Isolamento standardizzato e priming delle citochine delle cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo murino per un'immunomodulazione potenziata

Sommario

Qui dimostriamo un protocollo per isolare le cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo del topo insieme a un metodo di priming delle citochine per amplificare l'effetto immunosoppressore dei BMSC sulle cellule immunitarie.

Abstract

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) possiedono una forte funzionalità rigenerativa e immunomodulatrice. Queste proprietà rendono le MSC potenti farmaci cellulari per il trattamento di molteplici disturbi immunitari. Il midollo osseo è la fonte principale e più frequentemente utilizzata di MSC. Gli studi meccanicistici preclinici che utilizzano modelli murini sono fondamentali per acquisire conoscenze sulle strategie ottimali di somministrazione dei farmaci per le BMSC negli studi clinici sull'uomo. Pertanto, la standardizzazione del processo produttivo delle MSC murine è anche fondamentale per ottenere migliori risultati terapeutici. Uno degli obiettivi centrali di questo protocollo è dimostrare come il controllamento interferon-gamma (IFN-γ) migliori le proprietà immunosoppressive intrinseche dei BMSC. Descriviamo la generazione di mezzi condizionati (CM) da BMSC non trattati o pre-autorizzati con IFN-γ e ne valutiamo l'attività biologica utilizzando macrofagi peritoneali primari. Attraverso ELISA e profilazione citometrica a flusso, il protocollo dettaglia come il secretoma derivato dal BMSC — in particolare quando è primizzato con IFN-γ — genera la polarizzazione anti-infiammatoria dei macrofagi caratterizzata da una produzione elevata di IL-10 e marcatori superficiali associati a M2. Nel complesso, questo protocollo stabilisce un quadro unificato per produrre BMSC murini funzionalmente coerenti e per valutarne la potenza immunomodulatrice. Riducendo la variabilità tecnica e fornendo chiarezza visiva e procedurale, supporta una migliore riproducibilità nella ricerca preclinica sugli MSC e facilita strategie ottimizzate di implementazione degli MSC per studi traslazionali.

Introduzione

Le cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSC) hanno ampie applicazioni sia in studi preclinici che clinici. La loro bassa immunogenicità, la loro facile accessibilità e la capacità di differenziazione multilineage rendono i BMSC candidati promettenti per l'uso in contesti clinici come farmaci^{cellulari 1,2,3}. Le loro proprietà immunosoppressive e rigenerative sono state ampiamente sfruttate in studi clinici per trattare disturbi infiammatori come la malattia innesto contro ospite (GVHD⁾⁴, la sepsi⁵ e la malattia infiammatoria intestinale (IBD^)6. La nicchia stromale del midollo osseo comprende una popolazione cellulare stromale eterogenea. Tuttavia, tutte le MSC rispettano i criteri definiti dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare (ISCT), che includono: aderenza plastica, espressione superficiale dei recettori — CD73, CD90 e CD105 negli esseri umani, e CD29, CD44 e CD90 nei topi — senza espressione di marcatori ematopoietici o endoteliali — CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, e la capacità di uso adipogenico, condrogenica, o differenziazione^{osteogenica 7}.

I BMSC rimangono funzionali attraverso il rilascio di fattori paracrini collettivamente noti come secretoma, che includono citochine, chemicine, fattori di crescita, vescicole extracellulari e varie altre molecole solubili e dipendenti dal^{contatto 8,9}. Il secretoma delle MSC modula la nicchia interagendo con elementi del sistema immunitario innato in modo^{bidirezionale 10}. I fattori rilasciati durante le interazioni MSC-macrofagi possono spostare i macrofagi verso un fenotipo pro-infiammatorio^{o antinfiammatorio 11,12}. Al contrario, lo stato funzionale delle MSC è regolato anche dalle cellule immunitarie locali — in particolare dai macrofagi — attraverso meccanismi di feedback¹¹. Questa diafonia MSC-macrofagi è indispensabile per la funzionalità immunosoppressiva delle MSC. Le MSC trasferite adottivamente riducono l'infiammazione tissutale solo quando sono presenti macrofagi, come osservato nei modelli murini con colite. Al contrario, l'interazione delle MSC con i linfociti B o T in assenza di macrofagi è insufficiente a esercitare i loro effetti^{terapeutici 13}.

