Method Article

Una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche da sperma equino criopreservato come donatori nucleari per la clonazione

DOI:

10.3791/69404

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta una semplice tecnica di microaspirazione per isolare cellule somatiche (SC) vitali dal seme equino criopriservato. A differenza degli approcci tradizionali, questa tecnica evita lunghe colture in vitro e supera la contaminazione da spermatozoi, consentendo un uso immediato nella clonazione delle cellule somatiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sperma è un fluido complesso che, oltre agli spermatozoi, contiene altre popolazioni cellulari, tra cui cellule immunitarie, cellule germinali maschili immature, cellule epiteliali e fibroblasti. Queste cellule condividono la condizione diploide, rendendole candidate adatte come donatrici nucleari per il clonaggio di trasferimento nucleare delle cellule somatiche (SCNT). La generazione di embrioni e discendenti vitali è stata dimostrata utilizzando queste cellule. Metodi efficaci per isolarli dal seme includono centrifugazione e tecniche di gradiente osmotico; tuttavia, sono necessari periodi di coltura in vitro prolungati per stabilire colture primarie da queste cellule isolate. Inoltre, i campioni prelevati contenevano un alto carico di spermatozoi, che interferiscono con l'insediamento e il mantenimento delle colture in vitro . Ad oggi, le colture primarie sono state stabilite con successo solo da campioni di sperma fresco, mentre i tentativi di utilizzo dello sperma criopriservato sono costantemente falliti. Questa limitazione limita significativamente la possibilità di generare cloni da campioni di sperma criopreservato. Il presente studio propone una semplice metodologia basata sulla microaspirazione per isolare le cellule somatiche dal seme equino criopriservato. Questo approccio consente il rapido prelievo di un numero sufficiente di cellule per un uso immediato nelle procedure di clonazione SCNT.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La clonazione di trasferimento nucleare a cellule somatiche è uno strumento inestimabile per il salvataggio e la moltiplicazione di individui di interesse zootecnico e scientifico. Numerose linee cellulari sono state utilizzate come donatrici nucleari, incluse cellule derivate da pelle, muscoli, granulosi, linfociti e celluleurinarie 1,2,3,4. Curiosamente, lo sperma è emerso come una nuova alternativa per la raccolta di cellule somatiche (SC) da utilizzare come donatori nucleari per laclonazione di 5,6. Questo risultato è particolarmente importante per il salvataggio di individui per i quali è stato conservato solo lo sperma. Tuttavia, la creazione di colture primarie da SC isolati da sperma congelato non è stata efficace e, ad oggi, rimane il principale ostacolo per ottenere animali clonati da questafonte 7,8,9. Queste cellule probabilmente hanno origine da epiteli ghiandolari e dal rivestimento dei tubuli, da secrezioni seminali e, cosa importante, da contaminazione seminale con urina, quest'ultima una fonte ben nota di cellule somatiche con alto potenziale proliferativoe indifferenziato 3.

Sono stati implementati vari metodi per isolare le SC dal seme, tra cui centrifugazione5, gradienti osmotici 7,8,10 e citometriadi flusso 11. Tuttavia, le cellule somatiche, una volta isolate da questi metodi, richiedono ancora condizioni ottimizzate per l'attacco, la crescita e laproliferazione 8. Le esigenze specifiche di queste cellule rendono la coltura in vitro più complessia, poiché sono necessari periodi di incubazione prolungati per l'istituzione delle colture cellulariprimarie 9. Inoltre, l'elevata concentrazione di spermatozoi presente nei campioni interferisce sia con l'inizio che con il mantenimento di questecolture 5.

A differenza degli approcci descritti in precedenza, questa tecnica di microaspirazione offre diversi vantaggi evidenti. Permette la selezione degli SC in base a dimensione e morfologia12 e consente il recupero dei nuclei sia da cellule vitali che non vitali, una strategia dimostrata con successo con tessuti congelati senza crioprotettori13 e cellule riproduttive liofilizzate 14,15,16. È importante sottolineare che le SC possono essere utilizzate immediatamente dopo lo scongelamento del seme, riducendo così il rischio di errori di ploidia tipicamente associati alla prolungata coltura in vitro delle cellule somatiche primarie utilizzate per il clonaggio animale17,18. In particolare, la tecnica si concentra sulla criopreservazione dello sperma equino, permettendo la raccolta di un numero sufficiente di SC da utilizzare immediatamente perSCNT 12.

