Metodo rapido con microsfere magnetiche per la purificazione efficiente dei neutrofili a bassa densità

Summary

I neutrofili a bassa densità (LDN) aumentano significativamente in diverse malattie. Le LDN sono solitamente isolate attraverso la selezione cellulare. Presentiamo un metodo pratico per ottenere LDN puro e vitale. Dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico, le cellule vengono incubate con microsfere magnetiche e quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche.

Abstract

I neutrofili, importanti leucociti dell'immunità innata, sono stati tradizionalmente considerati una popolazione cellulare omogenea. Tuttavia, prove recenti hanno dimostrato che i neutrofili esistono in diverse sottopopolazioni. Una di queste sottopopolazioni è quella dei neutrofili a bassa densità (LDN). Le LDN si trovano in piccole quantità nel sangue di individui sani, ma il loro numero aumenta significativamente in malattie come il lupus eritematoso sistemico, le malattie autoimmuni, il cancro e le infezioni. In questi casi, l'LDN può partecipare alla patogenesi della malattia. L'unico modo per isolare l'LDN è attraverso la centrifugazione a gradiente di densità del sangue periferico. Tuttavia, dopo la centrifugazione, le LDN co-purificano con le cellule mononucleate. Pertanto, lo studio di questa sottopopolazione di neutrofili è impegnativo. Non esiste una metodologia standard per separare le LDN dalle celle mononucleate. Tipicamente, le LDN vengono separate mediante smistamento cellulare in un citometro a flusso. Tuttavia, questo metodo richiede lunghi tempi di selezione (ore) per ottenere abbastanza cellule pure per ulteriori studi funzionali. Ciò influisce seriamente sulla vitalità e sulla funzione delle cellule. Qui, proponiamo un metodo pratico per ottenere un gran numero di LDN puro e vitale in breve tempo. Dopo la centrifugazione a gradiente di densità, la frazione di cellule mononucleate viene incubata con microsfere magnetiche anti-CD66b, quindi le LDN vengono separate attraverso colonne magnetiche in < 30 minuti. Le LDN purificate (cellule CD66b⁺ ) sono marcate con anticorpi monoclonali contro CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b e CD98 e vengono analizzate mediante citometria a flusso per conferma. Gli LDN purificati sono completamente funzionali, come indicato dalla loro capacità di produrre specie reattive dell'ossigeno e di formare trappole extracellulari neutrofile. Questo nuovo metodo di purificazione consente di ottenere LDN con elevata purezza (oltre il 90%) e vitalità (oltre il 96%) in un breve periodo di tempo. Questo metodo può essere facilmente scalato per ottenere un gran numero di LDN puri per valutare le funzioni dell'LDN in diverse malattie attraverso analisi biochimiche o altre analisi omiche.

Introduction

I neutrofili, i leucociti predominanti nel sangue umano¹, sono partecipanti chiave del sistema immunitario innato. Arrivano in gran numero ai tessuti con infiammazione o infezione². Lì, i neutrofili attivano diverse funzioni effettrici, come la fagocitosi ^3,4, la degranulazione ^5,6 e la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET)⁷. Inoltre, anche i neutrofili partecipano alla risposta immunitaria adattativa⁸. ....

Protocol

Tutte le procedure di questo protocollo seguono le linee guida del Comitato di Bioetica per la Ricerca Umana dell'Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e neutrofili da sangue umano

1. Ottenere circa 10 ml di sangue da un volontario adulto sano mediante venipuntura. Aggiungere 10 U/mL di eparina come anticoagulante.
   ATTENZIONE: Smaltire l'ago in un contenitore per lo smaltimento degli aghi a rischio biologico. Le siringhe ....

Results

I neutrofili a bassa densità (LDN) in individui sani rappresentano circa il 5% della PBMC (Figura 2A). Il protocollo qui descritto fornisce in genere LDN puro (> 90%). Le cellule vengono anche recuperate in modo efficiente (resa intorno al 98%) con un'elevata vitalità (> 95%); Figura 2B). Per confronto, le LDN sono state anche purificate mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza, co.......

Discussion

In generale, i neutrofili erano considerati come cellule omogenee. Tuttavia, recenti prove hanno dimostrato che i neutrofili potrebbero esistere come cellule con diversi stati di attivazione e/o fenotipi multipli. Pertanto, possono esistere varie sottopopolazioni di neutrofili 13,14,15. Una sottopopolazione di neutrofili, i neutrofili a bassa densità (LDN), ha acquisito grande interesse per le l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo policlonale anti-citrullina del coniglio	AbCam	ab100932	Diluizione 1/50
Piastra di coltura tissutale a 96 pozzi	Costante; Corning, Inc.	3596
Anticorpo IgG1 anti-umano CD11b di Alexa Fluor 488	BioLegend	301317	0,25 μ g/mL
Anticorpo IgM anti-umano CD66b Alexa Fluor 647	BioLegend	305109	0,05 μ g/mL
Anticorpo anti-IgG del topo (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11001	Diluizione 1/50
Anticorpo monoclonale IgG1 di topo anti-neutrofili elastasi	Santa Cruz Biotecnologia	SC-55549	10 & micro; g/mL
Anticorpo anti-coniglio IgG (H+L) per l'asino, Alexa Fluor 555	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-31572	Diluizione 1/50
Anticorpo IgG1 anti-umano CD62L del topo APC	BioLegend	304809	0,03 μ g/mL
Anticorpo IgG1 del topo anti-umano CD14 APC/Cyanine7	BioLegend	367107	0,25 μ g/mL
Attune NxT flow cytometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	(laser blu/rosso)
Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V	MP Biomedici	810025
Anticorpo IgG1 del topo Brilliant Violet 510 anti-umano CD33	BioLegend	366609	0,30 μ g/mL
DAPI	Calbiochem/EMD Millipore	268298
Dextrano T500	Farmacosmos A/C	5.51005E+11
Diidrorodamina-123	Anaspec, Inc.	AS-85711
Classificatore di celle FACS	Becton Dickinson	Modello FACSAria
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	16000-044
Ficoll-Paque	Merck KG	GE 17-1440-03
Anticorpo IgG1 FITC anti-umano CD98 per topi	BioLegend	315603	0,30 μ g/mL
FlowJo Software	Becton Dickinson	Versione 10, 2019
Microscopio a fluorescenza invertita	Olympus	Modello IX-70
Eparina	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
Hepes	Sigma Aldrich	H7006
Microbiole di chimerismo CD66b di MACSprep	Miltenyi Biotec	130-111-552
Magnete	Miltenyi Biotec	130-042-102
Colonna di separazione magnetica	Miltenyi Biotec	130-042-201
Microcentrifuga	Eppendorf	Modello 5415C
Lettore di microplacche	BioTek Instruments	Sinergia dei modelli HT
Paraformaldeide	Sigma Aldrich	158127
Anticorpo IgG1 PE anti-umano CD10 del topo	BioLegend	312203	0,05 μ g/mL
Anticorpo IgG2a PE anti-umano CD16b topo	BD Pharmingen	550868	Diluizione 1/40
Anticorpo IgG1 di topo anti-umano PE/Cyanine5	BioLegend	323013	0,25 μ g/mL
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma Aldrich	P8139
poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P2658
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	Modello 5702R
Mezzo di coltura tissutale RPMI-1640	Gibco	23400-021
SYTOX Green	Molecular Probes, Inc.	S-7020
Preadolescente-20 e nbsp;	Sigma Aldrich	P2287
Vectashield	Laboratori Vector	H-1000