrano che questi marcatori hanno una localizzazione comparabile nel tessuto prostatico umano, con cellule basale KRT5⁺ sottostanti a uno strato luminale CD24a⁺ (Figura supplementare 3C)³³. Al contrario, le cellule coltivate in condizioni di DHT a 1 nM non mostrano una netta separazione spaziale tra marcatori basali e luminali, e l'altezza cellulare era molto inferiore rispetto alla condizione di 10 nM (Figura supplementare 3A). Ciò indica che l'integrazione di DHT a 10 nM favorisce la differenziazione epiteliale e la polarizzazione nel modello 2D in modo paragonabile all'epitelio prostatico nativo. Poiché il modello basato su organoidi coltivato con DHT a 10 nM somiglia molto all'epitelio prostatico nativo del topo (Figura 2D, Figura Supplementare 3A,B), rappresenta una piattaforma rilevante per indagare le interazioni ospite-patogeno. Per dimostrare l'applicabilità del modello, abbiamo utilizzato come esempio le infezioni con UPEC, in particolare il ceppo UTI89, uno dei ceppi UPEC più comunemente usati nel campo del tratto genitourinario. Come mostrato nella Figura 4A, i batteri sono stati coltivati nel brodo LB per 24 ore (come descritto nel Metodo 4) e incubati insieme alle cellule per un'ora. I batteri extracellulari venivano poi uccisi con la gentamicina per quantificare l'invasione e la replicazione intracellulare. All'infezione del modello a base di organoidi, l'UPEC si è attaccata alle cellule epiteliali in alto numero (0 hpi; Figura 4B, pannello sinistro; Figura 4C). Poi, e dopo il trattamento con gentamicina (1 hpi), il numero di cellule positive UPEC è diminuito significativamente, a causa della morte batterica extracellulare (Figura 4B, pannello centrale; Figura 4C). A 24 hpi, il numero di cellule infette rimaneva invariato (Figura 4C), tuttavia, la microscopia confocale ha mostrato che i batteri intracellulari continuavano a replicarsi, formando strutture simili a comunità, simili a quelle descritte in precedenza nell'epitelio della vescica (Figura 4B, pannello destro). Le cellule infette sono state identificate tramite fluorescenza mCherry utilizzando controlli non infetti (naïvi) come riferimento, dopo l'esclusione di detriti e doppietti (Figura Supplementare 4).