La fabbricazione di micropipette e lo sviluppo di tecniche di microaspirazione sono progrediti significativamente negli ultimi decenni. L'uso di questi strumenti consente una manipolazione precisa di gameti, embrioni e delle loro citostrutture, creando nuove possibilità nel campo della biotecnologia riproduttiva (https://www.jove.com). Le tecniche di micromanipolazione permettono la valutazione delle proprietà meccaniche cellulari e forniscono preziose informazioni sulla loro condizionefisiologica 19,20, tuttavia questo campo è ancora relativamente inesplorato.

Ad oggi, nessuna ricerca ha descritto una tecnica efficace per isolare le SC dal seme utilizzando alcuna variante delle procedure di micromanipolazione. Date le limitazioni dei metodi convenzionali di isolamento, questo studio propone un protocollo pratico basato sulla microaspirazione per isolare le SC dal seme equino criopriservato, consentendone l'uso immediato nelle procedure di clonazione somatica dopo la raccolta.

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Protocol

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Campioni di sperma criopriservati, conservati per oltre 19 anni in azoto liquido, sono stati prelevati da distributori commerciali autorizzati dalle autorità veterinarie competenti in Messico, in conformità con lo Standard Ufficiale Messicano NOM-027-ZOO-1995, che regola il processo zoosanitario dello sperma degli animali domestici. Tutti i campioni di seme, sia utilizzati che non adatti all'analisi, sono stati inattivati e smaltiti secondo i protocolli di biosicurezza istituzionali e le normative applicabili, inclusa la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 per la gestione dei rifiuti biologico-infettivi in Messico. L'acido fluoridrico residuo (HF) veniva neutralizzato in sicurezza sotto una cappa a pompa trasferendolo lentamente in un contenitore di plastica e aggiungendo gradualmente piccole porzioni di CaCO3 o Ca(OH)2 fino a cessare l'effervescenza, formandoCaF 2 insolubile. Il pH della sospensione neutralizzata è stato confermato tra 6 e 8 prima che venisse gestita come rifiuto chimico inorganico secondo le normative locali. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Fabbricazione di ago in micropipette per isolamento delle cellule somatiche

  1. Seleziona capillari in vetro borosilicato (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm).
  2. Usa un estrattore per micropipette per produrre capillari con punte fine. Regola il punto di taglio per variare il diametro della punta.
  3. Inserisci il capillare nel tiratore e bloccalo saldamente.
  4. Rimuovi con cura la micropipetta dopo averla estratta e posizionala orizzontalmente sulla microforgia.
  5. Allinea il riscaldatore e la micropipetta all'interno del campo visivo del microscopio.
  6. Individua il punto di taglio usando il mirino oculare (Figura 1A,B).
  7. Metti la punta della micropipetta a contatto con la sfera di vetro (sul filamento del riscaldatore).
  8. Aumenta gradualmente il calore finché la punta non si scioglie nella perla.
    1. Spegni il riscaldamento.
    2. Lascia che la punta aderisca alla perla e separa.
      NOTA: Non è necessario piegare la micropipetta; può essere usato nella sua forma dritta. Tuttavia, se preferito dall'operatore, può essere formato un angolo (Figura 1C).
  9. Non lisciare la punta, poiché questo passaggio non è necessario per la procedura.
  10. Pulisci le punte della pipetta immergendo ogni punta per ~10 secondi in sequenza in:
    1. 20% di acido fluoridrico (HF).
      ATTENZIONE: L'acido fluoridrico è altamente tossico e corrosivo. Usa l'equipaggiamento di protezione individuale indicato dal fornitore. Enfatizzare l'uso di protezione per occhi/viso, guanti e camice da laboratorio, e lavorare sempre con una cappa antifumi.
    2. Acqua sterile doppiamente distillata.
    3. Etanolo assoluto.
      NOTA: Per facilitare il lavaggio delle punte della pipetta, preparare le soluzioni sopra menzionate in tubi Corning sterili da 15 mL.
  11. Asciugare le micropipette in forno a 50 °C.
  12. Conserva le micropipette in un contenitore sterile.

2. Configurazione della microaspirazione

  1. Controlla che il sistema di microaspirazione sia in condizioni di funzionamento corretto, con il joystick di microaspirazione centrato sul pannello di controllo.
  2. Per i sistemi che utilizzano olio, assicurarsi che non ci siano bolle d'aria all'interno, poiché queste potrebbero influire sulla precisione del movimento.
  3. Inserire la micropipetta di aspirazione della cellula somatica nel manipolatore di tenimento sul lato dominante della mano dell'operatore.
    NOTA: Sostituire la micropipetta con una nuova se la punta si intasa durante la raccolta delle cellule somatiche.

