Method Article

Un protocollo per la costruzione di un modello murino di fibrosi miocardica ipertensiva utilizzando l'angiotensina II

DOI:

10.3791/69409

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November 14th, 2025

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1The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Southwest Medical University, 2Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, 3Guangdong-Macao In-Depth Cooperation Zone in Hengqin, Chinese Medicine Guangdong Laboratory (Hengqin Laboratory), 4State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Syndrome, Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, 5School of Pharmacy, Southwest Medical University

In This Article

Summary

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L'infusione continua di angiotensina II (Ang II) tramite pompe osmotiche è uno dei metodi classici per la costruzione di modelli animali di fibrosi miocardica ipertensiva. Questo protocollo ha ottimizzato sistematicamente il processo di costruzione di questo modello e ha elaborato i punti chiave dell'impianto, del posizionamento e dell'impostazione della concentrazione di Ang II della pompa osmotica.

Abstract

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L'infusione continua di angiotensina II (Ang II) tramite pompe osmotiche è un approccio ampiamente utilizzato per stabilire modelli animali di fibrosi miocardica ipertensiva. Tuttavia, questa tecnica presenta alcune limitazioni nei rapporti attuali, come l'instabilità di Ang II, il posizionamento impreciso della pompa e la mancanza di una procedura standardizzata. Le attuali relazioni sulla metodologia di istituzione rimangono relativamente limitate. Questo protocollo ha sistematicamente ottimizzato la creazione di modelli di fibrosi miocardica ipertesa indotta da pompa osmotica Ang II nei topi, compresa la preparazione standardizzata della soluzione di Ang II, la calibrazione del dosaggio, l'impianto sottocutaneo preciso di pompe osmotiche e gli standard quantitativi per gli indicatori di valutazione del modello. I risultati sperimentali hanno dimostrato che la fibrosi miocardica ipertensiva indotta dalla pompa osmotica Ang II nei topi con alti tassi di sopravvivenza. I livelli di pressione arteriosa sistolica (SBP) si sono stabilizzati a 160 mmHg dopo sette giorni dall'impianto sottocutaneo. I topi modello avevano una riduzione significativa delle frazioni di eiezione ventricolare sinistra e un aumento delle dimensioni telediastoliche del ventricolo sinistro. Rispetto al gruppo di chirurgia fittizia, la deposizione di collagene all'interno del tessuto interstiziale miocardico ipertensivo e delle regioni perivascolari è aumentata. Questo studio, basato su un campione di piccole dimensioni (n = 6), ha convalidato preliminarmente la fattibilità di stabilire un modello murino di fibrosi miocardica ipertensiva utilizzando Ang II combinato con una pompa osmotica e ha stabilito un sistema di verifica quantitativa del fenotipo.

Introduction

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La fibrosi miocardica (MF), uno dei principali sintomi patologici dell'ipertensione, è caratterizzata da un'eccessiva deposizione di fibre di collagene all'interno del miocardio danneggiato o compresso. Rappresenta una delle forme più importanti di danno d'organo bersaglio mediato dall'ipertensione e contribuisce alla progressiva disfunzione cardiaca 1,2. La creazione di modelli animali appropriati è essenziale per far progredire la ricerca meccanicistica e sviluppare nuove strategie terapeutiche per la fibrosi miocardica ipertensiva. L'angiotensina II (Ang II), un effettore centrale del sistema renina-angiotensina, svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'ipertensione3. L'induzione basata su Ang II è quindi diventata un approccio ampiamente utilizzato per stabilire modelli di ipertensione nei topi.