Il primo trial clinico di fase III utilizzando BMSC allogenici è stato completato da Osiris Therapeutics negli Stati Uniti per il trattamento della GVHD (NCT00366145)1 refrattaria agli steroidi^. Da allora sono stati condotti numerosi studi preclinici e clinici, anche se il successo degli studi clinici non ha soddisfatto le aspettative basate sugli esiti preclinici. Per migliorare il tasso di successo degli studi clinici basati su MSC, è essenziale ottimizzare le strategie di distribuzione dei farmaci. Comprendere la via ottimale di somministrazione, la dose delle cellule terapeutiche e lo stato fisiologico delle cellule al punto di cura è fondamentale. Ad esempio, in un modello topino di colite in vivo , studi hanno dimostrato che le MSC criopreservate o la somministrazione endovenosa sono metodi di somministrazione^{subottimali 14}.

Sono stati ampiamente studiati approcci diversi, come la pre-licenza delle citochine, la modifica genetica o il precondizionamento ipossico, per migliorare la persistenza in vivo e l'utilità terapeutica^{delle MSC 15}. Nel modello di ischemia murino dell'arto posteriore, il precondizionamento dell'ipossia (2%_O2) ha migliorato la capacità di proliferazione e migrazione delle MSC attraverso l'aumento dell'espressione della proteina da shock termico, la proteina glucosio regolata da 78 kD (GRP78)¹⁶. La pre-licenza di IL-1β (Interleukin-1 beta) aumenta la capacità delle MSC di impiegare neutrofili, monociti, linfociti ed^{eosinofili 17}. Dopo la somministrazione in vivo, le MSC sono esposte a IFNγ derivata dalle cellule T e NK attivate, che potenziano la produzione di indoleamine 2,3-dioxygenasi (IDO) da parte delle^{MSC 18}. L'IDO è un componente essenziale nel secretoma delle MSC, che riduce il tasso di proliferazione delle cellule T. È interessante notare che la capacità immunosoppressiva delle MSC si riduce quando sono co-colte con i linfociti T derivati da^{topi (IFNγ-/- 19}). Gli studi hanno identificato che la pre-licenza IFN-γ riduce il tasso di apoptosi mediata da cellule T nelle MSC^{crioppreservate 13,20}. Il priming IFNγ migliora l'esito terapeutico dei^{BMSC 13}. Tutte queste evidenze indicano collettivamente il ruolo indispensabile dell'IFNγ nella produzione di MSC immunosoppressori più potenti.

Per determinare la modalità di somministrazione più efficace degli MSC, modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per la loro accessibilità etica. Per ridurre la variabilità degli esiti preclinici, è fondamentale stabilire un metodo ottimizzato per il processo produttivo delle MSC che garantisca alta ressa, vitalità cellulare e coerenza nel^{tempo 21}. Il passaggio degli MSC è una variabile importante che può generare diversi esiti terapeutici. Durante la coltivazione in vitro , il passaggio può regolare la caratterizzazione e la potenza delle MSC e, dopo un certo numero di passaggi, le cellule diventano^{senescenti 22}. Pertanto, in qualsiasi studio clinico o preclinico, è fondamentale essere coerenti con l'uso del numero di passaggio MSC. Allo stesso modo, la coerenza con un protocollo specifico per l'isolamento delle MSC è anch'essa un fattore chiave per ottenere la riproducibilità nell'esito dell'uso delle MSC. Tra molti approcci, la selezione cellulare basata su^{anticorpi 23}, il metodo di selezione^{negativa 24} e la digestione^{enzimatica 25} sono metodi popolari per l'isolamento delle MSC. Tuttavia, l'applicabilità di questi metodi dipende dalla fonte, poiché un uso improprio riduce ressa, potenza e capacità di differenziazione trilineage.

