Method Article

Metodo rapido con microsfere magnetiche per la purificazione efficiente dei neutrofili a bassa densità

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I neutrofili a bassa densità (LDN) aumentano significativamente in diverse malattie. Le LDN sono solitamente isolate attraverso la selezione cellulare. Presentiamo un metodo pratico per ottenere LDN puro e vitale. Dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico, le cellule vengono incubate con microsfere magnetiche e quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I neutrofili, importanti leucociti dell'immunità innata, sono stati tradizionalmente considerati una popolazione cellulare omogenea. Tuttavia, prove recenti hanno dimostrato che i neutrofili esistono in diverse sottopopolazioni. Una di queste sottopopolazioni è quella dei neutrofili a bassa densità (LDN). Le LDN si trovano in piccole quantità nel sangue di individui sani, ma il loro numero aumenta significativamente in malattie come il lupus eritematoso sistemico, le malattie autoimmuni, il cancro e le infezioni. In questi casi, l'LDN può partecipare alla patogenesi della malattia. L'unico modo per isolare l'LDN è attraverso la centrifugazione a gradiente di densità del sangue periferico. Tuttavia, dopo la centrifugazione, le LDN co-purificano con le cellule mononucleate. Pertanto, lo studio di questa sottopopolazione di neutrofili è impegnativo. Non esiste una metodologia standard per separare le LDN dalle celle mononucleate. Tipicamente, le LDN vengono separate mediante smistamento cellulare in un citometro a flusso. Tuttavia, questo metodo richiede lunghi tempi di selezione (ore) per ottenere abbastanza cellule pure per ulteriori studi funzionali. Ciò influisce seriamente sulla vitalità e sulla funzione delle cellule. Qui, proponiamo un metodo pratico per ottenere un gran numero di LDN puro e vitale in breve tempo. Dopo la centrifugazione a gradiente di densità, la frazione di cellule mononucleate viene incubata con microsfere magnetiche anti-CD66b, quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche in < 30 minuti. Le LDN purificate (cellule CD66b+ ) sono marcate con anticorpi monoclonali contro CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b e CD98 e vengono analizzate mediante citometria a flusso per conferma. Gli LDN purificati sono completamente funzionali, come indicato dalla loro capacità di produrre specie reattive dell'ossigeno e di formare trappole extracellulari neutrofile. Questo nuovo metodo di purificazione consente di ottenere LDN con elevata purezza (oltre il 90%) e vitalità (oltre il 96%) in un breve periodo di tempo. Questo metodo può essere facilmente scalato per ottenere un gran numero di LDN puri per valutare le funzioni dell'LDN in diverse malattie attraverso analisi biochimiche o altre analisi omiche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I neutrofili, i leucociti predominanti nel sangue umano1, sono partecipanti chiave del sistema immunitario innato. Arrivano in gran numero ai tessuti con infiammazione o infezione2. Lì, i neutrofili attivano diverse funzioni effettrici, come la fagocitosi 3,4, la degranulazione 5,6 e la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET)7. Inoltre, anche i neutrofili partecipano alla risposta immunitaria adattativa8. La visione classica dei neutrofili li considera come cellule omogenee prodotte nel midollo osseo con risposte predeterminate 9,10. Tuttavia, studi recenti rivelano che i neutrofili sono cellule eterogenee con molteplici stati fenotipici e funzionali sia in stato sano che in stato di malattia 11,12,13,14,15.

