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Articolo metodologico

Modellizzazione dei macrofagi associati al tumore in vitro: il ruolo dei fattori secreti nella dinamica dei microambienti tumorali

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DOI:

10.3791/69406

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30 dicembre 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto presenta un protocollo in vitro per generare cellule simili a macrofagi associate al tumore esponendo monociti umani a mezzi condizionati provenienti da linee cellulari tumorali.

Abstract

I macrofagi mostrano una plasticità notevole, permettendo loro di acquisire stati funzionali distinti in risposta a una varietà di segnali ambientali. Nei tumori solidi, costituiscono frequentemente la popolazione di cellule immunitarie più abbondante all'interno del microambiente tumorale, dove sono chiamati macrofagi associati al tumore (TAM). I TAM interagiscono strettamente con le cellule maligne, promuovendo attivamente la progressione tumorale, l'angiogenesi e l'evasione immunitaria. Le cellule tumorali possono riprogrammare i macrofagi attraverso il contatto diretto cellula-cellula e una vasta gamma di fattori secreti, modellando la loro polarizzazione verso fenotipi pro-tumorali. Per studiare questi meccanismi di polarizzazione TAM in vitro, proponiamo un metodo che espone i monociti umani a fattori solubili presenti nei mezzi condizionati da linee cellulari tumorali. Questo protocollo consente la generazione di macrofagi simili al TAM in condizioni controllate, facilitando l'analisi dei cambiamenti fenotipici e funzionali indotti da segnali derivati dal tumore. Il nostro approccio offre un modello riproducibile e fisiologicamente rilevante per indagare le interazioni tumore-macrofagi, approfondisce la nostra comprensione della riprogrammazione dei macrofagi e supporta la ricerca su nuove strategie terapeutiche nell'immunologia oncologica e nell'immunoterapia.

Introduzione

I macrofagi sono cellule immunitarie innate multifunzionali la cui straordinaria plasticità permette loro di adottare fenotipi diversi in risposta a segnaliambientali 1. All'interno dei tumori solidi, i macrofagi spesso diventano la popolazione immunitaria più abbondante e si differenziano in macrofagi associati al tumore (TAMs)2. Queste cellule sono attivamente riprogrammate dal microambiente tumorale per sostenere la crescita tumorale, promuovere l'angiogenesi, facilitare la metastasi e sopprimere risposte immunitarie antitumorali efficaci. Le cellule tumorali guidano questa polarizzazione sia attraverso interazioni cellulari dirette sia attraverso un complesso repertorio di fattori secreti, tra cui citochine, chemimochine e fattori di crescita, che rimodellano i programmi trascrizionali e funzionali deimacrofagi 3. Questa interazione dinamica sostiene il ruolo centrale delle TAM nella biologia del cancro e mette in evidenza la plasticità dei macrofagi sia come sfida sia come opportunità per un interventoterapeutico 2.

La rilevanza clinica dei TAM è sempre più riconosciuta: la loro abbondanza nei tumori spesso è correlata a una prognosi scadente e resistenza alleterapie 4,5. Di conseguenza, iTAM 6 sono emersi come bersagli terapeutici attraenti. Strategie volte a bloccare il reclutamento, inibire la loro sopravvivenza o riprogrammarli verso fenotipi infiammatori e tumoricidi sono attualmente oggettodi indagine 6. Comprendere i meccanismi attraverso cui i fattori derivati dal tumore polarizzano i macrofagi in TAM è quindi essenziale per sviluppare immunoterapie efficaci. Sebbene il blocco dei checkpoint immunitari abbia mostrato grande successo in molti tumori, la sua efficacia rimane limitata in altri7. Combinare terapie mirate alle cellule T, come anticorpi anti-Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) o anti-Programmed Cell Death Ligand 1 (PDL-1), con strategie di riprogrammazione dei macrofagi, può potenziare la risposta immunitaria antitumorale complessiva.