Qui presentiamo un protocollo standardizzato per l'isolamento e la caratterizzazione dei BMSC, enfatizzando il numero di passaggio preferito, la tecnica di crioconservazione e la raccolta di mezzi di condizioni derivati dal BMSC. Forniamo inoltre un protocollo per il priming MSC mediato da IFN-γ e infine dimostriamo uno studio comparativo su come i macrofagi peritoneali rispondano differenzialmente ai BMSC normali o pre-autorizzati con IFN-γ.

Protocollo

Il presente studio è stato condotto con l'approvazione e seguendo le linee guida del comitato etico degli animali dell'ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health (Progetto IAEC n.09/23) e del Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Università del Wisconsin-Madison. Per il presente studio sono state utilizzate femmine di topi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane, riprodotte e ospitate in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF).

NOTA: Abbiamo seguito i protocolli di biosicurezza determinati dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (IBSC) durante il lavoro sugli studi in vivo o in vitro . In breve, per lo studio sugli animali, abbiamo mantenuto una maneggiamento delicato per ridurre lo stress e il rischio di infortuni. Abbiamo usato DPI appropriati, come occhiali di protezione, guanti, camice da laboratorio, mascherina e un berretto bufante usa e getta. Per i reagenti chimici biohazard come il DMSO, abbiamo utilizzato un armadietto di biosicurezza per gestire i prodotti chimici. Abbiamo usato il contenitore specifico dei rifiuti per scartare reagenti biopericolosi o oggetti appuntissimi.

1. Isolamento delle cellule stromali mesenchimali del midollo osseo murino

NOTA: Dopo la raccolta degli arti posteriori, il resto dei passaggi deve essere eseguito in una cappa a flusso laminare in coltura tissutale e in tecniche asettiche^{sterili 26}.

1. Eutanasia del topo tramite lussazione cervicale, seguita da un accurato risciacquo con etanolo al 70%. Utilizzando una pinza oftalmica, comprimi delicatamente la pelle addominale tra le due articolazioni dell'anca del topo e taglia con cura la pelle con le forbici.
2. Separare la pelle tirando delicatamente verso il piede. Taglia le articolazioni dei fianchi e la caviglia per liberare entrambi gli arti posteriori.
3. Trasferire rapidamente gli arti posteriori in DMEM gelato integrato con 1x penicillina/streptomicina e 2% di FBS per evitare danni ai tessuti fino al successivo processo di dissezione.
4. Prendi ogni ramo posteriore in una piastra di Petri contenente il substrato gelato. Rimuovere con cura il muscolo e il tessuto connettivo dal femore e dalla tibia raschiando delicatamente la diafisi dell'osso. Trasferire l'osso pulito in una nuova piastra di Petri contenente il substrato gelato.
5. Distogliere femore e tibia, seguita da un taglio alle estremità della tibia e del femore appena sotto la fine della cavità midollica. Proteggi al massimo la cavità midollica durante la procedura di dissezione del femore e della tibia.
6. Prendi una siringa sterile da 1 mL con un ago da 21 G e preleva il substrato dalla piastra di Petri. Con le pinze sterili, tieni il femore excisato e inserisci delicatamente l'ago nella cavità midollica. Risciacquo la cavità del midollo osseo per ottenere il midollo osseo. Ripeti questo passaggio finché l'osso non diventa bianco. Sciacquone la tibia allo stesso modo.
7. Pipetta delicatamente dentro e fuori per disperdere i grumi cellulari nella piastra di Petri. Utilizzando una rete filtrante da 70 mm, filtra la sospensione cellulare per rimuovere eventuali particelle ossee. Raccogli il filtrato e centrifugalo a 230 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet con mezzo intero (DMEM, FBS al 10%, 5% di L-Glutamina, penicillina e streptomicina). Misurare la resa e la vitalità delle cellule tramite esclusione di blu di Trypan e contando su un emocitometro.
9. Seminare le cellule in una fiaschetta trattata con coltura tissutale di 75^cm 2 con una densità cellulare di 5000 cellule/^{cm 2} in mezzo DMEM^{completo 13}. Rimuovere le cellule ematopoietiche non aderenti dopo 48 ore di coltura cambiando il substrato. Sostituisci il supporto con un substrato nuovo ogni 3-4 giorni alterni.
   NOTA: Usa una fiaschetta di coltura cellulare invece di una piastra per evitare contaminazioni. Non togliere spesso la fiaschetta dall'incubatrice per controllare le cellule, poiché disturba la crescita cellulare.
10. Per staccare le cellule aderenti, lavare le cellule 1 volta con PBS, aggiungere 0,25% di tripsina-EDTA, mantenere le cellule in tripsina per 5 minuti. Questo aiuta a staccare le cellule dal pozzo.
11. Aggiungi il substrato completo, risospendi e centrifuga a 230 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartate il soprannatante. Aggiungi il materiale DMEM completo al pellet, respondi e risemina le cellule a una densità di 5.000 cellule/^cm2.
12. Fai passare le cellule settimanalmente cambiando il substrato ogni 3-4 giorni. Dopo il terzo passaggio, si analizza la coltura della MSC tramite analisi citometrica a flusso come descritto nel passaggio 6. Usa le celle del passaggio 3-5 per qualsiasi esperimento.
    NOTA: Per criopreservare le celle per un uso sperimentale futuro, centrifugare le cellule al volume desiderato, risospendere le celle in mezzo congelante, conservare 1 x 10⁶ cellule in 1 mL di mezzo congelante in ogni crioviale a -80 °C durante la notte, seguita dal trasferimento delle cellule nell'azoto per un uso a lungo termine.
    Composizione dei mezzi congelanti: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. Preparazione di un mezzo condizionato da MSC coltivati