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro e dell'evoluzione morfologica degli organoidi prostatici e dei modelli basati su organoidi nel tempo. (A) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale (Metodo 1). (B) Immagini in campo chiaro che mostrano lo sviluppo morfologico degli organoidi prostatici integrati con DHT a 1 nM, catturate nei giorni 0, 1, 3, 5 e 7 (da sinistra a destra). Barra della scala: 200 μm. (n = 3). (C) Immagini in campo chiaro del modello basato sull'organoide integrate con DHT di 1 nM, catturate nei giorni 0, 1, 3, 5 e 7 (da sinistra a destra). Barra della scala: 200 μm. (n = 3). (D) Immagini rappresentative di microscopia immunofluorescenza del modello organoide integrato con 1 nM DHT e colorato con CellMask (rosso), nei giorni 1, 3, 5 e 7 (da sinistra a destra). I nuclei sono stati controcolorati usando Hoechst 33342 (blu). Barra della scala: 50 μm. (n = 3) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La DHT modula la differenziazione della linea nel modello basato sugli organoidi. (A) Rappresentazione schematica delle diverse condizioni utilizzate per la differenziazione. (B-D) Immagini rappresentative di immunofluorescenza del modello organoide coltivate per 7 giorni in assenza (B) (Ctrl) o presenza di (C) 1 nM o (D) 10 nM di DHT. Le immagini sono state catturate nei giorni 1, 3, 5 e 7 (da sinistra a destra). I modelli basati su organoidi sono stati colorati per CD24a (marcatore cellulare luminale, verde) e KRT5 (marcatore cellulare basale, magenta). I nuclei sono stati controcolorati usando Hoechst 33342 (blu). Barra della scala: 50 μm. (n = 4). (E,F) Quantificazione dell'immagine delle cellule (E) KRT5⁺ e (F) CD24a⁺ nel modello a base di organoidi cresciuto senza DHT (Ctrl), 1nM o 10nM. I dati sono mostrati come percentuale di celle positive per campo visivo. Test statistico: ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il modello basato su organoidi differenziato con 10 nM DHT mostra una polarizzazione cellulare più elevata rispetto al controllo. (A) Analisi TEER del modello basato su organoidi coltivato per 7 giorni in assenza (Ctrl; rosa) e presenza di DHT (10 nM; verde). Le barre di errore rappresentano SD (n = 3). Test statistico: ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey. (B,C) Immagini rappresentative di immunofluorescenza microscopiche del modello organoide coltivate per 7 giorni senza (Ctrl; in alto) o con 10 nM DHT (in basso) e colorate per (B) F-actin (rosso) e (C) ZO-1 (rosso). I nuclei sono stati controcolorati usando Hoechst 33342 (blu). Barra della scala: 50 μm. (n = 3) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi della dinamica delle infezioni nel modello basato su organoidi. (A) Rappresentazione schematica del protocollo di infezione (sezione 4). (B) Immagini rappresentative della microscopia immunofluorescenza che mostrano il modello organoide infetto a 0, 1 e 24 ore dopo l'infezione (hpi; da sinistra a destra). L'UPEC è visualizzata in rosso. I nuclei sono stati controcolorati usando Hoechst 33342 (blu). Barra della scala: 50 μm. (n = 3). (C) Analisi della citometria a flusso delle cellule UPEC-positive (mCherry positive, cellule infette) a 0, 1 e 24 hpi. La strategia di gating è mostrata nella Figura Supplementare 4. Le barre di errore rappresentano SEM (n = 3). Test statistico: ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Evoluzione morfologica del modello basato sugli organoidi nel tempo. (A,B) Immagini in campo chiaro del modello basato su organoidi nella presenza (A) assente (Ctrl) e (B) di DHT a 10 nM, catturate nei giorni 0, 1, 3, 5 e 7 (da sinistra a destra). Barra di scala: 200 μm. (n = 3) Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: La concentrazione di DHT influisce sulla crescita degli organoidi prostatici 3D. (A) Immagini in campo chiaro del modello basato sull'organoide in assenza (Ctrl; in alto) e presenza di 10 nM DHT (in basso), fotografiate nei giorni 0, 1, 3, 5 e 7 (da sinistra a destra). Barra della scala: 200 μm. (n = 3). (B) Quantificazione della dimensione dell'organoide 3D al giorno 7 coltivata in tre condizioni diverse: nessun DHT (Ctrl; rosa), 1 nM DHT (viola) e 10 nM DHT (verde). Test statistico: ANOVA unidirezionale con test post hoc di Tukey (n = 3). Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 3: Caratterizzazione della morfologia organoide prostatica e della polarità epiteliale. (A) Proiezioni ortogonali di pile z confocali che illustrano l'organizzazione epiteliale e la polarità apicale-basale sotto diverse concentrazioni di DHT (Ctrl, 1 nM e 10 nM DHT). Le cellule basale sono state colorate per KRT5 (magenta) e quelle luminali per CD24a (verde). Barra di scala: 50 μm.(B) Colorazione immunofluorescenza del tessuto prostatico topo incorporato in OCT mostrando marcatori epiteliali basali (KRT5, magenta) e luminali (CD24a, verde). I nuclei sono controcolorati con DAPI (blu). Barra della scala: 50 μm. In breve, i pezzi di tessuto topino sono stati fissati con il 4% di PFA, disidratati durante la notte con il 30% di saccarosio e inseriti con^{OCT con 32}. Le vetrine sono state poi reidratate in PBS per 10 minuti e immunocolorate dopo la sezione 3. (C) Analisi immunoistochimica dell'espressione proteica CD24a e KRT5 nel tessuto prostatico umano (il pannello C è stato estratto dal Human Protein Atlas Database (versione 25.0; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. et al(2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 4: Strategia di citometria a flusso per identificare le cellule infette. Le celle sono state inizialmente gategate in base all'altezza di dispersione laterale (SSC-H) rispetto all'altezza di scatter frontale (FSC-H) per escludere i detriti, seguite da gating su SSC-H contro area di dispersione laterale (SSC-A) per selezionare singole celle. Le cellule mCherry-positive (infette) sono state quindi identificate utilizzando i conteggi rispetto alla fluorescenza PE-Texas Red-H (istogramma). Clicca qui per scaricare questo File.

