1. Preparazione di campioni di pelle sintetica
Un modello di pelle sintetica a base di collagene (VITRO-Skin) è stato tagliato in campioni rettangolari di 5,0 cm × 2,5 cm in condizioni asettiche in un armadietto di biosicurezza. Ogni campione veniva inserito in una piastra di Petri sterile e conservato a 4 °C fino all'uso. Prima dell'inoculazione, i campioni venivano bilanciati a temperatura ambiente e idratati in una camera di umidità secondo le istruzioni del produttore per imitare il livello di idratazione della pelle umana.
2. Preparazione di colture microbiche
Ceppi di riferimento American Type Culture Collection (ATCC), inclusi Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e Candida albicans (ATCC 10231), sono stati utilizzati. Le singole colonie sono state inoculate in 5 mL di Brodo di Soia Triptico (TSB) in condizioni asettiche. Le colture batteriche sono state incubate a 35 °C per 24 ore, mentre le colture fungine sono state incubate a 22 °C per 5 giorni. Dopo l'incubazione, la torbidità è stata regolata a 0,5 McFarland Standard (circa 1,5 × 10⁸ CFU/mL) utilizzando soluzione salina fosfatata sterile (PBS) per saghi antimicrobici.
3. Inoculazione di modelli cutanei sintetici
Ogni sezione cutanea sintetica idratata è stata inoculata con 100 μL di sospensione microbica e distribuita uniformemente utilizzando uno sparpagatore sterile usa e getta. Le superfici inoculate sono state essiccate all'aria per 15 minuti in una camera sterile in condizioni di laboratorio ambientale (22-24 °C, 60%-70% di umidità relativa). I campioni sono stati assegnati a tre gruppi: controllo non trattato (Gruppo A), sorgente luminosa (LED luminoso blu, 405 nm), irradiazione (Gruppo B) e irradiazione LED UV-C (265 nm) (Gruppo C). La Figura 1 mostra la rappresentazione schematica degli esperimenti nella valutazione dell'efficacia antimicrobica della sorgente luminosa utilizzando il modello cutaneo sintetico.
4. Configurazione della sorgente luminosa e irradiazione
Un dispositivo LED a luce blu da 405 nm era montato su un dissipatore di calore in alluminio per prevenire l'accumulo di calore e garantire l'irradiazione termicamente sicura di campioni di pelle sintetica (Figura 2). L'irradianza veniva misurata esattamente sul piano di trattamento utilizzando un misuratore di potenza ottica calibrato, con l'altezza della sonda regolata per tenere conto dello spessore del sensore. L'irradianza di lavoro fu standardizzata a 30 mW/cm² regolando la distanza di svolto del LED.
L'uniformità dell'illuminazione nel campo di trattamento è stata verificata mettendo l'irradianza in 16 punti equidistanti, ottenendo una media di 30,14 ± 0,78 mW/cm² (Figura 3). Per il confronto di base degli effetti germicidi, sono stati eseguiti trattamenti UV-C utilizzando una sorgente LED da 265 nm che eroga 3 mW/cm² a una distanza di 20 cm per 2 minuti.
La fluenza è stata calcolata come irradianza × tempo di esposizione e corrispondeva a 27 J/cm² per la luce blu (30 mW/cm² × 900 s) e 3,6 J/cm² per UV-C.
Per i saggi antimicrobici, campioni di pelle sintetica idratata inoculati con sospensioni microbiche venivano posti asepticamente in piastre di Petri sterili (coperchi rimossi) e posizionati direttamente sotto il LED a luce blu. I campioni assegnati al gruppo di irradiazione (Gruppo B) sono stati esposti continuamente fino al raggiungimento della fluenza bersaglio (15 min). La durata di esposizione di 15 minuti (27 J/cm²) è stata selezionata sulla base di esperimenti preliminari di time-kill, che hanno dimostrato un'efficacia antimicrobica costante tra le specie, rappresentando al contempo una durata pratica di esposizione per potenziali applicazioni cliniche o al punto di cura. La temperatura di ogni campione veniva monitorata ogni 5 minuti utilizzando un termometro a infrarossi senza contatto per confermare che non si verificasse un riscaldamento significativo durante l'illuminazione. Il monitoraggio della temperatura non ha rilevato un aumento misurabile della temperatura superficiale (>2 °C) durante l'irradiazione con luce blu, confermando che gli effetti antimicrobici osservati erano non termici.