1. Seminare le cellule a una densità di 5000 cellule/^{cm, 2} in 6 piastre di pozzo. Coltiva gli MSC fino all'80% di confluente.
2. Raccogli il materiale condizionato dalla piastra di coltura cellulare e centrifuga a 230 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, filtra e usa per il trattamento.

3. Preparazione di un mezzo condizionato primizzato con IFNγ da MSC coltivati

1. Semina le cellule in 6 piastre di pozzo a una densità di 5000 cellule/^cm2. Trattare le cellule con 25 ng/mL di IFNγ per 48 ore. Esegui uno studio dipendente dalla dose per ottenere l'effetto ottimale di IFNγ sugli MSC. Per questo esperimento, si seleziona una gamma di concentrazioni di IFNγ, 5, 10, 10, 25, 50, 100 ng/mL, per pre-licenziare gli MSC. Le concentrazioni di 5 e 10 ng/mL sono state significativamente meno efficaci nella polarizzazione dei macrofagi, e 25 ng/mL è stata identificata come concentrazione ottimale (Figura Supplementare 1).
2. Dopo aver decantato il materiale contenente IFN-γ, lava il pozzo 2 volte con PBS per garantire la completa rimozione dell'IFN-γ. Qualsiasi IFN-γ residuo può interferire con l'esito dello studio.
3. Incubare le cellule per altre 24 ore in un normale mezzo DMEM a 37 °C. Dopo 24 ore, raccogli il substrato condizionato seguendo il passo 2.

4. Isolamento e coltura di macrofagi derivati dalla cavità peritoneale

1. Iniettare 5 mL di PBS gelato (con 3% di FBS) nella cavità peritoneale dei topi, seguiti da un delicato massaggio dell'addome.
2. Recupera la soluzione PBS usando una siringa sterile. Raccogli in un tubo da 10 mL. Centrifuga la soluzione a 300 x g per 5 minuti.
3. Rimuovi il soprannatante. Sciogliere il pellet in un mezzo RPMI completo (RPMI, FBS al 10%, 1x Penicillina e Streptomicina). Placca le cellule a 5000 cellule/^cm2.
4. Rimuovere le cellule non aderenti dopo 24 ore e coltivare fino alla confluenza. Utilizzare le cellule per ulteriori procedure sperimentali se necessario.