Discussion

Una serie di malattie può colpire la prostata, tra cui iperplasia prostatica benigna, prostatite e cancro alla prostata. Queste malattie sono altamente diffuse e influenzano significativamente la qualità della vita dei pazienti². Nonostante il loro impatto significativo sull'assistenza sanitaria, la nostra comprensione di queste malattie, in particolare dei meccanismi sottostanti e delle risposte dell'ospite nelle condizioni non cancerose, rimane limitata. Ciò è dovuto in gran parte alla mancanza di modelli sperimentali fisiologicamente rilevanti. Da un lato, le linee cellulari immortalate non catturano la complessità o lo stato di differenziazione dell'epitelio prostatico normale. D'altra parte, i modelli animali, principalmente i roditori, sollevano preoccupazioni etiche e non sono economici. Un approccio alternativo è l'uso di cellule primarie umane o di espianti tessuti derivati dal paziente. Tuttavia, la limitata disponibilità di tessuto prostatico fresco ne limita l'applicazione diffusa. Queste limitazioni evidenziano la necessità di altri sistemi in vitro che siano fisiologicamente rilevanti, facili da usare e gestibili sperimentalmente. In questo contesto, la tecnologia degli organoidi delle cellule staminali adulte ha trasformato la modellazione delle malattie. Queste culture 3D hanno la capacità di auto-organizzarsi, preservando l'identità epiteliale e la diversità cellulare^epiteliale 23,34,35,36,37,38. Sebbene la loro architettura 3D abbia permesso applicazioni nella ricerca sul cancro, nei test farmacologici e nella medicina^rigenerativa 23,34,35,36,37,38,39,40,41, la loro struttura chiusa, con la superficie apicale rivolta verso l'interno, pone sfide pratiche per l'accesso sperimentale, in particolare come in-vitro modelli di infezione. Gli organoidi apical-out affrontano questa limitazione invertendo la polarità epiteliale, esponendo la superficie apicale per gli studi di infezione^{diretta 27,28}. Tuttavia, la loro efficacia come modello di infezione può essere limitata dalla variabilità delle dimensioni, dall'esposizione diseguale ai patogeni e dalla fragilità durante l'infezione a lungo termine.

Qui presentiamo un protocollo per generare un modello organoide della prostata del topo che riproduce la composizione delle cellule epiteliali e il profilo trascrizionale dell'epitelio murino nativo, fornendo al contempo un facile accesso alla superficie apicale. Ottimizzato nel nostro lavoro^{precedente 32}, questo modello consente un controllo preciso su variabili sperimentali chiave, tra cui la densità di semina, l'esposizione uniforme agli stimoli, rapporti batteri-cellula (MOI) definiti e parametri di imaging ad alto rendimento che spesso sono difficili da standardizzare nei sistemi organoidi 3D convenzionali.

In linea con il principio delle 3R (Sostituire, Ridurre, Affinare) per la sperimentazione animale⁴², gli organoidi utilizzati come fonte di cellule primarie per questo modello derivano da topi selvatici e ingenui sacrificati per scopi non correlati, come l'allevamento. Le prostate vengono ottenute tramite donazioni da strutture veterinarie vicine, riducendo così la necessità di sacrificare altri animali specificamente per questo protocollo.

Una differenziazione robusta e affidabile di organoidi e modelli basati su organoidi è fondamentale per replicare fedelmente la composizione cellulare e le caratteristiche funzionali del tessuto nativo, garantendone la rilevanza come modelli in vitro. La differenziazione cellulare all'interno degli organoidi è fortemente influenzata dalla composizione specifica del mezzo di coltura, incluse le concentrazioni precise di fattori di crescita e agenti farmacologici (cioè inibitori dei farmaci). La manipolazione di questi fattori consente una differenziazione diretta verso specifiche linee cellulari, come dimostrato in vari sistemi organoidi. Ad esempio, negli organoidi intestinali, la rimozione della WNT favorisce la differenziazione degli enterociti, che può essere ulteriormente potenziata dall'interferone gamma (revisionato nel³⁸). La differenziazione nelle cellule calicifere può essere ottenuta rimuovendo inibitori di p38 e nicotinamide o tramite inibizione Notch tramite DAPT/DBZ (revisionato in³⁸). È stato inoltre dimostrato che IGF-1 e FGF-2 supportano l'espansione a lungo termine delle colture arricchite da cellule^{secretorie 43}. Inoltre, l'IL-22 potenzia la differenziazione delle cellule Paneth e le cellule enteroendocrine sorgono tramite l'inibizione di vie come Notch e BMP³⁸. Analogamente, gli organoidi gastrici e i monostrati organoidi mostrano differenziazione verso le cellule a fossetta quando la WNT viene prelevata dal mezzo di coltura, mentre l'aggiunta di nicotinamide al mezzo indirizza le cellule verso un fenotipo ghiandolare (cellule del collo e delle cellule capo⁾31,44,45.

