Articolo metodologico

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

DOI:

10.3791/69400

⸱

28 ottobre 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli elementi cis-regolatori di base, noti come enhancer, svolgono un ruolo centrale nel consentire una precisa regolazione trascrizionale dei geni bersaglio che controllano diverse funzioni cellulari e processi di sviluppo. Questi enhancer sono spesso trascritti in entrambe le direzioni, producendo lunghi trascritti non codificanti denominati RNA enhancer (eRNA). L'espressione degli eRNA è strettamente legata alle caratteristiche attive della cromatina, come H3K27ac e il reclutamento dei co-attivatori, e contribuisce funzionalmente all'attivazione trascrizionale dei geni bersaglio. Tuttavia, l'individuazione e la quantificazione degli eRNA rimangono impegnative, soprattutto quando si sovrappongono alla trascrizione del gene ospite. Per risolvere questo problema, presentiamo un flusso di lavoro computazionale standardizzato e di facile utilizzo per l'analisi della trascrizione degli enhancer dai dati di sequenziamento dell'RNA nascente. Il protocollo guida gli utenti attraverso la pre-elaborazione dei dati, la mappatura delle letture e il controllo di qualità, seguiti dalla quantificazione specifica del filamento della trascrizione associata all'enhancer, con procedure dedicate per gli enhancer intragenici in cui l'assegnazione del segnale è complessa. I moduli di visualizzazione consentono un'ispezione chiara dell'attività degli enhancer in contesti genomici e le opzioni integrate supportano l'analisi degli enhancer sia intergenici che intragenici. Progettato per i ricercatori con competenze bioinformatiche limitate, questo flusso di lavoro fornisce un quadro pratico per studi coerenti, riproducibili e scalabili sulla trascrizione degli enhancer, facilitando una più ampia applicazione della biologia degli enhancer in diversi sistemi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli enhancer sono elementi del DNA cis-regolatori che controllano la trascrizione del gene bersaglio organizzando il looping della cromatina e reclutando il meccanismo trascrizionale 1,2,3. La loro attività tessuto-specifica consente una regolazione precisa durante lo sviluppo e l'impegno del lignaggio 4,5,6,7,8. Gli enhancer attivi mostrano caratteristiche caratteristiche della cromatina come H3K4me1 (istone H3 Lisina 4 mono-metilazione) e H3K27ac (istone H3 Lysine 27 acetilation) e si trovano solitamente nelle regioni ipersensibili alla DNasi I che marcano la cromatina aperta 9,10,11,12. Queste caratteristiche consentono ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi II di accedere al DNA, avviando la trascrizione nascente nei loci enhancer 13,14,15,16.

Questo processo biologico sequenziale produce trascritti derivati da enhancer, chiamati eRNA, che sono RNA bidirezionali, non codificanti e tipicamente non poliadenilati 13,14,15,16. Gli eRNA fungono da marcatori dell'attività dell'enhancer e funzionano come effettori a pieno titolo 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Promuovono l'allungamento produttivo rilasciando il fattore di allungamento negativo (NELF) dalla RNA polimerasi II16,19 in pausa e aiutano a stabilizzare i loop enhancer-promoter 17,18,20. Supportano anche la formazione di condensati trascrizionali, potenzialmente attraverso la modifica m6A (N 6-metiladenosina) 21,22,23.

Tuttavia, la funzione della trascrizione degli enhancer intragenici, avviata da elementi regolatori all'interno dei corpi genici, rimane controversa. Alcuni studi riportano che gli eRNA degli enhancer intragenici aumentano l'espressione genicadell'ospite 25, potenzialmente promuovendo il rilascio di NELF e l'allungamento produttivo dipendente dallo stimolo26,27. Al contrario, altri lavori suggeriscono che questa trascrizione può ostacolare i geni ospiti attraverso collisioni con RNA polimerasi II o interferenze trascrizionali, portando ad attenuazione o terminazione prematura28,29. Queste osservazioni contrastanti, insieme al duplice ruolo degli eRNA come marcatori e regolatori, evidenziano la necessità di un'attenta quantificazione e dissezione funzionale. Tuttavia, misurare gli eRNA intragenici è difficile perché spesso si sovrappongono ai trascritti dell'ospite del filamento sensoriale 13,25,26,30. La sfida è amplificata quando gli enhancer risiedono in regioni con geni nidificati o trascrizioni sovrapposte su entrambi i filamenti, il che oscura i segnali specifici dell'enhancer.

Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato una pipeline bioinformatica per rilevare, quantificare e visualizzare i trascritti associati agli enhancer, con particolare attenzione alle regioni intrageniche. La pipeline integra il test per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq), il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq), il sequenziamento run-on globale (GRO-seq) e le annotazioni genomiche per ottenere una risoluzione a livello di enhancer anche in contesti genomici complessi.

La pipeline comprende quattro fasi principali: (i) preelaborazione, allineamento, chiamata di picco e generazione del segnale31; (ii) identificazione di potenziatori utilizzando le caratteristiche della cromatina; (iii) assegnazione dell'orientamento dei filamenti, in particolare all'interno dei corpi genici; e (iv) quantificazione e visualizzazione dei trascritti degli enhancer nascenti. Questo framework è particolarmente utile per i sistemi con dati di sequenziamento ad alta risoluzione, come le cellule staminali embrionali di topo analizzate in questo studio, e può essere esteso ad altri organismi quando sono disponibili set di dati adeguati. Consentendo la quantificazione specifica dell'enhancer laddove le pipeline esistenti non sono all'altezza, questo flusso di lavoro offre uno strumento pratico per il benchmarking e lo studio della trascrizione intragenica di eRNA in diversi contesti genomici.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: tutti i set di dati non elaborati utilizzati nel flusso di lavoro sono elencati nella Tabella 1. I dettagli degli strumenti bioinformatici sono forniti nella Tabella dei Materiali. Il numero di thread utilizzati in questa pipeline può essere regolato modificando la variabile THREADS definita all'inizio di ogni script. Gli utenti possono aumentare il numero per accelerare l'analisi a seconda delle risorse della CPU dell'utente.
Dopo ogni passaggio, viene generato un file di registro. Per controlli rapidi degli errori, utilizzare comandi come cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. Correggi prima del passaggio successivo." || echo "OK: nessun marcatore di ERRORE". Se viene visualizzato un ERRORE, considerare il passaggio come non riuscito e risolverlo per primo.

1. Download della pipeline di analisi completa dal repository GitHub

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Avviare l'interfaccia della riga di comando (CLI) appropriata per il sistema operativo utilizzato.
    1. Windows: configurare un ambiente Linux usando il sottosistema Windows per Linux (WSL). Seguire le istruzioni ufficiali per installare e configurare WSL prima di procedere32.
    2. macOS: continua senza ulteriori configurazioni, poiché macOS è basato su Unix. Fare riferimento alla guida ufficiale per aprire il terminale33.
    3. Utenti Linux, in particolare quelli che utilizzano Ubuntu: Aprire un terminale come descritto nelle istruzioni di riferimento34.
  2. Eseguire wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   nel terminale per scaricare la pipeline per l'identificazione dell'enhancer e la quantificazione dell'RNA dell'enhancer.
  3. Digita unzip ~/pipeline.zip -d ~/ nel terminale. Questo estrarrà tutti i file necessari nella directory home.
  4. Esegui rm ~/pipeline.zip e digita mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization per rimuovere l'archivio e rinominare la cartella estratta.
  5. Digita cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/, ed esegui chmod +x scripts/* per rendere eseguibili tutti gli script nella directory "scripts/".

2. Configurazione dell'ambiente mamba/conda per la pipeline di analisi

  1. Digita bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh per creare ed eseguire un ambiente virtuale mamba. Se richiesto durante l'esecuzione, digitare Y e premere Invio per confermare l'installazione del pacchetto. Per macOS, seguire il passaggio 2.1.1; per i sistemi con Mamba o Conda già installati, seguire il passaggio 2.1.2.
    1. MacOS: apri lo script e sostituisci il link per il download di miniconda con la versione macOS:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Quindi, segui il passaggio 2.1.
    2. Una volta che (enhancer-env) appare nel prompt, digitare bash scripts/Step2_package_installation.sh per installare i pacchetti necessari per le analisi a valle. Digitare Y e premere Invio se richiesto durante l'installazione.
    3. Dopo aver eseguito il passaggio 2.2, controllare l'output del terminale per eventuali messaggi di errore. Risolvere eventuali problemi; quindi eseguire nuovamente il passaggio 2.2.
    4. (FACOLTATIVO) Eseguire mamba list per confermare che tutti i pacchetti gestiti da mamba nella Tabella dei materiali siano installati. HOMER viene installato manualmente e non apparirà nell'elenco mamba. Verificare HOMER controllando che la directory "~/homer/" esista.

