Colorazione con perossisoma nelle cellule di mammiferi utilizzando sonde specifiche per perossisomi

Sommario

Le sonde PeroxiSPY sono utilizzate per rilevare i perossisomi nelle cellule dei mammiferi. Qui dimostriamo come utilizzare le sonde per colorare i perossisomi in cellule vive e fisse.

Abstract

I perossisomi sono organelli ubiquitari con ruoli essenziali nella salute umana, e la loro disfunzione porta a una gamma di disturbi genetici. La visualizzazione dei perossisomi è fondamentale per identificare la disfunzione dei perossisomi; tuttavia, i progressi sono stati limitati dalla mancanza di sonde specifiche per i perossisome. Sviluppando PeroxiSPY, sonde specifiche per perossisomi che imitano metaboliti naturali dei perossisomi, abbiamo reso possibile la rilevazione, il tracciamento e la quantificazione in tempo reale della dinamica dei perossisomi nelle cellule vive di mammiferi. Inoltre, l'applicazione di questa tecnica alle cellule dei pazienti con disturbi perossisomici rivela fenotipi patologici. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la rilevazione dei perossisomi nelle cellule di mammiferi vivi, così come per la rilevazione dei perossisomi dopo la colorazione nelle cellule fisse. Dimostriamo come colorare i perossisomi in cellule vive utilizzando sonde specifiche per perososomi, concentrandoci sulla preparazione delle cellule, i tempi della procedura, la riproducibilità e la risoluzione dei problemi. Queste sonde permettono una rilevazione rapida, specifica e non tossica delle cellule vive dei perossisome, offrendo un metodo unico e quantitativo per valutare la funzione dei perossisomi e la sua disfunzione nei disturbi correlati ai perossisome.

Introduzione

Il perossisoma è l'organello eucariotico più abbondante, con alcune cellule che superano i mille^{perossisomi 1}. Le loro funzioni sono fondamentali per lo sviluppo dell'organismo e l'adattamento^{metabolico 1,2}, evidenziate da una serie di disturbi umani dei perossisomi, tipicamente condizioni neurodegenerative e neurometaboliche incurabili nei bambini^{piccoli 3,4}. Per quanto ne sappiamo, in passato mancavano metodi selettivi disponibili per marchettare i perossisomi in cellule e tessuti vivi. Questi strumenti sono preziosi per la ricerca e le applicazioni diagnostiche, permettendo una misurazione diretta e quantitativa di diversi aspetti della formazione e funzione dei^{perossisomi 6}. Queste sonde sono abbastanza versatili da fornire una lettura quantitativa della funzione dei perossisomi nelle cellule e, dall'altro, essere impiegate in saggi di efficacia traslazionale o come diagnostica per disturbi^{perossisomici 6}. La colorazione PeroxiSPY è una tecnica rapida, specifica e non citotossica per il rilevamento non invasivo del perossisoma a cellule vive. Qui descriviamo come colorare i perossisomi nelle linee cellulari di mammiferi utilizzando sonde perossisomiche (le sonde hanno anche dimostrato una colorazione perossisomale specifica negli embrioni di pesci zebra, ma non sono adatte alla colorazione dei perossisomi nelle cellule di Arabidopsis thaliana ⁶). La colorazione può essere ottenuta in meno di 10 minuti. La sonda può quindi essere rilevata per ore o fissata tramite un protocollo di fissazione del paraformaldeide per ulteriori immunocolorazioni.