I modelli sperimentali tradizionali per studiare la biologia TAM hanno incluso modelli in vivo di cancro murino, che offrono un ambiente complesso e fisiologicamenterilevante 8. Questi modelli hanno fornito intuizioni fondamentali sul reclutamento e la funzione dei TAM. Tuttavia, differenze significative tra specie nella segnalazione immunitaria, nella biologia tumorale e nell'ontogenesi dei macrofagi possono limitare la traduzione diretta alla malattiaumana 9,10. Inoltre, la complessità dei sistemi in vivo rende difficile isolare e studiare vie di segnalazione specifiche o eventi molecolari che guidano la polarizzazione dei macrofagi.

Al contrario, i modelli in vitro offrono condizioni più semplici e controllate per analizzare questi meccanismi. L'approccio più diffuso consiste nel polarizzare macrofagi umani derivati da monociti con stimoli definiti: interferone gamma (IFN) e lipopolisaccaridi batterici (LPS) per generare macrofagi pro-infiammatori (M1), o interleucina 4 (IL-4) e interleucina 10 (IL-10), o desametasone per ottenere vari sottotipi di macrofagi antinfiammatori (M2) 11,12,13,14 . Questi modelli hanno aiutato a identificare marcatori molecolari e programmi di trascrizione associati agli stati canonici di polarizzazione dei macrofagi. Tuttavia, non riescono a replicare l'ambiente complesso e multifattoriale che i macrofagi incontrano nei tumori, dove la polarizzazione deriva dall'influenza simultanea di numerosi mediatori solubili, segnali metabolici e interazioni cellula acellula 15,16. Sebbene la classificazione classica M1/M2 rimanga utile per descrivere gli stati funzionali dei macrofagi, ora è chiaro che esistono molte più popolazioni di macrofagi di quanto si pensasse in precedenza. Il lavoro del gruppo del dottor Ginhoux e di altri, utilizzando approcci trascritomici a singola cellula, ha dimostrato l'ampia diversità di sottogruppi di macrofagi riscontrati sia in condizioni fisiologiche sia nellamalattia 17,18. Questo evidenzia che i TAM, sebbene spesso descritti come simili a profili simili a quelli M2, non sono strettamente equivalenti ai macrofagi differenziati esclusivamente con citochine canoniche; piuttosto, condividono certe caratteristiche ma mostrano anche differenze distinte e dipendenti dal contesto.

Per colmare questo divario, presentiamo un protocollo in vitro che modella la polarizzazione simile al TAM esponendo macrofagi derivati da monociti umani a mezzi condizionati raccolti da linee cellulari tumorali. Questo metodo cattura l'influenza del secretoma tumorale, una ricca miscela di citochine, chemichine e fattori di crescita secreti dalle cellule tumorali. Offre quindi un sistema rilevante e sperimentalmente accessibile per indagare la riprogrammazione fenotipica e trascrizionale dei macrofagi in risposta a fattori solubili derivati dal tumore. A differenza degli approcci precedenti in cui i monociti erano direttamente esposti a mezzi condizionati dal tumore, questo protocollo si concentra specificamente sulla riprogrammazione dei macrofagi, riflettendo così meglio il comportamento dei macrofagi residenti nel microambientetumorale 19,20. Inoltre, incorpora un pannello ottimizzato e semplice di marcatori superficiali per valutare la polarizzazione dei macrofagi tramite citometria a flusso, facile da implementare e espandibile in base alle esigenze delricercatore 14,21. Infine, poiché è stato dimostrato che M-CSF prepara i monociti verso un fenotiposimile a M2 10,15,22,23,24, lo abbiamo deliberatamente omesso per assicurarci che qualsiasi polarizzazione osservata dei macrofagi derivi specificamente dall'esposizione a mezzi condizionati derivati da linee cellulari tumorali.

Questo approccio presenta diversi punti di forza: mantiene la riproducibilità e la semplicità dei sistemi in vitro, utilizza cellule umane primarie per una maggiore rilevanza traslazionale e riflette meglio la natura eterogenea e multifattoriale del microambiente tumorale rispetto ai modelli a singolacitochina 25,26,27,28. Inoltre, facilita studi comparativi sulle risposte dei macrofagi a medi condizionati provenienti da diversi tipi tumorali o cellule tumorali geneticamente modificate, e funge da piattaforma per testare agenti farmacologici che possono alterare la polarizzazione TAM. Oltre alla sua applicabilità generale, questo metodo può essere adattato a diversi modelli tumorali selezionando linee cellulari appropriate o aggiustando la proporzione di mezzi condizionati. Tuttavia, gli utenti dovrebbero essere consapevoli che la variabilità tra donatori sani e linee cellulari tumorali può influire sulla riproducibilità, sottolineando l'importanza di un disegno sperimentale attento e di una standardizzazione.