I metodi attuali per la costruzione di modelli animali di ipertensione includono principalmente l'induzione chirurgica, l'induzione farmacologica e i modelli spontanei transgenici. L'induzione chirurgica utilizza tipicamente tecniche come la costrizione dell'arteria renale, la costrizione dell'aorta ascendente o la costrizione dell'arco aortico per aumentare artificialmente la resistenza del flusso sanguigno, inducendo così un'elevata pressione sanguigna4. Sebbene questi metodi possano stabilire rapidamente stati di ipertensione adatti allo studio dei processi di rimodellamento cardiaco correlati al carico di stress, comportano procedure complesse con numerose complicanze postoperatorie. L'induzione farmacologica utilizza generalmente l'iniezione intraperitoneale o la somministrazione orale per aumentare la pressione sanguigna negli animali da esperimento5. Sebbene la tecnologia sia relativamente semplice, la stabilità del modello rimane suscettibile all'interferenza del dosaggio del farmaco, della frequenza di somministrazione e delle risposte allo stress degli animali. I modelli transgenici come i ratti spontaneamente ipertesi e i topi ipertesi BPH/2J, che mostrano fenotipi di ipertensione stabili, sono ampiamente utilizzati nella ricerca sull'ipertensione ereditaria. Tuttavia, i loro singolari meccanismi patogenetici limitano la loro capacità di simulare l'ipertensione clinica indotta da più fattori.

Più recentemente, i modelli di ipertensione basati sull'infusione continua di Ang II tramite pompe osmotiche sottocutanee hanno guadagnato popolarità. Questo metodo consente il rilascio prolungato di Ang II a una velocità costante, mantenendo stabili le concentrazioni ematiche per periodi prolungati per imitare da vicino i processi patologici e replicare la fibrosi miocardica ipertensiva del topo 6,7,8. Ciononostante, permangono importanti limitazioni, in particolare per quanto riguarda la standardizzazione del protocollo e gli esiti fibrotici incoerenti, che possono essere influenzati da fattori quali la tecnica di impianto della pompa e le risposte specifiche dell'animale9. Per colmare queste lacune, questo studio perfeziona il modello basato sulla pompa osmotica Ang II, standardizza i passaggi chiave e fornisce un protocollo visualizzato. Questi miglioramenti migliorano la riproducibilità e l'applicabilità pratica, offrendo un prezioso riferimento per studi futuri sulla fibrosi miocardica ipertensiva.

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Protocol

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Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health e i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la ricerca sugli animali della Southwest Medical University (numero di approvazione SWMU2020317).

1. Preparazione della soluzione di Ang II e riempimento della pompa osmotica

  1. Selezionare 12 topi maschi C57BL/6J di grado SPF (vedi Tabella dei materiali) di peso compreso tra 20 ± 1 g selezionando animali di 8 settimane per la loro uniformità di sviluppo per controllare i fattori confondenti legati all'età. Dividi i topi in un gruppo di chirurgia fittizia e in un gruppo modello utilizzando un semplice metodo di randomizzazione, con 6 topi in ciascun gruppo.
  2. Misurare il peso corporeo iniziale del topo e determinare la dose di Ang II (vedere la Tabella dei materiali) in 1,46 mg/kg/die.
    NOTA: Secondo l'esperimento preliminare, 1,46 mg/kg/die è la dose ottimale di Ang II. Questa dose mantiene in modo affidabile la pressione arteriosa sistolica a circa 160 mmHg, inducendo efficacemente la fibrosi miocardica patologica e garantendo la sopravvivenza degli animali durante lo studio di 4 settimane.
  3. Aggiungere 2,45 mL di soluzione fisiologica sterile allo 0,9%, pre-raffreddata a 4 °C, a 10 mg di polvere liofilizzata Ang II. Mescolare accuratamente la soluzione e tenerla in ghiaccio per un uso immediato.
  4. Eseguire la procedura sul ghiaccio utilizzando una siringa per aspirare la soluzione di Ang II, quindi iniettare in sequenza 200 μL (concentrazione di 3,91 mmol/L) in ciascuna delle sei camere della pompa osmotica (vedere Tabella dei materiali).
  5. Attivare il drive di pressione osmotica immergendo la pompa in soluzione fisiologica sterile a 37 °C per 48 ore.
    NOTA: Riempire le pompe osmotiche per il gruppo di chirurgia fittizia con un volume uguale di soluzione fisiologica. Poiché l'Ang II è fotosensibile, la procedura deve essere eseguita sotto la completa protezione della luce per tutto il tempo.