Protocollo

1. Colorazione delle cellule vive

1. Preparazione della coltura cellulare per l'imaging di cellule vive (durata: 24 h)
   NOTA: Lo studio ha seguito i protocolli standard di coltivazione cellulare per tutti gli esperimenti. Le linee cellulari sono state mantenute in DMEM o DMEM/F12 per SH-SY5Y, integrate con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di penicillina/streptomicina, a 37 °C e 5% di_CO2. Alcuni sistemi di imaging sono sensibili alla composizione del mezzo. Se il microscopio rileva il segnale del rosso fenolico nel mezzo, usa alternative senza rosso di fenolo. Inoltre, se il microscopio non è dotato di una camera di_CO2 , sostituire il mezzo con un mezzo contenente HEPES (pH 7,4).
   1. Un giorno prima dell'esperimento, dividere le cellule in una piastra d'imaging con fondo di vetro per ottenere una confluenza del 30-70% il giorno successivo.
      NOTA: In questo protocollo venivano utilizzate piastre a 4 pozzi da 35 mm.
      1. (Critico) Non usare cellule affamate o stressate per separarsi durante l'esperimento. Assicurati che le linee cellulari abbiano regolarmente cambi di nuovo substrato (almeno ogni 2-3 giorni) e che vengano separate prima di raggiungere il 90% di confluenza. L'obiettivo è avere una linea cellulare sana per garantire una colorazione uniforme.
         NOTA: Alcune cellule, ad esempio le cellule staminali, richiederanno un rivestimento in vetro con uno strato appropriato, ad esempio Matrigel, che non interferisce con la colorazione.
2. Preparazione dell'impianto di imaging (durata: 1h)
   NOTA: L'imaging degli organelli e della dinamica degli organelli richiede un'elevata risoluzione spaziale. Per questo protocollo, è stato utilizzato un microscopio confocale dotato di un modulo fotomoltiplicatore GaAsP, una camera_CO-2 e un'unità di controllo della temperatura. L'imaging è stato effettuato utilizzando una modalità di scansione galvanometrica bidirezionale con un obiettivo CFI Plan Apo Lambda 60x oil NA 1.42, e un laser da 561 nm (50 mW) è stato utilizzato per la sonda 555. Usa un laser da 640 nm o equivalente per la sonda da 650. I perossisomi sono stati visualizzati nelle linee cellulari umane. Il tempo di incubazione con le sonde può variare a seconda delle linee cellulari. Si consiglia di ottimizzare il tempo visualizzando le celle in diversi momenti dopo la colorazione (Figura 2A).
   1. Avvia il sistema confocale. Assicurati che il_CO2 e la temperatura (37 °C) siano stabilizzati per 20 minuti prima di iniziare la colorazione e introdurre le cellule al microscopio.
      NOTA: (Critico) È essenziale verificare che le cellule rimangano sane durante tutto l'esperimento tramite ispezione visiva e che il pH e la temperatura del substrato siano mantenuti. Questo può essere ottenuto utilizzando unità di controllo per i parametri e ispezionando visivamente la colorazione del supporto, se viene utilizzato rosso fenolico. Per questo si possono usare controller di temperatura e CO₂ .
   2. Installa il software del microscopio confocale. Avvia il software e accendi il laser a 561 nm per la colorazione della sonda a 555. Regolare i parametri di acquisizione e potenza laser. Questo protocollo utilizza potenza laser dell'1%, HV (guadagno) di 100 e una risoluzione di 1024-1024 pixel con zoom 3 per visualizzare le celle.
3. Colorazione con perossisoma (Durata: 1-5 min)
   1. Pipetta un'aliquota della sonda per una concentrazione finale di lavoro di 1 μM, ad esempio per 0,5 mL di mezzo, pipetta 0,5 μL della sonda.