3. Scarica i set di dati ChIP-seq, ATAC-seq e GRO-seq disponibili pubblicamente da SRA (Sequence Read Archive)

  1. Eseguire cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./ per copiare gli script della shell necessari per l'elaborazione della lettura raw.
  2. Digita bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 e premi il tasto Invio per scaricare ed elaborare i dati di sequenziamento non elaborati da SRA.
    NOTA: questo script automatizza il download e la preparazione dei dati di sequenziamento pubblico per l'analisi. Crea una struttura di cartelle standardizzata sotto "MATERIAL/", organizzata per tipo di saggio e replicata (biologico: rep1/rep2; tecnico: trep1/trep2). Un elenco integrato di numeri di accesso SRA guida il recupero con prefetch (v3.2.0), la conversione in FASTQ con fasterq-dump (v3.2.0) (paired-end: --split-files) e la compressione con pigz (v2.8) per ridurre lo spazio di archiviazione. L'elaborazione segue prefetch, fasterq-dump, pigz, con output scritti nelle corrispondenti directory "00.Rawdata/".

4. Eseguire il controllo di qualità e il taglio delle letture grezze

  1. Digita bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 per eseguire il taglio di lettura e il controllo di qualità dei file FASTQ grezzi.
    NOTA: questo script elabora i file FASTQ grezzi da GRO-seq, ATAC-seq e ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) con i controlli di input corrispondenti. Esegue FastQC (v0.12.1)35 su letture non elaborate, quindi taglia gli adattatori con Trim Galore (v0.6.10)36 utilizzando parametri specifici del test. Per GRO-seq, prima rimuove le code G NextSeq e le letture molto brevi (--nextseq 20, --length 20), quindi utilizza Cutadapt (v5.1)37 per rimuovere lunghi tratti di poli-A mantenendo le letture più lunghe di 20 nucleotidi ( -a A{15}, -m 20). Per ATAC-seq, elabora librerie paired-end e si rivolge agli adattatori Tn5/Nextera (--paired, --nextera). Per H3K27ac e l'input corrispondente, gestisce le librerie ChIP-seq paired-end (--paired). Per H3K4me1 e il suo ingresso, esegue il taglio single-end standard (impostazione predefinita). FastQC viene eseguito di nuovo in caso di letture tagliate. Gli output vengono scritti nella directory "01.Clean/" di ciascun saggio e i file intermedi tagliati con l'adattatore GRO-seq vengono rimossi.

5. Prepara l'indice di riferimento del papillon2

  1. Scegli una delle due opzioni seguenti per preparare l'indice del genoma Bowtie2 (v2.5.4)38 per il genoma di riferimento mm10 (Mus musculus).
    1. Esegui bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 per utilizzare l'indice Bowtie2 pre-costruito fornito dagli sviluppatori.
    2. Correre bash Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       per scaricare manualmente la sequenza grezza del genoma mm10 e costruire l'indice.
      NOTA: Entrambi gli approcci generano un file di indice nella directory "reference_index/" e sono funzionalmente equivalenti per l'allineamento standard.