Nella prostata, il recettore degli androgeni (AR) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi^tissutale 46,47,48,49. Il testosterone, prodotto dalle cellule di Leydig nei testicoli, viene convertito in DHT nelle cellule epiteliali prostatice tramite la 5α-reduttasi. La DHT attiva AR, che dimerizza, si trasloca al nucleo e si lega agli elementi di risposta agli androgeni per regolare i geni coinvolti nella differenziazione cellulare e^{nell'omeostasi 50}. Studi precedenti hanno dimostrato che l'integrazione di 1 nM in organoidi prostatici 3D di topo è sufficiente per ottenere la differenziazione cellulare in cellule^{luminali 51}. Altri hanno anche dimostrato che l'integrazione con vitamina D (in particolare 1,25-diidrossivitamina D) ha promosso la crescita di organoidi prostatici umani e accelerato la differenziazione inibendo l'attività canonica WNT e sopprimendo il membro della famiglia WNT^DKK3-52. Tuttavia, in questi studi sono stati utilizzati solo organoidi 3D. I nostri lavori precedenti³² e^{altri 53} hanno dimostrato che l'integrazione con 10 nM DHT in organoidi 3D non è sufficiente per ottenere una piena differenziazione. Al contrario, l'uso del modello 2D descritto qui, cioè la semina delle cellule in 2D con 10 nM di DHT, è sufficiente a differenziare il modello in uno stato simile al tessuto^{nativo 32}. Per comprendere questa differenza tra i modelli 3D e 2D, saranno necessari ulteriori lavori, ma ciò potrebbe essere spiegato dai diversi indizi meccano-fisici tra i sistemi o dalla presenza di ECM contenenti fattori di crescita nel modello 3D.

Nel tessuto prostatico adulto si trovano tre principali tipi di cellule epiteliali: cellule luminali, basali e neuroendocrine. Di questi, solo cellule luminali e basali sono presenti in tutti i modelli organoidi finora pubblicati. La mancanza di rare cellule neuroendocrine suggerisce che i protocolli organoidi attuali potrebbero non essere completamente ottimizzati. Tra cellule luminali e basali, una popolazione cellulare intermedia prostatica è stata descritta anche come uno stato di transizione che esprime sia i marcatori luminali (cioè CD24a) sia basali (cioè SCA-1)^18,51. Questa sottopopolazione si trova spesso nella regione periuretrale della prostata, motivo per cui sono spesso chiamate cellule luminali^{periuretrali 54}. Sebbene ciò sia stato riportato in alcuni sistemi organoidi 3D in condizioni specifiche di differenziazione o^{segnalazione 53,55}, non osserviamo una separazione chiara tra cellule luminali e intermedie nel nostro^{sistema 32}. Una possibile spiegazione è che durante la generazione organoide 3D non distinguiamo tra le diverse regioni prostatiche e, per evitare la contaminazione da cellule uretrali, rimuoviamo il tessuto direttamente adiacente alla connessione uretrale-prostata. Pertanto, le colture organoidi derivate da regioni prossimali o adiacenti all'uretra sono probabilmente più capaci di generare cellule intermedie.