3. Scongelamento e diluizione dello sperma equino criopreservato

  1. Rimuovi le cannucce dall'azoto liquido, esponi all'aria per 10 secondi e scongela a 37 °C per 30 secondi.
  2. Prima diluizione del seme: Prelevare un campione dal seme scongelato (250 μL) e diluire con 1,0 mL di mezzo DMEM/F12 integrato con siero fetale al 10%, 0,1 mg/mL albumina sirica bovina, 12,5 μM β-mercaptoetanolo e antibiotico-antimicotico all'1%.
    1. Incuba la miscela a 37 °C per 30 minuti.
  3. Seconda diluizione dello sperma: Prendere 25 μL dalla prima diluizione, diluirli in 975 μL di 1x DPBS integrato con 0,1 mg/mL di poli(alcol vinilico) (PVA) o polivinilpiroldone (PVP), depositarlo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e mescolarlo delicatamente.
    1. Mantieni questa miscela a 37 °C durante tutto il processo di raccolta delle cellule.

4. Preparazione dei piatti per la raccolta dei SC

  1. Raccogliere gli SC utilizzando due coperchi da vasi di coltura di 35 mm di diametro.
  2. Prepara il primo coperchio come segue (coperchio #1, Figura 2A).
    1. Prendere 100 μL della seconda diluizione del seme e depositarla al centro del coperchio (vedi Figura 2A).
    2. Realizzare una seconda microgoccia (10 μL) di 1x DPBS integrata con 0,1 mg/mL di PVA o PVP sopra la prima goccia (vedi Figura 2A).
    3. Copri completamente entrambe le microgocce con olio di paraffina per prevenire l'evaporazione e mantenere la stabilità della temperatura durante l'aspirazione del CS.
  3. Preparare il secondo coperchio per rimuovere i detriti cellulari e gli spermatozoi associati (coperchio #2, Figura 2B).
    1. Posizionare tre gocce da 30-50 μL di 1x DPBS integrate con 0,1 mg/mL di PVA o PVP al centro del coperchio; Non coprirle con olio minerale.
      NOTA: Prepara questa ciotola di coltura solo dopo che tutte le cellule somatiche sono state selezionate per prevenire cambiamenti nelle proprietà fisicochimiche della soluzione DPBS dovute all'esposizione all'aria.
  4. Esegui tutti i passaggi di microaspirazione sotto microscopio rovesciato a temperatura ambiente. Evita i cambiamenti improvvisi di temperatura.

5. Procedura di microaspirazione per isolare le SC dal seme equino criopreservato

  1. Posizionare il primo coperchio (coperchio #1, Figura 2A) sul palco del microscopio, pronto per la raccolta degli SC.
  2. Seleziona una micropipetta con il diametro corretto per raccogliere gli SC e collegarla al sistema meccanico di aspirazione.
  3. Inserisci con cura la micropipetta nel microdrop e allineala con il fondo del coperchio della piatola. Una volta che la pipetta ha aspirato il mezzo di coltura, si inizia la cattura individuale degli SC.
  4. Nella parte inferiore del piatto dovrebbero essere visibili varie morfologie cellulari (Figura 3).
  5. Posiziona la punta della micropipetta adiacente a ciascun punto di rilievo e aspirale sotto pressione negativa. Aspira le cellule tutte intondate ed allungate indipendentemente dalle loro dimensioni. Il volume di aspirazione varia tra le catture di SC.
  6. Dopo aver catturato 10 cellule, depositale nel microdrop situato sopra (10μL) (Figura 2A). Ripeti questo passaggio fino a raggiungere il numero richiesto di SC per l'esperimento di clonazione.
  7. Trattieni tutte le cellule somatiche catturate all'interno di questo microdrop durante tutto il processo di raccolta.
  8. Una volta ottenuto il numero richiesto di SC per la clonazione, eseguire una semplice procedura di lavaggio utilizzando microgocce per rimuovere spermatozoi, detriti cellulari e contaminanti microbici.
  9. Prendi il secondo coperchio piatto ed esegui un lavaggio sequenziale in tre passaggi degli SC (coperchio #2, Figura 2B):
    1. Cattura le cellule somatiche con una micropipetta e depositale con cura sulla superficie della prima goccia. Lasciali rilassarsi per 3-5 minuti (Figura 2B; Drop #1).
    2. Ripeti il passo 5.9.1 e depositali nella seconda goccia (Figura 2B; Drop #2).
    3. Ripeti il passo 5.9.1 e deposita le cellule somatiche nella terza goccia (Figura 2B; Drop #3).
  10. Come passo finale, depositare le cellule somatiche isolate in una microgoccia finale preparata per un uso successivo nelle procedure di trasferimento nucleare delle cellule somatiche (Figura 4D).
    NOTA: Aspirare le SC nel volume medio più piccolo possibile durante ogni ricattura per minimizzare spermatozoi, detriti e contaminanti microbici.