6. Allineare le letture tagliate al genoma di riferimento mm10

  1. Digitare bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 per allineare le letture di ciascun test al riferimento e generare file BAM.
    NOTA: Questo passaggio mappa le letture di ciascun test al riferimento mm10 precedentemente indicizzato. H3K27ac ChIP-seq e l'ingresso corrispondente utilizzano la mappatura paired-end per una precisione bilanciata (-1, -2) con sensibilità predefinita. H3K4me1 ChIP-seq e l'ingresso corrispondente utilizzano la mappatura single-end con le impostazioni predefinite (-U). ATAC-seq utilizza la mappatura ad alta sensibilità per ospitare frammenti variabili e lunghi derivati da Tn5 (--very-sensitive, -X 2000) con input paired-end (-1, -2). GRO-seq utilizza la mappatura ad alta sensibilità per posizionare meglio le letture brevi e tagliate (--very-sensitive) con input single-end (-U). I file SAM vengono convertiti in BAM e filtrati con la visualizzazione samtools (v1.22.1)39 , utilizzando MAPQ moderato per ChIP/input (-b, -q 10) e soglie più severe per ATAC-seq e GRO-seq (-b, -q 30); i file BAM finali vengono scritti nella directory "02.Align/" di ogni set di dati.

7. Unire le repliche tecniche dei dati ChIP-seq H3K27ac

  1. Eseguire bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 per unire le repliche tecniche di H3K27ac ChIP-seq e i corrispondenti file BAM di input.
    NOTA: questo script ordina i file BAM per le repliche tecniche con sambamba (v1.0.1)40 sort e quindi unisce H3K27ac ChIP-seq e le repliche di input corrispondenti in BAM consolidati con sambamba merge. Se il set di dati dell'utente non contiene repliche tecniche, ignorare questo passaggio e procedere con i singoli file BAM.

8. Rimuovi i duplicati e i cromosomi non essenziali

  1. Rimuovi i duplicati e ordina le letture mappate per ChIP-seq e GRO-seq.
    1. Digita bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 per rimuovere i duplicati dai set di dati ChIP-seq istonici e ordinare i BAM di output ChIP-seq e GRO-seq.
      NOTA: Questo script rimuove i duplicati PCR con il markdup sambamba (-r) e gli ordinamenti delle coordinate con l'ordinamento sammba. Per H3K27ac, l'elaborazione è destinata ai BAM da repliche tecniche unite, gestendo ChIP e input separatamente. Per H3K4me1, ogni input replicato e abbinato viene elaborato individualmente. Per GRO-seq, la rimozione dei duplicati viene ignorata e viene applicato solo l'ordinamento delle coordinate. Gli output vengono salvati nella directory "02.Align/" di ciascun set di dati.
  2. Rimuovi i duplicati e filtra le letture mappate sui cromosomi mitocondriali da ATAC-seq.
    1. Digita bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 per rimuovere i duplicati PCR, filtrare le letture mitocondriali (chrM) e ordinare i BAM ATAC-seq.
      NOTA: questo script fa riferimento alle raccomandazioni della pipeline ENCODE per l'elaborazione dei dati ATAC-seq. Inizia eseguendo l'ordinamento dei nomi con sambamba sort (-n) e correggendo le informazioni mate-pair utilizzando samtools fixmate (-m). Questo passaggio garantisce che le informazioni di accoppiamento siano assegnate correttamente prima di contrassegnare i duplicati. Successivamente, i duplicati PCR vengono rimossi utilizzando il markdup sambamba (-r). Le letture mitocondriali vengono rimosse generando una keep-list da samtools idxstats (escludendo chrM e *) e conservando solo i riferimenti elencati con la vista samtools (-b). L'ordinamento finale delle coordinate viene eseguito con l'ordinamento sammbaba. I BAM puliti vengono scritti nella directory "02.Align/" di ogni replica.

9. Eseguire la chiamata di picco per ogni set di dati

  1. Eseguire lo script del passaggio 9 digitando bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 per eseguire la chiamata di picco per i dati ChIP-seq e ATAC-seq.
    NOTA: questo script esegue chiamate di picco con MACS3 (v3.0.3)41 per ATAC-seq e ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1). ATAC-seq genera picchi fornendo tutti i BAM replicati come segnale in modalità no-model con shift/extension (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac chiama picchi ampi da repliche tecniche unite con input corrispondente (-f BAMPE, --broad). H3K4me1 elabora ogni replica individualmente con il suo input abbinato in modalità broad-end single-end (-f BAM, --broad), e i picchi sovrapposti sono ottenuti con bedtools (v2.31.1)42 intersect. Gli output vengono scritti nella directory "peak_calling/" di ciascun set di dati, con picchi H3K4me1 ad alta confidenza sotto "peak_calling/overlapped_peak/".