   2. Seleziona il pozzo da tingere e etichettalo all'esterno con una penna pennarello.
   3. Dal pozzo scelto, si effettua una pipetta per rimuovere tutto (0,5 mL) del mezzo e dispensarlo in un tubo microcentrifuga contenente l'aliquota della sonda dal passo 1.3.1.
      NOTA: In questo passaggio è fondamentale rimuovere tutti i materiali dal pozzo per garantire una macchia uniforme.
   4. Pipetta su e giù 3 volte per mescolare il materiale e la sonda. Aspira la miscela totale nella pipetta.
      NOTA: Si può usare la miscelazione tramite vortice invece della pipetta.
   5. Dispensa la miscela nel pozzo scelto goccia dopo goccia, assicurandoti che la pipetta sia a contatto con la parete del pozzo. Dopo aver rimesso la miscela nel pozzo, avvia un timer di 10 minuti.
   6. Chiudi il coperchio, aggiungi una goccia di olio a immersione sull'obiettivo (questo protocollo usa l'obiettivo del 60× olio e posiziona la piastra sul microscopio per l'immagini.
      NOTA: Si raccomanda di ottimizzare la concentrazione della sonda per ciascuna linea cellulare per garantire una colorazione uniforme. Si consiglia di testare a 0,25, 0,5, 1 e 2 μM per 5-20 minuti; concentrazioni più basse tipicamente colorano con un fondo più basso (Figura 2A). A seconda della linea cellulare e della sensibilità del rilevatore al microscopio, le cellule colorate possono essere fotografate da appena 5 minuti dopo l'aggiunta della sonda fino a 24 ore dopo l'aggiunta. In alcuni casi, ad esempio, nell'imaging delle cellule staminali, la visualizzazione delle cellule può essere effettuata per oltre 180 minuti dopo l'aggiunta della sonda senza alcun cambiamento del segnale. In qualsiasi momento, il supporto può essere modificato per cancellare la sonda. Questo porterà a una perdita graduale della colorazione in circa 30 minuti per HEK293T cellule.
4. Imaging confocale dei perossisomi in cellule vive (durata: 10 min-3 h)
   1. Una volta posizionata la lastra sul microscopio, regola la messa a fuoco sulle cellule nel pozzo colorato e inizia l'imaging (imaging making).
   2. Una volta che le celle sono a fuoco, regola il guadagno (HV o sensibilità del rilevatore) e le impostazioni di potenza laser seguendo le linee guida standard per la configurazione del microscopio confocale.
   3. Trova e posiziona (zoom-in) sul gruppo di celle. Dopo aver messo a fuoco le celle, regolare i parametri di acquisizione alla qualità dell'immagine richiesta.
      1. Imposta i parametri di imaging per l'acquisizione dell'immagine: 0,5-1% di potenza laser, 100 HV (guadagno) nel software NIS-Elements. Controlla che l'immagine non sia sovrasatura (se lo è, modifica intensità e guadagno).
      2. Seleziona la dimensione della scansione. Acquisire immagini 1024 1024 px, velocità di scansione (1/2-1/4), media di linea (2), zoom (3) appropriato per l'imaging in corso.
         NOTA: I perossisomi si muovono durante l'acquisizione dell'immagine, il che può causare artefatti. I parametri raccomandati sono ottimizzati per minimizzare le tracce di movimento garantendo al contempo una qualità sufficiente delle immagini per la quantificazione. Quando crei un time-lapse, assicurati che intervallo, durata e loop siano specificati prima di avviare il video. Le sonde sono fotografiche.
   4. Acquisire e salvare tutte le immagini con etichette accessibili (qui si utilizza il formato software Nikon .nd2 NIS-Elements).