5. Efficacia antimicrobica della luce blu, LED e UV-C contro patogeni delle ferite
Dopo il trattamento, ogni campione di pelle sintetica è stato trasferito in un tubo sterile da 15 mL contenente 9,0 mL PBS (pH 7,4). I tubi sono stati vortizzati delicatamente per 1 minuto per spostare i microbi che aderiscono alla superficie. Sono state preparate diluizioni seriali di dieci volte e 100 μL di aliquote sono state impiattate su agar di soia triptico (TSA) per batteri e agar di destrosio Sabouraud (SDA) per i funghi. Sono state incubate le placche (batteri a 35 °C per 24 ore; funghi a 22 °C per 5 giorni) e sono state enumerate le unità formative di colonie (CFU). La riduzione microbica è stata quantificata utilizzando le seguenti equazioni:
Riduzione logaritmica = log10(A) - log10(B)
Riduzione percentuale = ((A - B)/A) × 100
Dove A = conteggio di CFU dal controllo; B = Conteggio di CFU da campioni trattati.
I controlli negativi consistevano in piastre solo a substrato e PBS per verificare la sterilità, mentre campioni inoculati non trattati sono stati utilizzati per confrontare l'efficacia del trattamento. Le placche di controllo positive consistevano in sospensioni microbiche ATCC inoculate per confermare la vitalità della coltura. Tutti i passaggi sperimentali sono stati eseguiti in condizioni asettiche.
6. Efficacia antimicrobica dipendente dal tempo dell'irradiazione alla luce blu
Per valutare l'effetto dipendente dalla fluenza, le durate di esposizione alla luce blu sono state impostate a 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min e 30 min. L'attività antimicrobica è stata valutata tramite l'enumerazione delle CFU come sopra, permettendo l'analisi delle relazioni dipendenti dalla dose.
7. Efficacia LED con luce blu in una camera aerosolizzata che simula condizioni nosocomiali
Una camera aerosol acrilica personalizzata, in condizioni ambientali controllate, è stata utilizzata per simulare l'esposizione aerea nosocomiale (Figura 4). Sono state introdotte sospensioni microbiche aerosolizzate (~1,5 x 106 CFU/mL) utilizzando un nebulizzatore, e campioni di pelle sintetica sono stati esposti per 30 minuti. La luce blu veniva diretta verso gli swatch durante tutta l'esposizione (10 μW/cm², distanza di 20 cm). Nell'esperimento di controllo sono state applicate condizioni di esposizione identiche, ma il dispositivo BL-LED è rimasto spento. Le densità cellulari microbiche all'interno della camera aerosol sono state monitorate utilizzando misurazioni dell'attività di ricaduta, in cui le piastre di agar sono state posizionate all'interno della camera prima dell'esposizione. Le cellule microbiche vitali aderite ai campioni cutanei sintetici (2 cm x 2 cm) sono state quantificate utilizzando l'analisi standard del conteggio delle placche come descritto sopra. Questa bassa irradianza (10 μW/cm²) è stata selezionata per imitare condizioni reali di illuminazione ambientale in contesti sanitari, dove un'irradiazione continua ad alta intensità non è fattibile.