10. Unire repliche biologiche di file BAM ChIP-seq e ATAC-seq per l'analisi del segnale a valle

  1. Eseguire bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 per unire i file BAM dalle repliche biologiche di ATAC-seq e H3K4me1 ChIP-seq.
    NOTA: questo script combina la replica dei BAM con l'unione sambamba per ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq e l'input H3K4me1 corrispondente. I BAM uniti supportano le analisi a valle (ad esempio, la generazione di segnali bigWig, la normalizzazione). I BAM di output vengono salvati nelle directory "merge/02.Align/" sotto ogni percorso di esempio.

11. Genera directory di tag e segnala i file bigWig dalle letture mappate

  1. Esegui bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 per creare directory di tag e generare file di segnale bigWig per le letture mappate di ciascun set di dati.
    NOTA: Questo script crea directory di tag HOMER con makeTagDirectory e quindi genera tracce di segnale bigWig con il comando makeUCSCfile utilizzando i pacchetti HOMER (v5.1)43 e ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 . Tutte le tracce del segnale vengono create utilizzando file di dimensioni cromosomiche da UCSC Genome Browser (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/). GRO-seq produce tracce di segnale specifiche per il filamento (-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig). ATAC-seq produce tracce non normalizzate da BAM uniti (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) produce tracce normalizzate all'input con uno pseudo-conteggio di 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). Gli output sono organizzati in "03.TagDir/" e "04.bigwig/".

12. Preparare i file per l'identificazione del potenziatore

  1. Digita bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 nel terminale per preparare i file necessari e il riferimento per l'identificazione del potenziatore.
    NOTA: Questo passaggio raccoglie tutti i file necessari per l'identificazione del potenziatore in "01.E_identification/material/", organizzati nelle cartelle "ATAC/", "Histone/" e "Annotation/". Copia i file di picco (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) nelle directory appropriate. Il file di annotazione GENCODE M23 (mm10) viene scaricato automaticamente e i file di riferimento, tra cui ENCODE blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) e il file delle dimensioni dei cromosomi (mm10.chrom.sizes) vengono copiati da un percorso predefinito.

13. Identificare i candidati promotori e i corpi genici dall'annotazione

  1. Digita cd 01.E_identification/ per accedere alla directory di lavoro, quindi esegui cp .. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ per copiare gli script di identificazione dell'enhancer.
  2. Esegui bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 per generare file BED per regioni promotrici, corpi genici e geni codificanti proteine (PCG) utilizzando l'annotazione GENCODE.
    NOTA: Questo script elabora il formato di trasferimento genico (GTF) GENCODE M23 scaricato per creare file BED per i candidati promotori, tutti i corpi genici e i corpi PCG, salvando gli output in "material/Annotation/". I promotori sono definiti come una finestra di 2 kb attorno al TSS (Transcription Start Site) di ciascun trascritto con slop bedtools (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). I corpi che codificano per i geni e le proteine sono derivati dalle voci GTF annotate come gene, con le voci che codificano le proteine ulteriormente filtrate da "gene_type = protein_coding".

14. Picchi di processo per l'identificazione del potenziatore

  1. Esegui bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 per pre-elaborare i file di picco ATAC-seq e istone ChIP-seq per l'identificazione del potenziatore.
    NOTA: questo script pre-elabora i set di picchi per la chiamata dell'enhancer. Per ATAC-seq, rimuove le regioni che si sovrappongono alle regioni della blacklist con bedtools sottrai (-A) e quindi esclude i picchi che si sovrappongono ai candidati promotori con bedtools subtract (-A); per le marcature istoniche (H3K27ac, H3K4me1), espande simmetricamente ogni picco di 1 kb su ciascun lato con la pendenza degli strumenti del letto (-b 1000 -g mm10.chrom.sizes) e quindi rimuove le sovrapposizioni dei promotori con la sottrazione degli strumenti del letto.