2. Colorazione delle celle fisse

1. Preparazione della coltura cellulare per l'imaging di cellule vive (durata: 24 h)
   NOTA: Sono stati seguiti i protocolli standard di coltivazione cellulare per tutti gli esperimenti. Le cellule Huh7 sono state mantenute in DMEM/F12 integrate con FBS al 10%, 1% di penicillina/streptomicina, a 37 °C e 5% di_CO2.
   1. Un giorno prima dell'esperimento, dividere le cellule in una piastra con coperture per ottenere una confluenza del 30-70% il giorno successivo.
      NOTA: Seminare 50.000 celle/pozzo in piastre da 12 pozzi con colibri da 18 mm, oppure 15.000 celle/pozzo in piastre da 24 pozzi con spallini da 13 mm.
2. Colorazione con perossisoma (Durata: 1-5 min)
   1. Diluire la sonda con nuovo substrato fino a una concentrazione finale di lavoro di 4 μM in un tubo vuoto di microcentrifuga fotosensibile, ad esempio, per 0,5 mL di mezzo, pipette 2 μL della sonda (soluzione standard: 1 mM).
   2. Seleziona il pozzo da tingere e etichettalo all'esterno con una penna pennarella.
   3. Dal pozzo scelto, aspirare tutto (0,5 mL) del mezzo e sostituirlo con il mezzo sonda del passaggio 2.2.1. Dispensa il mezzo sonda nel pozzo scelto, goccia dopo goccia, assicurandoti che la pipetta sia a contatto con la parete del pozzo.
   4. Dopo aver reinserito la miscela nel pozzo, incubare le cellule a 37 °C per 10-15 minuti.
      NOTA: Da questo momento, le celle sono fotosensibili e dovrebbero essere coperte con carta stagnola.
3. Fissazione post-colorazione e perossisomi per imaging nelle cellule fissate
   1. Dopo la colorazione, rimuovere con cura il substrato e lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   2. Applica una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS a temperatura ambiente per 20 minuti.
   3. Rimuovi con attenzione il PFA in un contenitore specificamente designato per i rifiuti. Lava le cellule una volta con PBS.
      ATTENZIONE: La PFA è tossica e deve essere smaltita secondo le normative istituzionali.
   4. Per procedere con l'immunofluorescenza, segui i passaggi seguenti
      1. Aggiungi lo 0,5% di Triton-X (diluito in PBS) per permeabilizzare le cellule. Lascia per 2,5 minuti.
      2. Rimuovi con attenzione il Triton-X. Lava le cellule due volte, per 10 minuti con PBS.
      3. Bloccare con soluzione al 5% di albumina sirica bovina (BSA) in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
      4. Procedi con la procedura standard di immunofluorescenza.

Risultati

Le sonde PeroxiSPY sono progettate per imitare substrati naturali di perossisomi - acidi grassi ramificati e a catena molto^{lunga 5}. Pertanto, la colorazione porterà a un'importazione dipendente dall'adenosina trifosfato (ATP) Binding Cassette Subfamily D (ABCD) dal citoplasma nei perossisomi ^5,6,7. A seconda dello stato metabolico cellulare, il trasporto ABCD dipendente da ATP può importare in modo efficiente e rapido le sonde, il che porterà a un alto rapporto di fluorescenza tra perossisoma e citoplasma (Figura 1A). Passi critici per garantire un alto rapporto includono evitare la carenza delle cellule sostituendo regolarmente il materiale cellulare e evitando la crescita delle cellule ad alta confluenza.

Per verificare la specificità della colorazione con perossomi, si raccomanda di includere diversi controlli (Figura 1B, C). Analisi di co-localizzazione con un marcatore perossisomale di riferimento, ad esempio il marcatore di importazione proteica - GFP-SKL (Figura 1B,C). Inoltre, se sono disponibili linee cellulari carenti di perossisome, ad esempio PEX19 KO, la colorazione sarà assente in quelle cellule (Figura 1B)^5,8.

Le sonde perossisomiche possono essere utilizzate per misurare la densità dei perossisomi (Figura 1C)^5,9, e sono in fase di sviluppo per valutare l'importazione del substrato, la dinamica dei perossisomi e le interazioni. Per l'imaging quantitativo, è importante standardizzare la procedura di colorazione, il momento dell'acquisizione dell'immagine (ad esempio, 10-20 minuti dopo la colorazione), la preparazione della linea cellulare e i parametri di acquisizione. Alcune linee cellulari richiedono ottimizzazione della concentrazione della sonda così come del tempismo per migliorare l'intensità del segnale dei perossisomi rispetto al fondo citosolico, ad esempio, 250 nM e 20 min funzionano meglio per le cellule COS-7 (Figura 2A). Le cellule metabolizzano le sonde, il che porta a una graduale riduzione della colorazione dei perossisomi nel tempo; tuttavia il rapporto tra perossisoma e citoplasma può migliorare in 24 ore (Figura 2B). Inoltre, abbiamo sviluppato una procedura di fissazione che permette la co-colorazione con anticorpi e la visualizzazione dei perossisomi in un momento successivo (Figura 2C,D).