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Protocollo

Sono stati prelevati campioni di sangue periferico da donatori sani dopo consenso informato, in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Università di Buenos Aires. Consulta la Tabella dei Materiali per dettagli su tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

NOTA: Mantenere condizioni sterili per tutto il protocollo, lavorando in un cabinet di biosicurezza livello 2 (BSL-2), e garantire la vitalità cellulare >90%. Per lo smaltimento, tutti i rifiuti biologici devono prima essere decontaminati lasciandoli in ammollo in una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per almeno 30 minuti, e poi inseriti nel contenitore appropriato per lo smaltimento dei rischi biologici.

1. Coltura di linee cellulari tumorali e preparazione di mezzi condizionati

  1. Scongelare la linea cellulare MDA-MB-231 triplo negativo per il cancro al seno umano (o altri tumori selezionati) dall'accumulo di azoto liquido. Immergi immediatamente i criotubi contenenti linee cellulari in un bagno d'acqua a 37 °C e fai ruotare delicatamente la fiala per garantire uno scongelamento rapido e uniforme. Rimuovi la fiala immediatamente quando è quasi scongelata.
  2. Trasferire le celle scongelate in un tubo di centrifugazione da 15 mL contenente 5 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Centrifuga la sospensione a celle a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Il processo di scongelamento deve essere eseguito rapidamente per preservare la vitalità cellulare.
  3. Scartare con cura il soprantantante e risospendere rapidamente la pellet cellulare in 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) fresco e completo, contenente alto contenuto di glucosio (4,5 g/L) con siero fetale bovino al 10% (FBS), 4 mM di glutamine e 1 mM di piruvato di sodio. Contare le cellule nel pellet risospeso, eseguendo la seguente diluizione seriale in due fasi:
    1. Prepara prima una diluizione in sospensione 1:5 cellula in un mezzo DMEM sterile e poi (1:2) con la colorazione di vitalità Trippan Blue per ottenere una diluizione finale di 1:10.
    2. Utilizzare un microscopio lucico per contare le cellule vitali all'interno dell'emocitometro di Neubauer (o camera di conteggio). Contare le cellule vitali (solo quelle che escludono il colorante blu) e determinare il numero medio di celle vitali per ogni grande quadrato d'angolo.
    3. Calcola la concentrazione finale usando la seguente formula: Celle/mL = (Media delle celle per quadrato) x (Fattore di diluizione) x 10.000.
      NOTA: Sospendere le cellule in un volume desiderato di mezzo DMEM completo per ottenere una concentrazione finale di 1x 105cellule/mL.
  4. Seminare 2,5 x 105 a 5,0 x 105 cellule in una fiaschetta di coltura T25 contenente 5 mL di mezzo DMEM completo. Mantieni la coltura a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 fino a raggiungere la densità cellulare richiesta per la prelieva.
  5. Il giorno dopo la semina, controlla l'attacco delle cellule al microscopio. Se più del 50% delle cellule galleggia (indicando la morte cellulare), aspirare delicatamente il vecchio mezzo e sostituirlo con 2,5 mL di mezzo fresco preriscaldato.