15. Identificare e classificare gli enhancer

  1. Esegui bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 per definire e classificare gli enhancer utilizzando i dati di picco della cromatina.
    NOTA: Questo passaggio definisce e annota gli enhancer utilizzando bedtools. Le sovrapposizioni tra i picchi ATAC-seq e i picchi H3K4me1 espansi in pendenza si ottengono con intersezione (-wa, -u), e le regioni che si sovrappongono anche ai picchi H3K27ac fiancheggiati sono classificate come potenziatori attivi con intersezione (-wa, -u); Gli enhancer non attivi sono derivati rimuovendo le regioni attive dall'intero set di enhancer con Subtract. I vertici ATAC-seq che si sovrappongono a ciascun set di enhancer vengono raccolti con intersezione (-u), quindi i vertici vengono divisi in intergenici e intragenici con intersezione (-v o -u) contro il corpo genico. Gli intervalli di potenziamento sono infine assegnati alle classi intergeniche/intrageniche in base al vertice associato al picco con l'intersezione (-u). Tutti i risultati vengono salvati in "01.E_identification/" sotto "01.allE/", "02.interE/" e "03.intraE/".

16. Assegnare informazioni temporanee sul filamento agli enhancer intragenici

  1. Digita bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 per assegnare informazioni temporanee sul filamento al potenziatore intragenico BED.
    NOTA: Questa fase assegna le marcature dei filamenti genici agli enhancer intragenici sovrapponendo gli intervalli degli enhancer con i corpi genici utilizzando l'intersezione degli strumenti di base (-wa, -wb). Le colonne 1, 2, 3, 4, 5, 16 vengono conservate con awk, quindi i record vengono ordinati e deduplicati. L'output viene salvato come "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed".

17. Dare priorità all'assegnazione dei filamenti per gli enhancer che si sovrappongono ai geni di entrambi i filamenti

  1. Digitare bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 per risolvere la direzione del filamento per i geni che si sovrappongono agli enhancer intragenici su entrambi i filamenti.
    NOTA: Questo script risolve l'ambiguità del filamento per i geni che si sovrappongono agli enhancer intragenici su entrambi i filamenti, dando priorità alle sovrapposizioni di PCG. Gli enhancer presenti su entrambi i filamenti vengono prima isolati (raggruppamento awk per chrom/start/end/id/strand), i casi sovrapposti a PCG sullo stesso filamento vengono selezionati con l'intersezione dei bedtools (-s, -wa, -u) e i casi non PCG vengono mantenuti con l'intersezione dei bedtools (-v). I set selezionati e conservati vengono concatenati e ordinati. Uscita: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. Calcolare i valori RPKM (Reads Per Kilobase per Million Mapped Reads) specifici del filamento per i geni che si sovrappongono agli enhancer intragenici con priorità PCG

  1. Digita bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 per calcolare l'RPKM specifico del filamento per i geni che si sovrappongono agli enhancer sullo stesso filamento.
    NOTA: Questo passaggio utilizza "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" del passaggio 17, che contiene potenziatori che (i) si sovrapponevano a un PCG su un filamento e ricevevano un filamento, (ii) sovrapponevano PCG su entrambi i filamenti e rimanevano ambigui, o (iii) non avevano alcuna sovrapposizione di PCG e mantenevano entrambi i filamenti. I geni sovrapposti dello stesso filamento vengono selezionati con l'intersezione bedtools (-s, -wa, -u), convertiti in GTF tramite awk e quantificati da GRO-seq con la modalità di conteggio specifica del filamento featureCounts (v2.1.1)46 (-s 1, -t gene, -g gene_id, -O, --fraction). Le letture totali mappate sono ottenute con sambamba flagstat e l'RPKM è calcolato dalla lunghezza del gene, dai conteggi e dai totali. Le uscite vengono scritte in "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/".

19. Assegnazione finale del filamento basata sull'espressione genica (RPKM) di geni sovrapposti

  1. Digitare bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 per finalizzare l'assegnazione del filamento per gli enhancer intragenici.
    NOTA: Questo passaggio assegna i filamenti agli enhancer intragenici utilizzando il supporto dell'espressione genica del passaggio 18. Le sovrapposizioni dello stesso filamento tra gli enhancer (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) e i geni si trovano con l'intersezione dei bedtools (-s, -wa, -wb). I valori RPKM dei geni sono uniti agli intervalli dei geni tramite awk/sort/join, producendo il BED RPKM del gene. Per ogni potenziatore, viene selezionato il gene sovrapposto con l'RPKM più alto e l'enhancer eredita il filamento di quel gene. I risultati vengono salvati in "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed".