L'integrità della barriera è considerata un segno distintivo di un epitelio maturo e differenziato, fornendo una barriera protettiva contro tossine e microbi che raggiungono il tessuto sottostante. Le giunzioni strette (ricche di proteine ZO-1⁵⁶) svolgono un ruolo vitale nella regolazione della permeabilità paracellulare e nel mantenimento dell'integrità della barriera^{epiteliale 57}. Man mano che le cellule epiteliali si differenziano, la maturazione di queste giunzioni intercellulari rafforza la barriera⁵⁸. Pertanto, la valutazione dell'integrità della barriera è un indicatore importante per un modello epiteliale in vitro . In questo protocollo, mostriamo tre metodi complementari per valutare l'integrità della barriera: misurazione TEER, immunocolorazione con ZO-1 e colorazione con F-actina. Sebbene tutti e tre i metodi valutino efficacemente l'integrità delle barriere, differiscono significativamente per le attrezzature e le risorse necessarie. Le misurazioni TEER forniscono un valore quantitativo che può essere monitorato nel tempo, offrendo una visione dinamica della funzione barriera; tuttavia, questa tecnica richiede hardware e software specializzati che potrebbero non essere disponibili in tutti i laboratori. Al contrario, la colorazione con anticorpi anti-ZO-1 o falloidina è molto più gestibile in termini di tempo e costo (ad esempio, la colorazione con falloidina può essere effettuata in circa 3 ore - sezione 3).

Questo protocollo descrive come utilizzare organoidi prostatici 3D per generare un modello 2D accessibile apicalmente. Diverse revisioni hanno illustrato i vantaggi e gli svantaggi degli organoidi e dei sistemi basati su organoidi nello studio delle interazioni ospite-patogeno 23,36,59. Negli studi di infezione, è fondamentale considerare il sito naturale di interazione tra patogeni ed epitelio dell'ospite. Nella prostata, le cellule luminali sono tipicamente il primo punto di contatto e, di conseguenza, l'accesso alla superficie apicale è essenziale per modellare accuratamente la dinamica delle infezioni. Negli organoidi prostatici 3D convenzionali, la superficie apicale è rivolta verso il lumen organoide e non è direttamente accessibile. In questi, l'esposizione al patogeno può essere ottenuta tramite microiniezione, a basso rendimento e tecnicamente impegnativa, oppure interrompendo gli organoidi, compromettendo la polarità epiteliale e portando a siti di interazione^{non fisiologici 23}. Al contrario, il modello 2D accessibile apicalmente presentato in questo protocollo offre accesso diretto alla superficie luminale. Ciò consente un'esposizione controllata e fisiologicamente rilevante ai patogeni, una regolazione precisa dell'MOI e la compatibilità con piattaforme di imaging ad alta produttività, alta risoluzione o a cellule vive. Qui mostriamo l'uso di questo modello come sistema di infezione in vitro utilizzando il ceppo di riferimento UPEC UTI89, un riferimento ampiamente utilizzato che rappresenta le principali specie batteriche responsabili della prostatite^{batterica 9}. Tuttavia, questo modello può essere facilmente adattato per studiare altri patogeni della prostata come Enterococcus faecalis o Pseudomonas aeruginosa, rendendolo una piattaforma versatile per la biologia delle infezioni nella prostata.

La dissociazione degli organoidi 3D è un passo cruciale per l'affermazione efficace del modello basato sugli organoidi. Il mancato dissociamento completo degli organoidi 3D, con conseguente grande frammento, può compromettere l'adesione cellulare alla superficie della coltura, mentre un'esposizione prolungata al reagente di dissociazione per più di 30 minuti riduce la vitalità cellulare. Inoltre, mantenere un intervallo di passaggio costante di circa sette giorni prima della dissociazione e della semina è essenziale, poiché lo stato fisiologico degli organoidi influenza fortemente la loro capacità di attaccarsi e differenziare. Un'altra variabile critica che influenza lo sviluppo di successo del modello basato su organoidi prostatici è la densità di semina. La concentrazione di semina utilizzata qui è stata ottimizzata per la differenziazione in 7 giorni. Aumentare o diminuire questa concentrazione probabilmente comporterebbe tempi di differenziazione diversi. Inoltre, una risospensione cellulare inadeguata prima della placcatura può portare a una distribuzione diseguale delle cellule tra i pozzi, con conseguente densità cellulari variabili che, a loro volta, influenzano sia la proliferazione che la differenziazione. Inoltre, come in altri modelli organoidi, diversi lotti di ECM o fattori di crescita possono influenzare la capacità di crescita e differenziazione. Pertanto, è importante verificare che il modello basato su organoidi mantenga un fenotipo coerente dopo qualsiasi cambiamento nel numero di lotto o lotto del fattore di crescita.