  6. Monitora la crescita cellulare quotidianamente. Quando la coltura raggiunge circa il 90% di confluenza (stimate 2,3 x 106 cellule in una fiaschetta di T25), tipicamente entro 5 giorni, le cellule sono pronte per essere subcolture (spaccate). Per suddividere le celle in un rapporto 1:8, segui questi passaggi:
    1. Rimuovi il mezzo esausto usando una pipetta Pasteur sterile.
    2. Risciacqua il monostrato cellulare una volta con 3 mL di PBS sterile 1x per rimuovere il siero residuo, che inibisce la tripsina. Aspira e scarta 1x PBS.
    3. Aggiungere alle cellule 1 mL di soluzione di acido etilenidiamina-tetraacetico (EDTA) allo 0,25% di tripsina-1 mM e incubare a 37 °C, 5% di CO2 su un incubatore umidificato per 3 minuti per staccare le cellule.
      NOTA: Il tempo ottimale di incubazione con tripsina/EDTA dipende dalla specifica linea cellulare e potrebbe dover essere modificato. Controlla le cellule al microscopio dopo 3 minuti per assicurarti che siano completamente staccate.
    4. Neutralizza l'attività enzimatica aggiungendo 3 mL di mezzo DMEM completo. Subito dopo, pipetta delicatamente su e giù per staccare completamente e sospendere le cellule.
  7. Trasferire 3,5 mL della sospensione della cella in un tubo conico da 15 mL e centrifugarlo per 5 minuti a 400 x g a RT.
  8. Rimuovere con attenzione il sovrantantante e risospendere la pellet cellulare in 1 mL di mezzo congelante (che deve contenere il 90% di FBS più il 10% di dimetilsolfosido (DMSO)). Trasferire e aliquotare la sospensione cellulare in crioviali, assicurando una concentrazione di 5 x 105 cellule per tubo per un uso futuro.
    1. Il congelamento deve essere raffreddato gradualmente inserendo i cryovials in un contenitore Mr. Frosty (o simile a tasso controllato). Trasferisci il contenitore in un congelatore a -80°C e lascia congelare le cellule tutta la notte. Le celle possono essere conservate a -80°C per alcuni giorni, ma poi devono essere spostate in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: Tieni registri dettagliati dei passaggi cellulari e usa i primi passaggi per gli esperimenti. Si consiglia l'uso di celle con meno di 20 passataggi.
  9. Quando le nuove colture raggiungono nuovamente il ~90% di confluenza, aspirare e raccogliere il soprandanante in un tubo conico da 15 mL. Se vuoi mantenere la coltura in corso, sostituisci il volume raccolto con un nuovo mezzo DMEM completo.
    1. Centrifugare il soprantantante raccolto a 400 × g per 5 minuti a 4 °C per bloccare e rimuovere i detriti cellulari. Tieni il soprantantante (il mezzo condizionato chiarito) e scarta il pellet.
  10. Aliquota il materiale condizionato chiarificato in porzioni da 1 mL, etichetta i tubetti e conservali a -20 °C fino all'uso.
    NOTA: Per il controllo qualità, tieni sempre traccia della data di raccolta del supporto condizionato e se l'aliquota è stata precedentemente scongelata. Si consiglia vivamente di evitare di scongelare la stessa aliquota più di due volte. Inoltre, utilizza il condizionato entro un mese dalla data di congelamento per garantirne l'attività ottimale.

2. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC)

NOTA: I PBMC sono isolati da 40 mL di sangue periferico anticoagulato con citrato di sodio al 3,8%. L'isolamento viene eseguito utilizzando un gradiente di densità di Ficoll-Ipacco (1077) e centrifugazione. L'intero protocollo deve essere eseguito in condizioni sterili in un cabinet BSL2.

  1. Aliquota il campione di sangue periferico anticoagulato in una provetta conica da 15 mL o 50 mL prima della prossima fase di centrifugazione.
  2. Centrifugare i campioni di sangue a bassa velocità, 200 × g per 15 minuti a RT per separare i componenti del sangue. Questo processo produce plasma ricco di piastrine (PRP) come strato superiore e la frazione cellulare (globuli rossi e bianchi) sottostante. Usa una centrifuga impostata accelerazione: 4 e decelerazione: 2, quando il massimo è 5.
  3. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprantantante (la frazione superiore), che è il PRP, e trasferirlo in un nuovo tubo sterile.
    NOTA: Se necessario per esperimenti a valle, il PRP raccolto può essere centrifugato nuovamente a 600 × g a RT per 10 minuti (massima accelerazione e decelerazione) per rimuovere le piastrine e conservare il plasma senza piastrine a -20 °C per altri saggi.
  4. La frazione cellulare inferiore ottenuta dalla centrifugazione iniziale nel secondo passo deve essere delicatamente diluita fino a un volume finale di 2-3 volte usando PBS sterile a temperatura ambiente 1x. Omogeneizzare dolcemente invertendo la sospensione risultante e usarla per la centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll-Hypaque.
  5. Dispensare 15 mL di Ficoll-Ipacco a temperatura ambiente in un tubo sterile da 50 mL.
  6. Applicare con cura e lentamente 30 mL di sangue diluito sopra il Ficoll-Ipaque, assicurandosi che le due fasi non si mescolino.
  7. Centrifugare il tubo stratificato di sangue di Fiorol per 25 minuti a 600 × g a RT. Impostare la centrifuga senza freno (accelerazione: 1; Decelerazione: 0).
  8. Utilizzare una pipetta Pasteur sterile per scartare almeno 4 mL della frazione superiore ottenuta e evitare che si rovesci. Poi si utilizza la stessa pipetta per recuperare l'anello bianco contenente i PBMC formato tra la frazione superiore e la frazione trasparente di Ficoll-Ipaque. Evita di collezionare Ficoll con l'anello PBMC.
  9. Trasferire l'anello PBMC dal tubo a un tubo centrifuga sterile da 15 mL con almeno 3 mL di PBS 1x.
  10. Riempi il tubo da 15 mL con altro PBS 1x e centrifuga a 600 × g (massima accelerazione e decelerazione) per 10 minuti a RT.
  11. Rimuovere il soprantantante per inversione, riempire di nuovo con 1x PBS e centrifugare a 600 × g (massima accelerazione e decelerazione) per 10 minuti a RT.
  12. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet PBMC in 2-3 mL di PBS sterile 1x più FBS inattivato termicamente al 2% (1x PBS-2% FBS), poi porta il volume a 10 mL. Contare le cellule, preparando una sospensione 1:5 diluita in freddo sterile 1x PBS e poi (1:2) in Trippan Blue allo 0,4% per ottenere una diluizione finale di 1:10. Usa una camera cellulare su un microscopio lucico, come descritto nel passo 1.3.2 per il conteggio.
  13. Riduci la sospensione PBMC a 300 × g per 5 minuti a 8-10 °C. Risospendere le cellule in un volume desiderato di 1x PBS-2% FBS sterile e freddo per ottenere una concentrazione finale di 108 cellule/mL. Lasciare queste celle a 4 °C fino al passo successivo.
    NOTA: A questo punto, i PBMC raccolti possono essere congelati in una fiala criogenica a 108 cellule/mL in mezzo di congelamento (90% FBS-10% DMSO). Conserva a -80 °C in un contenitore Mr. Frosty per tutta la notte per permettere alle cellule di congelarsi lentamente. Il giorno dopo, trasferisci le celle in una scatola di stoccaggio e lasciale a -80 °C per un paio di giorni, oppure trasferisci in un serbatoio di azoto liquido per un lungo periodo di conservazione, oppure continua il protocollo.

3. Ordinamento dei monociti CD14+ usando perle magnetiche

NOTA: I monociti purificati CD14+ sono ottenuti da PBMC utilizzando un kit di selezione magnetica positiva11 per CD14+ umano. La percentuale di cellule CD14+ nel PBMC è dipendente dal donatore ma può essere stimata al 10% (che varia dal 5 al 20%). Adatta il numero iniziale di PBMC e i volumi finali di reazione in base al numero richiesto di monociti per il tuo esperimento. Il volume minimo di reazione suggerito è di 100 μL, anche quando si elabora meno di 1 × 107 PBMC.