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Results

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La Tabella 1 mostra che la tecnica di microaspirazione recupera efficacemente cellule somatiche dal seme equino criopreservato, con tassi di cattura che vanno da 317,7 ± 9,60 a 424,7 ± 33,65 cellule all'ora su tre stalloni. Lo stallone #03 aveva la resa più alta, dimostrando l'efficacia del metodo anche con campioni conservati a lungo termine. I dati indicano che la tecnica isola in modo coerente ed efficace le cellule somatiche dal seme, e che i tassi medi di cattura e l...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La micromanipolazione di cellule e gameti ha reso possibile semplificare le complesse tecniche di riproduzione assistita. Esempi di questi includono il clonaggio somatico tramite Hand MadeCloning 21, schiusaassistita 22, iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)23 e microiniezione pronucleare negli zigoti24, tra gli altri.

Lo sviluppo di metodi efficaci pe...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano il Laboratorio di Gestione della Riproduzione, Dipartimento di Produzione Agricola e Animale, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X), per il loro supporto tecnico e logistico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 beta MercaptoetanoloSIGMAM7522Coltura di cellule somatiche
1x DPBSGIBCOREF-21600010Manipolazione delle cellule somatiche
Etanolo assolutoHYCELEL CRISOL 50181-1L73Per la fabbricazione di pipette
Antibiotico-antimicotico 100xINVITRO SA. Mé xicoColtura di cellule somatiche
Capillari borosilicati (1,0 mm O.D. &moltiplicata 0,78 mm I.D. e 100 mm di lunghezza)APPARATO DI HARVARD, USAEC1-30-0035Per la fabbricazione di pipette
BSASIGMAA3311Coltura di cellule somatiche
DMEM/F12 mediaGIBCOREF-12500-062Coltura di cellule somatiche
Campione di sperma criopreservato equinoI campioni di sperma criopreservati sono stati prelevati da un distributore commerciale ed erano stati conservati per più di 19 anni in azoto liquido. Tutti i campioni di sperma equino congelato sono stati prelevati da distributori commerciali autorizzati dalle autorità veterinarie competenti in Messico, in conformità con lo Standard Ufficiale Messicano NOM-027-ZOO-1995, Processo Zoosanitario dello Sperma da Animali Domestici.
Reticolo oculareStrumento per la fabbricazione delle pipetteEquipaggiamento richiesto
Siero bovino fetaleGIBCOREF-26140-079Coltura di cellule somatiche
Acido idrofluricoSIGMA-ALDRICH339261Per la fabbricazione di pipette
Microscopio ottico invertibileEclipse, TE 200NIKONMicromanipolazione delle cellule somatiche
Laboratorio  Forno a seccoStrumento per la fabbricazione delle pipetteEquipaggiamento richiesto
MicroforgiaStrumento per la fabbricazione delle pipetteEquipaggiamento richiesto
Set di micromanipolatori per microscopio rovesciatoMicromanipolazione delle celluleEquipaggiamento richiesto
Estratore a micropipetteP-97, STRUMENTO SUTTERStrumento per la fabbricazione delle pipetteUsa le seguenti impostazioni — Calore: 720; Pull: 30; Velocità: 50; Ora: 220; Pressione
Olio mineraleSIGMAM8410Manipolazione delle cellule somatiche
Nunclon  piatti di coltura cellulare, diam. & times; H 35 mm e tempi; 10 mmNUNCLONNunc 153066
PVASIGMAP8136Coltura di cellule somatiche
PVPSIGMAP5288Coltura di cellule somatiche
Soluzione blu di tripano 0,4%GIBCORIFE- 15250061Colorante cellulare

References

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