Una volta stabilito il modello basato sugli organoidi, anche i parametri di infezione devono essere ottimizzati con attenzione. Spesso sono necessari diversi MOI per raggiungere livelli di infezione robusti e riproducibili a seconda del ceppo batterico e della lettura scelta. Per il ceppo UPEC UTI89 (usato qui e nel³²) e per diversi isolati^{di prostatite 32}, un MOI di 100 è stato sufficiente per ottenere un numero affidabile di cellule infette nei momenti di adesione, invasione e replicazione. Tuttavia, se l'incubazione delle cellule con batteri deve essere estesa oltre 1 ora, si dovrebbe utilizzare un MOI più basso per prevenire la sovracrescita extracellulare di UPEC nel mezzo e la successiva tossicità per le cellule. In questo protocollo, l'infezione è stata valutata utilizzando due metodi: I) citometria a flusso per quantificare la proporzione di cellule infette, e II) microscopia confocale per valutare la localizzazione batterica. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri approcci, come saggi unitari per formare colonie per misurare il^{batterio 32}, immunocolorazione per rilevare l'ospite o i marcatori^{batterici 32}, o analisi trascricomiche per profilare le risposte dell'ospite.

Sebbene il modello basato su organoidi prostatici fornisca un sistema fisiologicamente rilevante, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni nell'applicarlo alla ricerca sulle infezioni. Un vincolo principale di questo modello è l'assenza di cellule immunitarie residenti o periferiche, che ne limita la capacità di catturare completamente la risposta dell'ospite all'infezione (ad esempio il reclutamento delle cellule immunitarie o la liberazione mediata dal sistema immunitario). Altri componenti essenziali mancanti nel modello includono vascolarità, stroma e nervi, tutti i quali possono influenzare le interazioni ospite-patogeno. Incorporare ulteriori tipi cellulari, come fibroblasti stromali, cellule immunitarie e cellule endoteliali, aiuterebbe a ricreare un microambiente tissutale più completo. Sistemi avanzati di co-coltura o piattaforme microfluidiche organo su chip potrebbero ulteriormente supportare interazioni cellulari complesse e consentire studi dinamici delle infezioni. Inoltre, quando si utilizzano organoidi derivati da modelli animali, devono essere considerate differenze specifiche per specie, in particolare nello studio di patogeni umani. Sebbene il nostro lavoro^{precedente 32} abbia mostrato che i risultati del modello murino basato su organoidi prostatici potessero essere riprodotti nei tessuti umani, la variazione interspecie nella regolazione genica, nell'espressione dei recettori o nelle risposte ormonali potrebbe comunque limitare la rilevanza diretta del modello per la fisiologia umana. L'incorporazione di organoidi di origine umana, quando possibile, aumenterebbe il valore traslazionale consentendo lo studio delle interazioni e risposte patogeniche specifiche dell'uomo. Sebbene queste aggiunte possano rafforzare i modelli basati su organoidi come strumenti potenti per studiare la biologia della prostata, la patogenesi delle infezioni e lo sviluppo terapeutico, il modello puramente epiteliale che presentiamo offre un sistema semplificato e compartimentato. Ciò consente un'indagine focalizzata delle interazioni specifiche ospite-patogeno epiteliale senza interferenze da parte di altri componenti tissutitori.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a 48 pozzi	Sarstedt	83.3923	Forma inferiore: piatta
5&alfa;-Androstan-17β-ol-3-one diidrotestosterone	Sigma-Aldrich	A8380	È stato designato come DHT. Soluzione standard 10 & mu; M al 100% etanolo
Slide PET a 8 pozzi con 40 elettrodi per pozzo	Biofisica applicata	8W10E+	Diapositive utilizzate per le misurazioni TEER
Piastre a 96 pozzi	Sarstedt	82.1583	Forma inferiore: conica
Advance Dulbecco' s Eagle media modificata/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028	È stato designato adDMEM/F12+/+ quando integrato con 10 mmol L− 1 HEPES e 1x GlutaMAX
Ampicilina	Roth	K029.2	Stock di concentrazione 100 mg/mL