  1. Aggiungi 10 μL del cocktail positivo per ogni 100 μL di PBMC, pipetta su e giù, e lascia sul ghiaccio per 15 minuti.
  2. Vortice la sospensione dei perni per 30 secondi prima dell'uso. Poi aggiungi 10 μL delle sfere per 100 μL di sospensione PBMC. Mescola bene e incuba per 15 minuti sul ghiaccio.
  3. Aggiungi 1x PBS-2% FBS -1 mM EDTA a un volume finale di 2,5 mL, miscela delicatamente la sospensione e inserisci il tubo sul magnete e incuba per 5 minuti.
  4. Inverti il magnete (senza rimuovere il tubo) su un tubo ricevente scartato per 2-3 secondi, evitando qualsiasi movimento di scuotere. Le cellule positive rimarranno nel tubo.
  5. Togli il tubo dal magnete e aggiungi 1x PBS-2% FBS -1 mM EDTA sulle pareti del tubo fino a un volume finale di 2,5 mL.
  6. Inserisci di nuovo il tubo nella calamita e incuba per 5 minuti.
  7. Inverti il magnete (senza rimuovere il tubo) su un tubo ricevente scartato per 2-3 secondi, evitando qualsiasi movimento di scuotere. Prendi il tubo dal magnete e aggiungi 3 mL di 1x PBS-2% FBS sulle pareti del tubo per recuperare tutte le cellule.
  8. Prendere 10 μL per contare il numero di cellule CD14+ in una camera di Neubauer con un microscopio ottico. Diluire con Trypan Blue 1:2.
    NOTA: Calcola il numero di celle seguendo questa equazione: Numero di celle CD14+ = numero di cellule vive per quadrante x fattore di diluizione x 10.000.
  9. Posizionare la sospensione della cella CD14+ in un nuovo tubo sterile da 15 mL e lavare le celle centrifugando a 600 × g ( massima accelerazione e decelerazione) per 10 minuti a 4 °C.
  10. Sospendere le cellule CD14+ con mezzo RPMI 1640 integrato con un mezzo completo al 10% di FBS e 1% di penicillina-streptomicina (P/S) a un volume conveniente per ottenere 2,5 x 106 cellule/mL per il passo successivo, considerando il numero di cellule ottenute.
    NOTA: Mantenere i monociti CD14+ sul ghiaccio fino al passo successivo per evitare l'attacco di queste celle alla parete del tubo di plastica.

4. Differenziazione dei macrofagi

  1. La piastra ha purificato monociti CD14+ a 2,5 x 105 cellule sospese in 250 μL di mezzo RPMI completo (10% FBS-1% PS) per pozzo in una piastra trattata da 48 pozzi.
    NOTA: Può essere fatto anche con la metà delle celle in una piastra trattata con 96 bene.
  2. Aggiungere acqua sterile ai pozzi vuoti circostanti per ridurre l'evaporazione durante l'incubazione a placche.
  3. Incubare le cellule per 5 giorni a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore umidificato senza disturbare, monitorando quotidianamente morfologia, differenziazione e vitalità.
    NOTA: Sebbene si possa aggiungere M-CSF (25 ng/mL) per differenziazione, confermiamo che il nostro protocollo utilizza solo il 10% di FBS di alta qualità per ottenere macrofagi M0 dopo cinque giorni di coltura. Raccomandiamo specificamente di evitare il M-CSF per il suo potenziale di stimolare i monociti verso un fenotiposimile a M2 10,22.

5. Esposizione dei macrofagi a mezzi condizionati e analisi

  1. Al quinto giorno di differenziazione, rimuovere delicatamente il 50% (125 μL) del mezzo da ogni pozzetto e sostituire con quale:
    1. 125 μL di mezzo completo RPMI fresco (controllo),
    2. 125 μL di mezzo condizionato da linea cellulare tumorale (ad esempio, da MDA-MB-231), oppure
    3. 125 μL di mezzo completo DMEM (controllo per mezzi condizionati).
      NOTA: Per l'ottimizzazione iniziale con nuove linee cellulari tumorali, testare una gamma di concentrazioni di mezzi condizionati (ad esempio, 10%, 25% e 50%). Questo intervallo viene suggerito per garantire la vitalità dei macrofagi e i cambiamenti di differenziazione. Scegli la concentrazione più alta di mezzi condizionati che mostrano un'elevata vitalità dei macrofagi.
  2. Continua l'incubazione fino al giorno 7.
    NOTA: Al giorno 5 si ottengono macrofagi M0, poi altri 2 giorni di coltura in presenza di mezzi condizionati sono sufficienti per indurre l'espressione dei marcatori di polarizzazione superficiale. I marcatori della superficie di polarizzazione sono determinati dalla citometria di flusso, in modo simile, quando si utilizzano citochine standardizzate per generare macrofagi M1 oM2 11,14.
  3. Valuta quotidianamente la vitalità e la morfologia dei macrofagi al microscopio.
    NOTA: Monitorare la differenziazione dei macrofagi quotidianamente durante il periodo di coltura di 7 giorni. L'adesione cellulare viene utilizzata come indicatore di una coltura sana e vitale. Una proporzione più alta di cellule fusiformi indica un aumento della differenziazione e della polarizzazione nel gruppo di trattamento con mezzi condizionati (CM), come mostrato nella Figura 2.