Tra le diverse sottopopolazioni di neutrofili, i neutrofili a bassa densità (LDN) hanno suscitato molto interesse a causa delle loro proprietà intrinseche e perché aumentano di numero in diverse malattie 16,17,18. Le LDN sono state trovate nel sangue di pazienti con lupus eritematoso sistemico (LES) nel 198619. Sono stati rilevati seguendo il processo di separazione dei leucociti in un gradiente di densità20,21. Dopo la centrifugazione del sangue o del plasma ricco di leucociti su un mezzo di densità (ad es. Ficoll-Paque), i monociti e i linfociti (noti come cellule mononucleate del sangue periferico [PBMC]) formano una banda nella parte superiore (a bassa densità) della provetta. I neutrofili sedimentano sul fondo del tubo. Tra i PBMC sono stati trovati anche alcuni neutrofili; questi sono LDN (Figura 1). Piccole quantità di LDN sono nel sangue di individui sani22. Tuttavia, il numero di LDN aumenta significativamente nelle condizioni di immunosoppressione multipla e infiammazione cronica, tra cui LES23,24, sepsi25, psoriasi26, asma27, artrite idiopatica giovanile28, vasculite associata agli anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili (ANCA)29, infezione da HIV30, malaria31 e tubercolosi32. Sebbene il numero di LDN aumenti in tutte le patologie menzionate, le LDN sono state per lo più studiate nel contesto del LES17. L'LDN proveniente dal sangue dei pazienti affetti da LES sembra avere una maggiore capacità di formare NET33, di secernere grandi quantità di mediatori proinfiammatori34 e di attivare le cellule T24. Tuttavia, in altre condizioni, come il cancro, si dice che le LDN siano costituite da neutrofili maturi e immaturi35, con proprietà soppressive delle cellule T 36,37,38. Allo stesso modo, nei pazienti COVID-19, è stato riportato che anche le LDN sopprimono la proliferazione delle cellule T39, ma contrariamente al LES, le LDN sembrano produrre meno NET39. Pertanto, l'origine, la composizione e le proprietà funzionali dell'LDN sono ancora controverse.

Poiché le LDN si trovano insieme alle PBMC, studiarle è tecnicamente complicato. Per esplorare a fondo le proprietà delle LDN in diverse patologie, è necessario purificarle. Una procedura comune di separazione LDN è la selezione cellulare fluorescente 22,40,41,42,43,44,45. Tuttavia, lo smistamento cellulare richiede molto tempo per la separazione cellulare. Ciò può portare alla perdita di cellule o a un basso recupero se il tempo di selezione non è sufficiente. Inoltre, le cellule sono sottoposte a uno stress eccessivo, causando risultati variabili durante lo studio della funzione di queste cellule. I lunghi tempi di selezione aumentano anche il costo delle procedure sperimentali e richiedono personale specializzato.

Qui, presentiamo un metodo rapido ed efficiente per ottenere un gran numero di LDN umano puro e vitale in un tempo molto breve. Dopo la centrifugazione in gradiente di densità, le LDN vengono separate mediante smistamento magnetico delle celle (MACS; Figura 1). Il vantaggio principale di questo metodo di purificazione è che le LDN vengono separate con elevata purezza (oltre il 90%) e vitalità (oltre il 96%). Inoltre, le LDN purificate sono completamente funzionali, come indicato dalla loro capacità di generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) e di rilasciare NET. Questo protocollo può essere facilmente implementato in qualsiasi laboratorio interessato alla biologia dei neutrofili per separare rapidamente l'LDN dal sangue di persone con più malattie al fine di studiare ulteriormente queste cellule.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure di questo protocollo seguono le linee guida del Comitato di Bioetica per la Ricerca Umana dell'Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e neutrofili da sangue umano

  1. Ottenere circa 10 ml di sangue da un volontario adulto sano mediante venipuntura. Aggiungere 10 U/mL di eparina come anticoagulante.
    ATTENZIONE: Smaltire l'ago in un contenitore per lo smaltimento degli aghi a rischio biologico. Le siringhe e gli altri materiali a contatto con il sangue devono essere inseriti in una sacca e sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento.
  2. In una provetta da centrifuga conica da 15 mL, aggiungere 2 mL di destrano al 6% T500 in PBS. Quindi aggiungere 10 ml di sangue drenandolo lungo il lato della provetta. Capovolgere la provetta un paio di volte per mescolare il sangue e il destrano.
  3. Lasciare riposare la provetta per 45 minuti, mentre gli eritrociti sedimentano. Il plasma ricco di leucociti appare sopra lo strato eritrocitario.
  4. In un'altra provetta da centrifuga da 15 mL, aggiungere 5 mL di terreno a gradiente di densità. Pipettare con cura il plasma, senza toccare gli eritrociti, e sovrapporlo al terreno. Devono essere formate due fasi separate.
  5. Centrifugare la provetta a 516 x g per 20 minuti a 4 °C. Le cellule mononucleate (PBMC) formano una banda tra il plasma e gli strati medi. I neutrofili formano una pallina sul fondo (Figura 1).
  6. Isolamento della PBMC
    1. Eliminare per aspirazione il plasma sopra il PBMC senza toccare le cellule. Raccogli le cellule dalla fascia tra il plasma e il mezzo. Assicurati di aspirare il meno terreno possibile.
    2. Mettere le cellule in una provetta da centrifuga conica da 50 mL. Aggiungere 20 ml di PBS. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Aspirare con cura il surnatante e raschiare il tubo per separare le cellule. Aggiungere 10 ml di PBS freddo per risospendere le cellule. Contare la PBMC utilizzando una camera di Neubauer.
      NOTA: Non utilizzare una pipetta per risospendere le cellule, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule.
  7. Isolamento dei neutrofili
    1. Rimuovere il gradiente di densità medio. Separare le cellule raschiando la provetta e aggiungere 10 mL di PBS freddo.
    2. Mettere le cellule in una provetta da centrifuga fresca da 50 ml e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e separare le cellule come descritto al punto 1.6.3.
  8. Per eliminare gli eritrociti residui, aggiungere 10 mL di soluzione ipotonica fredda (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) e mescolare delicatamente per esattamente 1 minuto.
  9. Aggiungere rapidamente 10 mL di soluzione ipertonica fredda (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4) per rendere la soluzione isotonica.
  10. Contare i neutrofili utilizzando una camera di Neubauer (purezza > 95%). Pellettare le celle mediante centrifugazione come al punto 1.6.2. e risospenderli in PBS freddo. Mantenere il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: È stato riportato che l'emivita dei neutrofili in vitro è di 8 - 12 ore 46,47,48. Nella nostra esperienza con questo protocollo, i neutrofili mantengono le loro funzioni per circa 6-8 ore.