Figura 1: Imaging a cellule vive dei perossisome. (A) Schema della colorazione. (B) Microscopia confocale di cellule WT e PEX19 KO HEK293T che sovraesprimono GFP-SKL e colorate con la sonda perossisoma rossa (1 μM per 10 minuti). Barre di bilancia - 1 μm e 10 μm. Viene mostrato il profilo rappresentativo di intensità. (C) Microscopia confocale di fibroblasti umani sovraspressivi di GFP-SKL e colorati con PeroxiSPY (1 μM per 10 minuti). Barre di bilancia - 1 μm e 10 μm. Viene mostrato il profilo rappresentativo di intensità. (D) Microscopia confocale di cellule SW13 (Corteccia Surrenale), SH-SY5Y (Neuroblasti), CCL-136 (Miociti), HaCat (cheratinociti), U2OS (Osteoblasti) e HEK293T (Rene embrionale umano) colorate con la sonda perossisoma rossa (1 μM per 10 minuti). Barre di scala - 2 μm e 10 μm. La quantificazione è stata condotta utilizzando Fiji come descritto^{in precedenza 9} e mostra il numero di perossisomi per micron quadrato, media ± SEM, N = 100 cellule aggregate da 3 ripetizioni biologiche, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Test di Kruskal-Wallis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ottimizzazione per immagini perossisomi e colorazione delle cellule fissate. (A) Microscopia confocale di cellule COS-7 (rene della scimmia verde africana) colorate con la sonda del perossisoma rosso secondo il protocollo (1 μM per 10 minuti; prima dell'ottimizzazione) e in condizioni ottimizzate (250 nM per 20 minuti; dopo l'ottimizzazione). Barra della scala - 10 μm. L'intensità media dei pixel dei perossisomi e del citosol è stata quantificata usando Fiji ed espressa come rapporto. N = 7 celle (prima dell'ottimizzazione) e 21 celle (dopo l'ottimizzazione). Media ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, test di Shapiro-Wilks. (B) Microscopia confocale di HEK293T cellule colorate con la sonda perossisoma rossa (1 μM) per 15 minuti e 24 ore. La quantificazione mostra l'intensità di fluorescenza dei perossisomi e del citoplasma, nonché il rapporto tra perossisoma e citoplasma, media ± SEM, N = 680 perossisomi aggregati da 3 ripetizioni biologiche, **** - p < 0,0001, test di Shapiro-Wilks. (C) Microscopia confocale di cellule Huh7 colorate con sonde perossisomi utilizzando il protocollo di fissazione. I perossisomi sono stati co-colorati con anticorpo primario anti-PEX14 (1:100 nella soluzione bloccante, incubazione di 1 ora alla RT) e anticorpo secondario (1:1000 in soluzione bloccante, anti-Rabbit Alexa Fluor 488 per capra, incubazione di 1 ora a RT). Vengono mostrate immagini rappresentative dei confocali. Barre di scala - 10 μm. (D) La quantificazione mostra i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza del perossisoma durante la fissazione e la permeabilizzazione effettuati su HEK293T cellule secondo il protocollo, media ± SEM, N = 100 cellule aggregate da tre ripetizioni biologiche, **** - p < 0,0001, test di Shapiro-Wilks. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questa semplice rilevazione del perossisoma può essere effettuata in meno di 10 minuti nelle cellule animali. La colorazione PeroxiSPY consente la visualizzazione, quantificazione e tracciamento dei perossisomi nelle cellule vive ed è disponibile come sonda rossa (Tabella dei Materiali) e sonda^{rosso profondo 5} (Tabella dei Materiali). La colorazione fornisce una visualizzazione perossisomica simile a una colorazione classica basata su segnale di targeting perossisomico (PTS1)^{l 10} (Figura 1B) senza necessità di sovraespressione. I fluorofori sono fotostabili e possono essere utilizzati per immagini a superrisoluzione e acquisizione a lungo termine della dinamica dei perossisomi in diverse condizioni^{sperimentali 5,9,11}. Inoltre, le sonde sono sensibili al funzionamento dei perossisome; pertanto possono essere utilizzati per rilevare e quantificare la patologia dei^{perossisomi 5} per applicazioni di ricerca e diagnostica. La colorazione con i perossisomi dipende dal metabolismo dei perossisomi e dalla capacità dei perossisomi di importare e ossidare gli acidi grassi. È quindi importante ottimizzare la concentrazione e il tempismo per le linee cellulari utilizzate. Qui presentiamo una procedura standard che funziona per le linee cellulari che abbiamo testato; tuttavia, il tempismo della colorazione può essere esteso a 24 ore senza la perdita del rapporto di intensità di fluorescenza perossisoma rispetto al citoplasma (Figura 2B).