6. Raccolta macrofagi per la valutazione dei marcatori di polarizzazione tramite citometria di flusso

NOTA: Opzionalmente, per estendere ulteriormente la caratterizzazione fenotipica dei macrofagi associati ai tumori, isolare l'RNA per misurare l'espressione di geni associati alla polarizzazione (ad esempio TGM2, IRF-4 e CXCL10) tramite reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) oppure raccogliere i soprannatanti in coltura per la misurazione della produzione canonica di citochine (ad esempio TNFα, IL-6 e IL-10) tramite un saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA) come riportato dal nostro gruppo11, 14.

  1. Scartare aspirando delicatamente con una pipetta Pasteur sterile o puntare il volume totale del medio di coltura di ogni pozzo e aggiungere 200 μL di tampone freddo 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA per la raccolta cellulare.
  2. Incubare per 10-15 minuti sul ghiaccio e poi aggiungere 200 μL di 1x PBS-2% FBS per diluire il buffer EDTA. Raccogli i macrofagi pipettando su e giù (ancora sul ghiaccio) per altri 5 minuti finché tutte le cellule non si staccano.
    NOTA: Questo passaggio è cruciale per ottenere un buon numero di macrofagi vitali. È importante non prolungare il tempo di esposizione a EDTA oltre il consiglio per preservare la vitalità cellulare. Controlla le cellule al microscopio dopo aver terminato la procedura per assicurarti che siano completamente staccate.
  3. Raccogli i macrofagi su un microtubo da 1,5 mL e lavali con 1 mL di 1x PBS-2% FBS tramite centrifugazione a 400 × g per 5 minuti a 8-10 °C.
  4. Risospensi il pellet dei macrofagi con 200 μL di 1x PBS-5% FBS e trasferiscili su una micropiastra a fondo arrotondato da 96 pozzi per bloccare aspecifiche a RT per 15 minuti. Centrifuga le celle a 400 x g per 5 minuti a 8-10 °C.
  5. Scartare il sovrantantante invertendo rapidamente la placca.
  6. Prepara il cocktail appropriato di anticorpi coniugati direttamente in 1x PBS-2% FBS utilizzando un fattore di diluizione 1:50 per ciascun anticorpo. Tingere ogni campione con 50 μL del cocktail di anticorpi e incubare per 30 minuti al buio su ghiaccio.
    NOTA: Cocktail di anticorpi: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), HLADR-PE (40 μg/mL) e CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). La concentrazione di anticorpi pre-tittered è elencata nella Tabella 1; i numeri di catalogo si trovano nella Tabella dei Materiali.
  7. Lavare i macrofagi colorati aggiungendo 150 μL di 1x PBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 8-10 °C.
  8. Scartare il sovrantantante invertendo rapidamente la placca.
  9. Per misurare la vitalità cellulare, aggiungi 100 μL del colorante di vitalità risolvibile Zombie Violet (1:1.000 in 1x PBS) e incuba al buio per 30 minuti sul ghiaccio.
  10. Lava le cellule colorate aggiungendo 100 μL di 1x PBS e centrifuga a 400 x g per 5 minuti a 8-10 °C. Ripeti la procedura di lavaggio usando 200 μL di 1x PBS.
  11. Risolvi risospendendo la pellet cellulare con 20 μL di paraformaldeide fresco preparato all'1% e incubandole per 20 minuti su ghiaccio e al buio.
    NOTA: per la fissazione è stato usato paraformaldeide all'1%, senza permeabilizzazione. Opzionale: Il componente fissativo commerciale (dal kit di fissazione/permeabilizzazione BD) può essere utilizzato anche per questo passaggio11.
  12. Lavare le celle aggiungendo 180 μL di 1x PBS-2% FBS e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 8-10 °C. Ripeti la procedura di lavaggio usando 200 μL di 1x PBS-2% FBS.
  13. Scartare il soprandanante tramite inversione della placca e risospendere il pellet in 200 μL di 1x PBS da portare all'apparecchiatura di citometria a flusso per la misurazione.
    NOTA: Se i campioni colorati e fissi non possono essere analizzati tramite citometria di flusso nello stesso giorno, conservarli a 4 °C e proteggerli dalla luce. Analizza i campioni il prima possibile nei giorni successivi.
  14. Analizza i risultati della citometria a flusso utilizzando il software FlowJo. La strategia di gating inizia escludendo i detriti utilizzando scattering frontale e laterale (FSC/SSC). Successivamente, seleziona macrofagi vivi come cellule viola zombie CD11b⁺.
    NOTA: Poiché l'autofluorescenza nei macrofagi dipende dal donatore, è essenziale utilizzare controlli derivati dallo stesso donatore per ogni esperimento.