20. Assegnare le informazioni sui filamenti agli enhancer intragenici e ai summit degli enhancer

  1. Digita bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 per assegnare le informazioni sul filamento deciso a tutti gli enhancer intragenici e a ciascun vertice.
    NOTA: Questa fase finalizza l'assegnazione del filamento per gli enhancer intragenici e i vertici corrispondenti utilizzando gli strumenti da letto. Gli intervalli di filamento opposto vengono rimossi con sottrai (-S), gli enhancer designati dal filamento vengono intersecati con gli insiemi attivi e non attivi utilizzando intersect (-wa, -u) e i file di vertice vengono riannotati sovrapponendo i vertici con gli enhancer designati dal filamento tramite intersect (-wa, -wb) e get strand con awk. I risultati vengono salvati in "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" e nella relativa sottocartella "summit/".

21. Preparare i file di input per la convalida dell'enhancer, la quantificazione dell'eRNA e la visualizzazione

  1. Tipo cd .. / o cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization per passare alla radice della pipeline, quindi digitare cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ per copiare lo script per la preparazione dell'analisi a valle.
  2. Esegui bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1 per preparare tutti i file necessari per l'aggregazione dell'enhancer, l'elaborazione del segnale GRO-seq e la quantificazione dell'eRNA.
    NOTA: Questo passaggio prepara i file di input e la struttura delle directory per la convalida dell'enhancer, la quantificazione dell'eRNA e la visualizzazione del segnale in "02.E_visualization_quantification/". Vengono create sottocartelle per file bigWig, BED enhancer, BAM, matrici di segnale, conteggi e grafici. Gli input chiave come i BED di punta, i bigWigs, gli elenchi di enhancer e i BAM GRO-seq vengono copiati nelle posizioni appropriate.

22. Generare grafici di aggregazione per la convalida dell'enhancer

  1. Digitare cd 02.E_visualization_quantification/ per accedere alla directory di lavoro, quindi digitare cp .. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ per copiare gli script necessari per l'analisi a valle.
  2. Esegui bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 per generare grafici di aggregazione dei segnali della cromatina attorno a ciascun tipo di vertice dell'enhancer.
    NOTA: questo passaggio visualizza l'arricchimento medio del segnale della cromatina centrato sui vertici dell'enhancer utilizzando computeMatrix e plotProfile di deepTools (v3.5.6)47. Per ogni set di enhancer definito, il punto di riferimento computeMatrix (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) calcola la densità del segnale all'interno di una finestra di 10 kb attorno ai vertici dell'enhancer utilizzando i file bigWig per ATAC-seq, H3K27ac e H3K4me1. La matrice di output viene passata a plotProfile, che genera curve di aggregazione del segnale per il confronto tra gruppi di potenziatori. I grafici di aggregazione vengono salvati nella directory "01.Profiling/04_1.aggregation/".

23. Quantificare e visualizzare l'espressione dell'RNA potenziatore

  1. Esegui bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1 per quantificare i livelli di espressione di eRNA da GRO-seq utilizzando featureCounts.
    NOTA: Questo passaggio quantifica la trascrizione dell'eRNA da regioni enhancer definite in modo specifico per il filamento utilizzando GRO-seq. Gli enhancer intergenici vengono contati con featureCounts in modalità unstranded (-s 0, -t enhancer, -g gene_id, -O, --fraction) e gli enhancer intragenici vengono quantificati in modalità antisenso (-s 2) per escludere il segnale dalla trascrizione genica sovrapposta. Le regioni BED vengono convertite in GTF con awk prima di essere conteggiate. Le letture mappate totali provengono da flagstat sambamba e i conteggi vengono normalizzati in RPKM utilizzando la lunghezza dell'enhancer, i conteggi delle letture e le letture mappate totali. Le uscite sono organizzate in "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" per "inter/" e "intra/".
  2. Eseguire Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript. R > Step24_log.txt 2>&1 per visualizzare e confrontare i livelli di espressione di eRNA tra i gruppi enhancer utilizzando R.
    NOTA: Lo script R utilizza i pacchetti ggplot2 (v3.5.2)48 e cowplot (v1.2.0)49 per generare grafici a violino e a scatola confrontando l'espressione del potenziatore attivo e non attivo in base ai valori RPKM. Per la visualizzazione e i test statistici, i valori RPKM vengono trasformati in log2 (RPKM + 1). La significatività statistica viene valutata utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Sia i grafici di riepilogo che la tabella dei valori p vengono salvati in "03.eRNA_visualization/" per l'interpretazione a valle.
    NOTA: se un passaggio in questa pipeline ha esito negativo e persiste anche dopo la riesecuzione, segnalare il problema in https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to visualizzazione/problemi. Indicare chiaramente il passaggio non riuscito e allegare il file di registro garantisce un supporto accurato per la risoluzione dei problemi.