5. Saggio immunoenzimatico legato

1. Per rilevare IL-10 derivata da macrofagi trattati con BMSC-CM, si possono fare i passaggi seguenti.
   1. Trattare i macrofagi con BMSC-CM per 24 ore e raccogliere il soprantantante il giorno successivo.
   2. Misura la quantità di IL-10 utilizzando il kit IL-10 ELISA seguendo le istruzioni del produttore.
2. Per rilevare CCL2 derivato da BMSC o BMSC trattati con IFNγ, si utilizza il kit ELISA CCL2 seguendo le istruzioni del produttore.

6. Analisi della citometria a flusso per MSC e fenotipizzazione dei macrofagi

1. Semina le cellule in una lastra a 6 pozzi e trasforma la confluenza. Lavare 1 volta con PBS (1 mL) seguito dalla tripsinizzazione. Aggiungi tripsina allo 0,25% e incuba per 5 minuti in tripsina per sollevare completamente le cellule dalla placca.
2. Aggiungi un supporto per disattivare l'attività della tripsina. Raccogli le cellule in un tubo di polistirene da 10 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C per i macrofagi e 230 x g per 5 minuti a 4 °C per i BMSC.
3. Rimuovere il sovrantante e risospendere le cellule in 2 mL di tampone di colorazione (PBS gelato con 2% FBS e 0,05% azide). Centrifuga a 230 x g per 7 minuti. Decantare e interrompere il pellet. Aggiungi 1 mL di colorante Ghost Red 780 viability e 50 mL di buffer FACS, risospendilo e mettilo nel tubo di flusso. Tingere al buio per 30 minuti.
4. Dopo 30 minuti, lava le cellule con 1 mL di tampone per le tinte. Decantare e interrompere il pellet. Aggiungi il volume desiderato di anticorpo o controllo isotipo. Incubo per altri 30 minuti al buio. Lava le cellule con tampone per colori, decanta e risospendi in 400 mL di tampone per colori. Il tubo campione è pronto per l'acquisizione.
5. Per preparare il controllo della colorazione con morti vivi, dopo tripsinizzazione e centrifugazione, si scioglie il pellet in 2 mL di tampone per coloranti. Prendi 1 mL in un altro tubo microcentrifuga e aggiungi 10 mL di DMSO per uccidere le cellule. Vortice e incuba per 10 minuti. Ora mescola questo con l'altro 1 mL della soluzione contenente la cella in un tubo di scorrimento.
6. Aggiungi 1 mL di tampone per la colorazione e centrifuga a 230 x g per 7 minuti. Decantare e interrompere il pellet. Aggiungi 1 mL di colorante Ghost Red 780 viability e 50 mL di buffer FACS, risospendilo e mettilo nel tubo di flusso. Tingere al buio per 30 minuti. Dopo 30 minuti, lava le cellule con 1 mL di tampone per le tinte. Decantare e interrompere il pellet. Risospendilo in 400 mL di tampone per le macchie. Il campione macchiato vivo e morto è pronto per l'acquisizione.
   NOTA: Per la colorazione dei macrofagi del topo, dovrebbe essere aggiunto un passaggio aggiuntivo di colorazione prima del protocollo standard di colorazione. Per evitare imprecisione nei dati di flusso, il blocco del recettore FC è un passaggio critico, che previene il legame di anticorpi non specifici ai recettori Fc sulle cellule. Per bloccare il recettore Fc, aggiungere 1 mL di reagente bloccante Fc (anticorpo anti-topo purificato CD16/CD32) alla sospensione cellulare e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Esegui i passaggi residui di colorazione degli anticorpi a flusso senza lavare via il reagente bloccante Fc.
7. Per analizzare i dati di flusso, inizialmente dovrebbero essere selezionate singole celle in base ai parametri di diffusione diretta e di dispersione laterale. Questo passaggio è cruciale per rimuovere detriti e aggregati cellulari. Poi le singole cellule verranno bloccate in base alla colorazione dei vivi morti. Eseguire ulteriori analisi basate sulla popolazione di cellule vive (Figura supplementare 2).