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Risultati

Abbiamo generato cellule simili a macrofagi associati al tumore (TAM) triplicemente negative trattando macrofagi derivati da monociti con mezzi condizionati al 50% (CM) della linea cellulare MDA-MB-231. I monociti sono stati selezionati dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) di sei donatori sani indipendenti e differenziati seguendo il nostro protocollo. La preparazione per la MC ha utilizzato cellule MDA-MB-231 al 90% di confluenza (Figura 1...

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Discussione

Il protocollo descritto qui fornisce un approccio riproducibile e pratico per studiare la polarizzazione macrofagica associata al tumore, esponendo macrofagi derivati da monociti umani a medi condizionati da linee cellulari tumorali. Questo sistema cattura l'influenza dei fattori solubili secreti dalle cellule tumorali, note per svolgere un ruolo fondamentale nella riprogrammazione dei macrofagi all'interno del microambientetumorale 7,9,10,15,19,20.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Riconosciamo il sostegno finanziario fornito dall'Agenzia Nazionale per la Promozione della Scienza e della Tecnologia (ANPCyT-FONCYT) tramite sovvenzioni PICT 2021 I-INVI-00034 (a DR), PICT 2021-I-A-00807 (a E.A.C.S.) e PICT 2021-I-A-00716 (a A.E.E.). Ringraziamo inoltre il Consiglio Nazionale per la Ricerca Scientifica e Tecnica (CONICET) per la sovvenzione PIP 2022-0763 e l'Università di Buenos Aires per il PIDAE 2022, assegnato ad A.E.E.

M.C.L. ha ricevuto una borsa di studio Legado Peruilh dalla Facoltà di Medicina dell'Università di Buenos Aires ed è beneficiario di una borsa di dottorato ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. e A.E.E. sono ricercatori di carriera presso CONICET.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 488 topo anti-umano   CD206 clone di anticorpi 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 topo clone anti-umano CD64 10.1BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD in Biologia, San Jose, CA, USACat# 554714Kit fissativo/permeabilizzazione
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto livello di glucosioGibco & nbsp; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp;Cat# 11965092
Kit di selezione positiva EasySep Human CD14; EasySep Cocktail Selezione Positiva; Nanoparticelle magnetiche EasySep; Calamita Sep facileSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadaCat# 18058
Citometro FACS Canto Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA.
Siero fetale bovino, qualificato, Nuova Zelanda & nbsp;Gibco & trade;   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp;Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Life Sciences, USACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow space citometer Sysmex Partec, Germania
Clone anticorpale HLA-DR anti-PE L243BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 307605; RRID:AB_314683
Clone di anticorpi di topo PE/Cy7 ratto anti-topo/umano CD11b M1/70BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 101216; RRID:AB_312799
Clone anticorpale anti-umano CD163 di PerCP/Cy5.5 per topiBioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MediumGibco & nbsp; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp;Cat# 11875119
Soluzione di piruvato di sodioSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, USA. & nbsp;Cat#  S8636
Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rossoGibco & nbsp; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA & nbsp;Cat# 25200056
Kit di Vitalità Riparabile Zombie VioletBioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 423113

Riferimenti

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