Le sonde sono state testate su molte linee cellulari di mammiferi (Figura 1 e Figura 2) e su cellule e embrioni 5 di pesce zebra Danio rerio^{, mostrando} specificità ai perossisomi e facilità d'uso. Queste sonde non sono state testate in altre linee cellulari animali e le condizioni, così come le concentrazioni delle sonde, dovranno essere ottimizzate per esse. Le sonde non colorano i perossisomi nelle cellule di Arabidopsis thaliana ⁵.

Alcuni problemi e le rispettive soluzioni per la risoluzione dei problemi sono trattati qui. Se il rapporto perossisoma/citoplasma è troppo basso (colorazione con perossisoma bassa), assicurati che le cellule siano appena divise e poi dividille di nuovo per la colorazione. Usa una confluenza del 30-70% per la colorazione. Ottimizzare la concentrazione della sonda (una concentrazione troppo alta porterà a superare la capacità di perossisoma di assorbire le sonde) e il tempismo (ad esempio, vedi Figura 2A). Usa una piastra da 35 mm con fondo di vetro (la colorazione in piastre a 96 pozzi è più difficile a causa della miscelazione a basso volume). Assicurarsi che le sonde siano aggiunte al tubo della microcentrifuga e mescolate accuratamente con il mezzo prima di essere aggiunte alle celle. Linee cellulari diverse e condizioni variabili influenzano la colorazione. Infine, lavare la sonda riduce lo sfondo; tuttavia, il segnale andrà gradualmente perso, riducendo il tempo in cui può essere effettuata efficacemente l'imaging.

Se non ci sono perossisomi visibili, assicurati che la sonda sia stata mescolata con il substrato. Aumentare la concentrazione della sonda (ad esempio, a 2 μM). Introdurre un ulteriore marcatore perossisomale per garantire che i perossisomi possano essere visualizzati. Se c'è variazione da cellula a cellula nella colorazione, è importante rimuovere tutto il materiale e mescolarlo accuratamente con l'aliquota prima di riportarlo alle cellule. Questo garantisce una macchia uniforme. Se c'è ancora variazione, è possibile che la popolazione cellulare sia eterogenea nella capacità di importazione di substrati perossisomici. La sincronizzazione delle celle tramite la divisione regolare aiuta a una colorazione uniforme. Se non viene rilevato alcun segnale, verifica che le impostazioni laser dei microscopi siano compatibili con i parametri di eccitazione/emissione della sonda. Se lo sfondo esterno alla cella è troppo luminoso, si lava le sonde per rimuovere questo sfondo; tuttavia, il segnale andrà gradualmente perso, riducendo la finestra temporale in cui può essere condotta efficacemente l'imaging. Inoltre, la fissazione può essere usata per ridurre lo sfondo. Se il segnale post-fissazione è molto debole, controlla se il segnale si perde dopo l'aggiunta di Triton-X 100. Questo passaggio può essere modificato o rimosso a seconda dell'applicazione a valle. Riduci i passaggi di lavaggio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-PEX14	Proteintech	10594-1-AP
Microscopio Confocale	Nikon	A1r	Qualsiasi microscopio confocale con un obiettivo NA-alto (NA) 60x
DMEM	Pan Biotech	P04-03590	Mezzi di coltura cellulare
Lastre di imaging con fondo di vetro	Cellvis	D35C4-20-1.5-N
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488	ABCAM	ab150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216
PeroxiSPY555	Spirocromo	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650	Spirocromo	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2