Risultati

Lo schema sperimentale complessivo è descritto nella Figura 1. Il midollo osseo del topo è stato raccolto sia dal femore che dalla tibia, seminato, passato e caratterizzato dalla citometria in flusso (Figura 1A). Sono stati raccolti i mezzi di condizione dei BMSC (BMSC-CM) con o senza pre-licenza IFNγ, e alcune fiale di BMSCS-CM sono state conservate a -80 °C per future necessità sperimentali (Figura 1B).

Le cellule derivate dal midollo osseo sono state conteggiate tramite emocitometro (Figura 2A) e seminate a una densità di 5000 cellule/^cm2 in mezzo DMEM completo. Dopo 48 ore, il primo mezzo veniva cambiato, poi il mezzo veniva cambiato ogni 3/4 di giorno, fino alla piena confluenza. Abbiamo fatto passare le cellule quando hanno raggiunto l'80% di confluenza (Figura 2B). Nel passaggio 4, abbiamo caratterizzato le cellule sulla base dell'espressione dei marcatori specifici per MSC. Le cellule erano positive per CD44, CD29 e CD90, e negative per CD45, CD11b e CD34 (Figura 2C). I BMSC possono differenziarsi in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche 14,27,28,29. Questo mantiene le linee guida identitarie della International Society for Cellular Therapy.

Per comprendere l'effetto immunosoppressore delle MSC-CM, abbiamo trattato macrofagi derivati dalla cavità peritoneale (PMφ) e li abbiamo trattati con BMSC-CM (Figura 3A). Abbiamo eseguito un'analisi citometrica a flusso di macrofagi trattati con BMSC e CM (Figura 3B, C). I macrofagi adatti alla cultura residenti nella cavità peritoneale sono stati colorati con marcatori superficiali specifici per M1 e M2. Abbiamo prevenuto il legame degli anticorpi non specifici incubando macrofagi con CD32/CD16 anti-topo purificati (Mouse Fc Block prima di aggiungere anticorpi di colorazione), prima della vera e propria colorazione dei marcatori cellulari. È stata studiata l'espressione dei marcatori specifici per M1, CD86 e iNOS, e dei marcatori specifici per M2, CD206 e CD163. Le cellule sono state inizialmente attivate sulla base del marcatore ematopoietico CD45.2 (per C57BL6). IL-10 è la citochina simbolo del fenotipo M2. L'IL-10 rilasciato dai macrofagi trattati con MSC è stato misurato da uno studio ELISA (Figura 3D). Poiché LPS/IFNg induce la polarizzazione^{M1 30}, questo trattamento ha funzionato come controllo negativo.

CCL2 è una delle citochine simbolo identificate nel secretoma delle MSC, che innesca la polarizzazione¹³ dei macrofagi. CCL2 rilasciato dalle MSC è stato rilevato da ELISA (Figura 3E). Per confermare il ruolo di CCL2 nella polarizzazione dei macrofagi, abbiamo pretrattato i macrofagi con un inibitore CCR2 seguito dal trattamento MSC-CM (Figura 3F), e la polarizzazione dei macrofagi è stata nuovamente rilevata dallo studio IL-10 ELISA (Figura 3F).

I nostri risultati dimostrano chiaramente che il secretoma delle MSC può indurre la polarizzazione antinfiammatoria dei macrofagi, come dimostrato dall'aumento della produzione di IL-10 nei macrofagi derivati dall'intestino dopo il trattamento con mezzi condizionati (Figura 3).