Anticorpo anti-CD24a	Proteintech	10600-1-AP	Anticorpo primario; diluizione 1:100 in 1x PBS 1%BSA
Anti-Citocheratina 5 Alexa Fluor 647 anticorpi	Abcam	ab193895	Anticorpo primario; diluizione 1:100 in 1x PBS 1%BSA
anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Anticorpo	Invitrogen	A21441	Anticorpi secondari; diluizione 1:500 in 1x PBS 1%BSA
Anticorpo policlonale anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticorpo primario; diluizione 1:750 in 1x PBS 1%BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V, NZ-Origine	Roth	8076.3	Componente del buffer di blocco usato all'1% in 1x PBS
pozzi a micro cilindri &-Slide 8	Ibidi	80806	Modifica della superficie: ibiTreat
Tubo conico (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	Il fondo piatto è migliore per i pellet piccoli.
Etilendediamina, tetra-acetato 2H2O (EDTA) disodio	Roth	8043.2	Prodotto in casa: 93,0 g in 400 mL di H2O, regolare il pH a 8,0, regolare il volume con H2O fino a 500 mL; 0,5 M EDTA; Componente del buffer del citometro a flusso
Soluzione salina bilanciata di Dulbecco (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
ECHO Revolve Microscope	ECHO
ECIS  Z-Theta -  Sistema di analisi cellulare basato su impedenza	Biofisica applicata	ECIS  Z-Theta	Il sistema comprende: stazioni con 16 e/o 96 pozzi; modulo di controllo esterno; Laptop PC; software di controllo, acquisizione e visualizzazione ECIS; modulo di campo elevato per migrazione e elettroporazione automatica delle celle
Siero Fetale Bovino (FBS) Superiore	Sigma Aldrich	S0615	Componente del buffer del citometro a flusso; componente del mezzo colturale della linea cellulare 293T; componente del mezzo colturale HEK293T linea cellulare
Flash Phalloidin Red 594	Biolegend	424203	Diluizione 1:250 in 1x PBS 1%BSA
Buffer citometro a flusso			1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicina	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	Dipeptide L-alanyl-L-glutamina, componente dell'adDMEM/F12+/+
Harvard Biochrom Ultrospec 10 Cell Density Meter	Fisher Scientific	10704417
Colorazione rosso profondo HCS CellMask	Life Technologies	H32721	Diluizione 1:1.000 in 1x PBS 1%BSA
HEK293T linea cellulare trasfettizzata con vettore di espressione Noggin-Fc nel topo	Linea cellulare del Prof. Dr. Clevers		Utilizzato per produrre Noggin; mezzo di coltura: 500 ml DMEM, alto livello di glucosio, GlutaMAX, piruvato (Gibco Life Technologies, 31966) + 50 ml FBS; Farin et al. Gastroenterology 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	Componente di adDMEM/F12+/+
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	Diluizione 1:5.000 in 1x PBS
Fattore di crescita epidermica umana (EGF) e nbsp;	Peprotech	AF-100-15	Stock di concentrazione 500 e micro; g/mL
Anelli di inoculazione	Sarstedt	86.1567.010
Tubi di inoculazione	Sarstedt	62.515.006
Microscopio confocale Leica Stellaris 5	Leica
Brodo Luria Bertani (brodo LB)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Matrice Extracellulare (ECM)
N-Acetilcisteina	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Stock di concentrazione 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Agilent		Citometro di flusso
Paraformaldeide (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	usata al 4% in 1x PBS, 4% saccarosio
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES semi-micro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	Inibitore RhoA/ROCK; Stock di concentrazione 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1 che esprime la linea cellulare 293T	Sigma Aldrich	SCC111	Utilizzato per produrre R-spo1 CM; mezzo di coltura: 500ml DMEM, alto livello di glucosio, GlutaMAX, piruvato (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60ml FBS
TGF & beta; i (A-83-01)	Tocris	2939	Inibitore ALK4/5/7; Stock di concentrazione 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	usata allo 0,5% diluita in PBS 1x
TrypLE Enzima Expressa	Gibco	12605028	Agente enzimatico di dissociazione cellulare per digerire organoidi prostatici di topo 3D
Ceppo uropatogeno Escherichia coli ceppo UTI89	Ceppo WT dal Prof. Dr. Dobrindt		trasformata con pFPV-mCherry (addgene #20956)