2. Purificazione di neutrofili a bassa densità (LDN)

  1. Centrifugare PBMC a 400 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 120 μL di tampone di lavaggio a freddo (1% BSA in PBS).
  2. Aggiungere 35 μl di microsfere magnetiche CD66b. Incubare la miscela al buio a 4 °C per 30 minuti. Mescolare delicatamente ogni 10 minuti per prevenire l'aggregazione cellulare.
  3. Aggiungere 1 mL di tampone per lavaggio a freddo. Mettere le cellule in una microcentrifuga e centrifugare a 400 x g per 3 minuti.
  4. Rimuovere il surnatante, separare il pellet cellulare raschiando la provetta e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio.
  5. Posizionare una colonna di separazione magnetica su un magnete. Aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio alla colonna e lasciarlo passare attraverso la colonna.
  6. Trasferire le cellule (1 mL) sulla colonna. Lascia che il buffer passi attraverso la colonna goccia per goccia.
  7. Aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio nella colonna e lasciarlo passare. Aggiungere altri 0,5 mL di tampone di lavaggio nella colonna.
  8. Rimuovere la colonna dal magnete e metterla in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio alla colonna.
  9. Inserire lo stantuffo sulla parte superiore della colonna e applicare delicatamente una pressione per eluire le cellule. Rimuovere lo stantuffo e posizionare la colonna sopra una nuova provetta per microcentrifuga.
  10. Aggiungere un altro 1 ml di tampone di lavaggio. Inserire lo stantuffo sulla parte superiore della colonna e applicare delicatamente una pressione per eluire le cellule.
  11. Mettere entrambe le provette in una microcentrifuga e centrifugarle a 800 x g per 3 minuti. Infine, risospendere le cellule (LDN) da entrambe le provette in 1 mL di PBS freddo. Mantenere il ghiaccio.
    NOTA: I primi 2 mL di flusso continuo contengono il resto della PBMC. Queste cellule possono essere utilizzate per altri studi.

3. Citometria a flusso multicolore

  1. Risospendere le cellule purificate a 1 x 106 cellule/mL in tampone di marcatura (1% FBS in PBS). Aggiungere 250 μl di cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Aggiungere gli anticorpi corrispondenti contro le molecole di membrana dei neutrofili (per i dettagli, vedere la Tabella dei materiali). Incubare le cellule per 30 minuti a 4 °C, proteggendole dalla luce.
  3. Aggiungere 1 ml di PBS. Mettere le provette in una microcentrifuga e centrifugarle a 800 x g per 3 min.
  4. Aspirare il surnatante, rompere il pellet cellulare picchiettando la provetta e risospendere le cellule in 0,5 mL di paraformaldeide all'1%.
  5. Mantenere le cellule a 4 °C al riparo dalla luce, fino all'analisi mediante citometria a flusso. Analizza le cellule mediante citometria a flusso, acquisendo 10.000 eventi per campione. Eseguire l'ordinamento delle celle come descritto in precedenza22.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è un irritante per la pelle e le vie respiratorie. Assicurati di non respirare i vapori.