Figura 1: Diagramma di flusso dello studio. (A) I topi C57BL/6 sono stati soppressi. Il midollo è stato rimosso sia dai femori che dalla tibia, centrifugato e coltivato per una settimana con il cambio del materiale ogni 3 giorni. Le MSC sono state passate e al passaggio 4 sono state caratterizzate da citometria di flusso e studio di adipogenesi. (B) Gli MSC del passaggio 4 sono stati seminati in piastre a 6 pozzi, in un set con IFNγ aggiunto a una concentrazione di 25 ng/mL, e in un altro set, lasciati non trattati. Dopo 48 ore, sostituisci con un normale materiale DMEM fresco e completo. Dopo 24 ore, raccogli il materiale dalla piastra da centrifuga e dal filtro. Conservare il materiale in condizione a -80 °C per un uso futuro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caratterizzazione fenotipica. (A) Le cellule derivate dal midollo osseo sono state contate da un emocitometro prima della semina. (B) Le cellule venivano lasciate crescere fino all'80% di confluenza prima di ogni passaggio. (C) Le cellule del passaggio 4 sono state caratterizzate da analisi citometrica di flusso con marcatori specifici MSC del muro. La barra della scala rappresenta 100 mM. La Figura 2C è stata modificata rispetto^{alla 14}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi del secretoma BM-MSC. (A) Schema degli esperimenti. (B) Analisi citometrica rappresentativa per il flusso di PMφ trattata con MSC-CM. Le cellule derivate dal peritoneo sono state disegnate sulla base della popolazione ematopoietica CD45,2-positiva. La popolazione selezionata è stata ulteriormente colorata con marcatori specifici per M1 CD86 o iNOS, marcatori specifici per M2 CD206 o CD163, insieme a doppia colorazione CD11b in ciascun caso. (C) È stata quantificata la percentuale della popolazione di cellule M1 o M2. Una popolazione cellulare trattata con LPS/IFNγ ha servito come controllo negativo. (D) ELISA è stato eseguito per quantificare l'IL-10 rilasciato dal PMφ trattato con MSC-CM. ELISA è stato eseguito per quantificare (E) CCL2 rilasciato da MSC-CM, (F) IL-10 rilasciato da PMφ. Come indicato nella figura, un set di esperimenti è stato eseguito in presenza di un antagonista CCR2. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM. Dati rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con 3 campioni MSC per gruppo. Il test t dello studente è stato utilizzato per eseguire analisi statistiche di tutti gli esperimenti. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. La Figura 3B-F è stata modificata rispetto^{a 13}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: I BMSC erano pre-autorizzati con 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg. I macrofagi sono stati trattati con MSC-CM pre-autorizzati con IFNγ. L'ELISA è stato eseguito per quantificare l'IL-10 rilasciato dal PMφ trattato con MSC-CM. Le barre di errore rappresentano la media ± SEM. Dati rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con 3 campioni MSC per gruppo. Clicca qui per scaricare questo File.

Figura supplementare 2: (A-C) Le singole celle sono state selezionate in base ai parametri di diffusione frontale e laterale. (D) Le singole celle sono state attivate tramite la colorazione dei vivi morti. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

L'isolamento delle cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo del topo è una tecnica fondamentale per comprendere le proprietà immunosoppressive e rigenerative intrinseche delle MSC in modelli animali in vivo . Sebbene il metodo sembri semplice e facile da seguire, è necessario eseguire con precisione diversi passaggi per prevenire la contaminazione batterica e garantire la resa cellulare ottimale. Ogni fase della procedura dovrebbe essere eseguita in modo asettico in un ambiente ultra-pulito.

Per evitare una bassa resa cellulare, seleziona topi nella fascia d'età 6-8 settimane. Quando si tagliano le estremità del femore e della tibia, la cavità midollica deve essere protetta il più possibile e il processo di lavaggio deve essere fermo ma delicato per garantire l'estrazione completa del midollo. Le cellule isolate devono essere incubate con una concentrazione adeguata di CO₂ e in condizioni umidificate. Durante i cambi del substrato, è essenziale lavare delicatamente le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima di sostituire il substrato, al fine di eliminare le cellule ematopoietiche contaminanti. Per evitare la contaminazione cellulare ematopoietica, al momento della ri-transizione la tripsinizzazione non dovrebbe superare i 5 minuti. Nel primo passaggio, il cambiamento del substrato non dovrebbe essere troppo rapido, poiché il cambiamento frequente del substrato può causare contaminazione batterica.

Ad ogni passaggio è necessario criopreservare le celle in più lotti per mantenere coerenza e disponibilità. Per l'innamoramento IFN-γ, dovrebbe essere condotto un esperimento dipendente dalla dose per determinare le condizioni pre-licenza più efficaci per i mezzi condizionati alla MSC. Nei nostri esperimenti, abbiamo testato una gamma di concentrazioni di IFNγ, cioè 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, per pre-licenziare gli MSC. Successivamente, 25 ng/mL è stata identificata come concentrazione ottimale.