8. Trasmissione ottica e test su colonie embedded-
- Trasmissione ottica attraverso substrato cutaneo sintetico
Per quantificare la penetrazione della luce blu attraverso la pelle sintetica, l'irradianza è stata misurata utilizzando un misuratore di potenza ottica calibrato posizionato sul piano di trattamento. L'intensità BL (405 nm, 30 mW/cm²) è stata registrata con e senza campioni di pelle sintetica idratata posti orizzontalmente tra il LED e il rivelatore. La trasmissione (%) è stata calcolata come il rapporto tra irradianza trasmessa (con pelle) e irradianza incidente (senza pelle).
La trasmissione in condizioni acquose è stata valutata utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Una striscia di pelle sintetica idratata veniva inserita verticalmente in una cuvetta standard in polistirene riempita con acqua deionizzata. La cuvetta piena d'acqua da sola fungeva da vuoto. È stata registrata un'assorbanza a 405 nm e la percentuale di trasmissione è stata calcolata usando %T = 10(-A) × 100.
- Validazione funzionale tramite il saggio a colonia embedded-colony
Sono stati eseguiti saggi di riduzione microbica in superficie e in colonia immersa come correlato funzionale della trasmissione, dove i campioni venivano inoculati su una superficie ma irradiati dal lato opposto (inferiore) per simulare la presenza di microbi sotto la superficie cutanea. Le CFU sono state quantificate come descritto sopra nella sezione sull'efficacia antimicrobica.
9. Spettroscopia FT-IR per la degradazione della pelle sintetica dopo esposizione alla luce blu e ai raggi UV-C
Per valutare potenziali cambiamenti chimici e strutturali nella matrice cutanea sintetica a base di collagene dovuti all'esposizione alla luce, è stata eseguita una spettroscopia a Trasformata di Fourier (FT-IR). I campioni di pelle sintetica (2 cm × 2 cm) sono stati idratati secondo le istruzioni del produttore, identicamente ai campioni utilizzati negli saggi di riduzione microbica. I campioni idratati sono stati esposti a luce blu di 405 nm (30 mW/cm²) o UV-C a 265 nm (3 mW/cm²) per 15 minuti (esposizione standard, 27 J/cm²) o 60 minuti (condizioni di stress peggiore). Dopo l'irradiazione, i campioni sono stati delicatamente tamponati per rimuovere l'umidità superficiale e immediatamente analizzati tramite FT-IR.
10. Misurazione ATR-FTIR
Gli spettri venivano acquisiti utilizzando uno spettrofotometro IR dotato di un software di analisi compatibile. Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando il modulo Attenuated Total Reflectance (ATR) iD7. Per isolare i cambiamenti spettrali attribuibili all'irradiazione, (1) è stato effettuato un confronto spettrale diretto tra controlli non trattati e campioni irradiati. (2) I confronti sottratti alla base sono stati effettuati utilizzando il campione di controllo non trattato come riferimento di sfondo prima di scansionare i campioni irradiati, permettendo la visualizzazione solo dei picchi nuovi o alterati.
Questo approccio duale riduce il rumore topografico e migliora la rilevazione di cambiamenti sottili nelle regioni amide e delle impronte digitali. Il livello di idratazione, lo spessore del campione e l'orientamento sono stati standardizzati su tutti i campioni per ridurre la variabilità spettrale. Ogni condizione di esposizione (controllo, BL-15 min, BL-60 min, UV-15 min, UV-60 min) è stata scansionata in triplice.
11. Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando triplicati biologici indipendenti, salvo diversa indicazione. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD) oppure come media con intervalli di confidenza (IC) del 95%, come indicato nelle legende delle figure. La normalità della distribuzione dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Confronti a coppie tra due gruppi (ad esempio, luce blu vs. UV-C, colonie superficiali vs. inglobate) sono stati effettuati utilizzando test t di Student a due code non accoppiate. Per confronti che coinvolgono più di due condizioni o punti temporali, è stata applicata un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita da test post-hoc appropriati. Il test statistico specifico utilizzato per ogni confronto è indicato nella corrispondente legenda della figura. Un p-value <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.