4. Rilevamento di specie reattive dell'ossigeno (ROS)

  1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 2,5 x 105 cellule. Mettere le provette in una microcentrifuga e centrifugare a 800 x g per 3 minuti.
  2. Aspirare il surnatante, raschiare la provetta per separare le cellule e risospendere le cellule in 100 μL di 15 μM di diidrorodamina 123 in PBS.
  3. Incubare le cellule al riparo dalla luce a 37 °C per 20 minuti. Aggiungere 1 ml di PBS.
  4. Mettere le provette in una microcentrifuga e centrifugare a 800 x g per 3 minuti. Aspirare il surnatante, raschiare la provetta per separare le cellule e risospenderle in 100 μL di 50 nM di forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) in PBS.
  5. Incubare le cellule al riparo dalla luce a 37 °C per 45 min. Aggiungere 1 ml di PBS.
  6. Mettere le provette in una microcentrifuga e centrifugarle a 800 x g per 3 min. Aspirare il surnatante, raschiare la provetta per separare le cellule e risospenderle in 0,5 mL di paraformaldeide all'1% in PBS.
  7. Mantenere le cellule a 4 °C al riparo dalla luce fino all'analisi mediante citometria a flusso. Analizza le cellule mediante citometria a flusso, acquisendo 10.000 eventi per campione.

5. Visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili (NET)

  1. Posizionare i vetrini coprioggetti nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti e coprirli con 10 μg/mL di poli-L-lisina. Incubare la piastra per una notte a 4 °C agitando delicatamente.
  2. Rimuovere la poli-L-lisina e lavare i vetrini coprioggetti con PBS, incubando la piastra per 5 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Lavare i vetrini coprioggetti con PBS altre due volte.
  3. Rimuovere il PBS e lasciare asciugare i vetrini posizionando la piastra all'interno di una cappa a flusso laminare per 2 h.
  4. Risospendere LDN a 1 x 106 celle/mL in terreno RPMI-1640 con FBS al 5%. Prelevare 350 μl (3,5 x 105 cellule) della sospensione cellulare e metterli in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente i vetrini.
  5. Conservare la piastra per 30 minuti in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C. Aggiungere 3,5 μL di PMA da 5 μM diluito in PBS a ciascun pozzetto (la concentrazione finale di PMA è di 50 nM).
  6. Conservare la piastra per 4 ore in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C. Aggiungere 350 μl di paraformaldeide all'8% in PBS e conservare la piastra per una notte in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C.
  7. Posizionare una pellicola trasparente su un supporto per provette come descritto in precedenza49, in modo che si formino dei pozzetti sui fori delle provette.
  8. Riempite ogni pozzetto con le varie soluzioni per lavare o macchiare i vetrini, formando una grossa goccia. Togliete i vetrini coprioggetti e metteteli a testa in giù su una goccia d'acqua per 5 min. Allo stesso modo, lavare i vetrini coprioggetti altre tre volte con acqua.
  9. Posizionare i vetrini coprioggetti capovolti su una goccia di tampone bloccante (5% BSA in PBS) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  10. Trasferire i vetrini coprioggetti in una goccia dell'anticorpo primario corrispondente (ad es. anti-elastasi o anti-citrullina) in tampone bloccante e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.
  11. Lavare i vetrini coprioggetti 2 volte in 0,01% Tween-20 in PBS. Trasferire i vetrini coprioggetti in una goccia dell'anticorpo secondario corrispondente in tampone bloccante contenente 150 nM di DAPI, e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
  12. Lavare i vetrini coprioggetti 2 volte in 0,01% Tween-20 in PBS. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio antisbiadimento su un vetrino e capovolgere i vetrini.
  13. Sigillare i vetrini coprioggetti lungo il perimetro con lo smalto. Conservare i vetrini montati a 4 °C, al riparo dalla luce. Visualizzazione dei NET utilizzando un microscopio a fluorescenza.

6. Identificazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET)

  1. Risospendere le cellule a 5 x 105 cellule/mL in Sytox Green da 500 nM, diluite in terreno RPMI-1640 con FBS al 5%.
  2. Prelevare 100 μl (5 x 104 cellule) di sospensione cellulare e metterli in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale da 96 pozzetti.
  3. Conservare la piastra per 20 minuti in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C. Aggiungere a ciascun pozzetto 20 μL di PMA da 300 nM diluito in terreno RPMI-1640 (la concentrazione finale di PMA è di 50 nM).
  4. Trasferire la piastra in un lettore di micropiastre preriscaldato. Incubare la piastra a 35 °C per 4 ore, effettuando misurazioni della fluorescenza dal fondo della piastra ogni 5 minuti (utilizzando i filtri di eccitazione a 485 nm e di emissione a 528 nm).