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Risultati

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Flusso di lavoro schematico per la pipeline di quantificazione della trascrizione dell'enhancer
I set di dati ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq e GRO-seq (Tabella 1) disponibili al pubblico sono stati elaborati con una pipeline standardizzata progettata principalmente per la convalida. Il trimming dell'adattatore e il filtraggio di qualità sono stati eseguiti con Trim Galore e Cutadapt, seguiti dall'allineamento al genoma di riferimento mm10 utiliz...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A seguito della scoperta dei trascritti derivati da enhancer 13,14,15, quantificare accuratamente gli eRNA è rimasta una sfida importante, in particolare in contesti intragenici in cui gli eRNA spesso si sovrappongono ai trascritti del gene ospite. Questa sovrapposizione complica l'assegnazione del filamento e l'attribuzione del segnale, rendendo difficile distinguere la trascrizione dell'enhanc...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal fondo di ricerca della Chungnam National University [2022-0582-01 (S.-K.K.) e 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Corea del Sud. La Figura 1 è stata creata utilizzando BioRender (https://biorender.com/).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Utensili da lettoQuinlan Lab, Università dello Utah & nbsp;v2.31.1Utility per la modifica dei file BED
papillon 2Langmead Lab, Università Johns Hopkinsv2.5.4Allineatore multithread per la mappatura delle letture su un genoma di riferimento
CowplotWilke Lab, Università del Texasv1.2.0Strumenti per combinare e allineare figure basate su ggplot2
cutadaptLaboratorio Science For Life, Università di Stoccolmav5.1Adattatore e tagliacoda in poli-A/G
DeeptoolsStruttura di Bioinformatica, Istituto Max Planckv3.5.6Strumento di conteggio delle letture per quantificare le letture in regioni genomiche definite
fastqcBabraham Bioinformatica, Istituto Babrahamv0.12.1Controllo qualità per le letture di sequenziamento
FeatureCounts (sottolettura)Shi Lab, Università Monashv2.1.1Strumenti grezzi di conteggio delle letture per specifiche regioni genomiche
omeroBenner Lab, Università della California San Diego (UCSD)v5.1Toolkit per l'analisi di ChIP-seq, ATAC-seq e RNA nascente; include la creazione di directory di tag e la profilazione del segnale
Macs3Iniziativa Chan Zuckerbergv3.0.3Chiamata di picco per i dataset ChIP-seq e ATAC-seq
Pigz.v2.8Strumento di compressione multithread per generare file compressi in gzip
SammbaUniversità Statale di Petersburgv1.0.1Toolkit di elaborazione file SAM/BAM multithread
samtoolsWellcome Trust Sanger Institutev1.22.1Strumenti per elaborare e manipolare file SAM/BAM
SRA-ToolsCentro Nazionale per l'Informazione Biotecnologica (NCBI)v3.2.0Per scaricare file SRR dal database NCBI SRA
tidyversePosit PBCv2.0.0Raccolta di pacchetti R per la manipolazione e visualizzazione dei dati
Trim-a volonteAltos Labs, Cambridge Institute of Sciencev0.6.10Adattatore e rifinitura della base di bassa qualità usando multi-threading
Ubuntu 20.04Sviluppo e test della pipeline
ucsc-bedgraphtobigwig Kent Lab, Università della California Santa Cruzev482Strumenti per generare tracce di segnale bigWig

Riferimenti

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