Per preservare l'integrità dei dati, cellule di un numero di passaggio specifico dovrebbero essere utilizzate costantemente per tutti gli sami sperimentali. Per la caratterizzazione citometrica a flusso delle MSC, dovrebbero essere utilizzate cellule del passaggio 3 o superiori per garantire una rilevazione affidabile dell'espressione dei recettori superficiali. La discriminazione delle cellule vive e morte durante la colorazione della citometria a flusso è essenziale, poiché riduce la probabilità di falsi negativi.

I risultati rappresentano un meccanismo chiave attraverso il quale i BMSC somministrati esogenamente attenuano l'infiammazione intestinale durante la colite. Il priming IFN-γ potenzia l'effetto dei mezzi condizionati da MSC sulla polarizzazione dei macrofagi. CCL2 rilasciato dalle BMSC è una chemoquina critica che agisce sui macrofagi inducendo la polarizzazione M2. I nostri precedenti risultati hanno dimostrato che le chemiocine CCL2 e CXCL12 agiscono in modo collaborativo sui macrofagi per favorirne la polarizzazione. Questo evento è essenziale per la propagazione della segnalazione antinfiammatoria attraverso la successiva modulazione dei fenotipi¹³ delle cellule T e delle cellule B.

Nel nostro studio, abbiamo seguito specificamente un protocollo semplice per l'isolamento dei BMSC, basato sulla proprietà plastica aderente delle MSC. La classificazione tramite citometria a flusso o ordinamento immunomagnetico possono essere utilizzate per isolare le BMSC basandosi su marcatori superficiali specifici per MSC. Tuttavia, in entrambi questi metodi, c'è la possibilità di perdere molte cellule durante la preparazione del campione. Poiché il midollo osseo del topo contiene un numero molto basso di MSC (stimato circa lo 0,001%-0,08% delle cellule del midollo osseo), abbiamo preferito il metodo standard di isolamento basato su proprietà di aderente plastica. Tuttavia, questo metodo presenta alcuni svantaggi. Il rischio principale è la contaminazione cellulare ematopoietiche, che può ridurre la capacità terapeutica delle MSC. Pertanto, l'identificazione di un numero specifico di passaggio è cruciale, quando una popolazione significativa di cellule esprime recettori superficiali specifici per MSC.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cappa per coltura cellulare con flusso laminare verticale, dotata di luce UV e nbsp;
Forbici chirurgiche sterili
25/75 cm2 fiaschetta
Siringhe da 5/10 mL con aghi da 27G
Piatti culturali a 6 pozzi
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Biolegend	#123116
Anti-Mouse CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
Anti-Mouse CD 45.2 APC	BD PharMingen	#558702
Anti-Mouse CD163 Percp eFluor710	eBioscienza	#46-1631-80
Anti-Mouse CD206 PE	Biolegend	#141706
Anti-Mouse CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
Anti-Mouse iNOS PE-Cy7	eBioscienza	#25-5920-80
Kit ELISA CCL2	Invitrogen	#554722
Antagonista di CCR2 (RS 102895)	Sigma	#R1903
Centrifuga
DPBS	Corning	#21-031-CV
Eagle's medium modificato di Dulbecco (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Siero bovino fetale	Sigma	#F8067
Rete del filtro (70 mm)
Colorante rosso fantasma 780 di viabilità	Bioscienze tonbo	#13-0865-T100
IL-10 ELISA Kit	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutammina	Corning	#25-005-CI
Microscopio con apparecchiature a contrasto di fase
Murine IFNγ	R& Sistemi D	#485-MI-100
Penicillina-streptomicina	Corning	#30-002-CI
Anti-topo per ratti CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Pinze chirurgiche sterili (dritte e curve)
Incubatore a controllo di temperatura e composizione dei gas
Tripsina	Corning	#25052-cl
Bagno d'acqua con controllo della temperatura