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Results

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I neutrofili a bassa densità (LDN) in individui sani rappresentano circa il 5% della PBMC (Figura 2A). Il protocollo qui descritto fornisce in genere LDN puro (> 90%). Le cellule vengono anche recuperate in modo efficiente (resa intorno al 98%) con un'elevata vitalità (> 95%); Figura 2B). Per confronto, le LDN sono state anche purificate mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza, come descritto in precedenza

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Discussion

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In generale, i neutrofili erano considerati come cellule omogenee. Tuttavia, recenti prove hanno dimostrato che i neutrofili potrebbero esistere come cellule con diversi stati di attivazione e/o fenotipi multipli. Pertanto, possono esistere varie sottopopolazioni di neutrofili 13,14,15. Una sottopopolazione di neutrofili, i neutrofili a bassa densità (LDN), ha acquisito grande interesse per le l...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori affermano che questo studio è stato condotto senza alcun legame commerciale o finanziario che potesse essere percepito come un potenziale conflitto di interessi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano César Díaz-Godínez (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) per il suo aiuto con la microscopia fluorescente per visualizzare i NET. Questa ricerca è stata supportata dalla sovvenzione PAPIIT IN205523 dalla Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Messico, e dalla sovvenzione CF-2023-I-610 dalla Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Messico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Anticorpo policlonale anti-citrullina del coniglioAbCamab100932Diluizione 1/50
Piastra di coltura tissutale a 96 pozziCostante; Corning, Inc.3596
Anticorpo IgG1 anti-umano CD11b di Alexa Fluor 488BioLegend3013170,25 μ g/mL
Anticorpo IgM anti-umano CD66b Alexa Fluor 647BioLegend3051090,05 μ g/mL
Anticorpo anti-IgG del topo (H+L), Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11001Diluizione 1/50
Anticorpo monoclonale IgG1 di topo anti-neutrofili elastasiSanta Cruz BiotecnologiaSC-5554910 & micro; g/mL
Anticorpo anti-coniglio IgG (H+L) per l'asino, Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-31572Diluizione 1/50
Anticorpo IgG1 anti-umano CD62L del topo APCBioLegend3048090,03 μ g/mL
Anticorpo IgG1 del topo anti-umano CD14 APC/Cyanine7BioLegend3671070,25 μ g/mL
Attune NxT flow cytometer Thermo Fisher Scientific, Inc.(laser blu/rosso)
Albumina sierica bovina (BSA) Frazione VMP Biomedici810025
Anticorpo IgG1 del topo Brilliant Violet 510 anti-umano CD33BioLegend3666090,30 μ g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextrano T500Farmacosmos A/C5.51005E+11
Diidrorodamina-123Anaspec, Inc.AS-85711
Classificatore di celle FACSBecton Dickinson Modello FACSAria
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
Anticorpo IgG1 FITC anti-umano CD98 per topiBioLegend3156030,30 μ g/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonVersione 10, 2019
Microscopio a fluorescenza invertitaOlympusModello IX-70
EparinaInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
Microbiole di chimerismo CD66b di MACSprepMiltenyi Biotec130-111-552
MagneteMiltenyi Biotec130-042-102
Colonna di separazione magneticaMiltenyi Biotec130-042-201
MicrocentrifugaEppendorfModello 5415C
Lettore di microplaccheBioTek InstrumentsSinergia dei modelli HT
ParaformaldeideSigma Aldrich158127
Anticorpo IgG1 PE anti-umano CD10 del topoBioLegend3122030,05 μ g/mL
Anticorpo IgG2a PE anti-umano CD16b topoBD Pharmingen550868Diluizione 1/40
Anticorpo IgG1 di topo anti-umano PE/Cyanine5BioLegend3230130,25 μ g/mL
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma AldrichP8139
poli-L-lisinaSigma AldrichP2658
Centrifuga refrigerataEppendorfModello 5702R
Mezzo di coltura tissutale RPMI-1640Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Preadolescente-20 e nbsp;Sigma AldrichP2287
VectashieldLaboratori VectorH-1000

References

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