2. Impianto delle pompe osmotiche e costruzione del modello 6

  1. Preparazione animale e anestesia
    1. Digiunare i topi per 4 ore con libero accesso all'acqua. Quindi, pesare ciascun topo e calcolare la dose di anestetico appropriata (80 mg/kg di pentobarbital sodico)10.
    2. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale della dose calcolata di pentobarbital sodico.
      NOTA: La manipolazione del pentobarbital richiede il rispetto delle normative, il funzionamento in una cappa aspirante, l'uso di dispositivi di protezione e l'etichettatura del liquido residuo per lo smaltimento separato.
  2. Rimuovere i peli dalla pelle dorsale sulla regione che si estende dalla base della coda alla zona medio-dorsale usando un rasoio o una crema depilatoria.
  3. Disinfettare accuratamente l'area rasata tre volte con etanolo al 70%11.
  4. Utilizzando un bisturi, praticare un'incisione sottocutanea di 0,5 cm all'interno dell'area disinfettata.
  5. Attraverso l'incisione, utilizzare una pinza per separare smussatamente il tessuto sottocutaneo verso la parte posteriore del collo, creando una tasca.
  6. Orientare il corpo della pompa con la punta del catetere rivolta verso la testa del topo. Quindi, bloccare la punta con una pinza emostatica e inserire la pompa per via sottocutanea in quella direzione.
  7. Dopo l'impianto della pompa, suturare il tessuto sottocutaneo con suture riassorbibili 6-0 interrotte e chiudere l'incisione cutanea con suture chirurgiche. Quindi, posizionare il mouse in un tappetino termico preriscaldato a 37 °C fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia (circa 5-10 minuti).
  8. Infondere continuamente la soluzione di Ang II preparata alla dose predeterminata (1,46 mg/kg/die) tramite le pompe osmotiche per 28 giorni.
  9. Al termine del periodo di infusione di 28 giorni, raccogliere tutti i dati sperimentali. Quindi, anestetizzare i topi nello stesso modo in cui sono stati fatti per le precedenti anestetismi, cioè seguendo le procedure descritte nei passaggi 2.1.1-2.1.2, e sopprimerli mediante lussazione cervicale.

3. Misurazione della pressione sanguigna

  1. Preriscaldamento dell'apparecchiatura (vedi Tabella dei materiali): Impostare la piattaforma di riscaldamento a 37-38 °C per garantire la vasodilatazione nei vasi sanguigni della coda di topo.
  2. Afferra delicatamente il mouse e posizionalo nel supporto di ritenuta, assicurandoti che la coda sporga liberamente attraverso il foro posteriore. Quindi, pulisci accuratamente la coda esposta con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol.
  3. Posiziona un polsino gonfiabile alla base della coda. Posizionare il cardiofrequenzimetro a circa 5-10 mm distalmente rispetto al bracciale nella sezione della coda medio-bassa.
  4. Attivare il dispositivo e attendere che la forma d'onda dell'impulso si stabilizzi prima di procedere.
  5. Avviare il ciclo di misurazione. Il sistema gonfierà automaticamente il bracciale a una pressione superiore a 200 mmHg per occludere il flusso sanguigno, quindi si sgonfierà lentamente a 2-3 mmHg al s. Il sensore rileva la ricomparsa dell'onda del polso alla ripresa del flusso, determinando la pressione sistolica.
  6. Misurare la pressione arteriosa sistolica (SBP) a intervalli di 7 giorni dopo la modellazione, per un totale di cinque misurazioni. Per ogni mouse in ogni punto temporale, registrare tre letture sequenziali, consentendo un periodo di riposo di 2 minuti tra misurazioni consecutive.
  7. Dopo le misurazioni, rimetti il topo nella sua gabbia con cibo e acqua. Pulire il supporto e il manicotto di coda per evitare la contaminazione incrociata.

4. Misurazione della funzione cardiaca

  1. Il giorno 28 di modellazione, anestetizzare tutti i topi sperimentali con pentobarbital sodico (80 mg/kg di pentobarbital sodico).
  2. Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma a temperatura costante.
  3. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica utilizzando un sistema a ultrasuoni (vedere la Tabella dei materiali). Collegare gli arti del mouse agli elettrodi sulla piattaforma per monitorare i segnali dell'elettrocardiogramma (ECG).
  4. Ottieni l'imaging dell'asse corto a livello del muscolo mammario tramite ecografia M-mode per visualizzare il cuore e analizzare la funzione cardiaca. Acquisisci tre immagini per topo e calcola la media dei dati per la successiva analisi della dimensione diastolica interna del ventricolo sinistro (LVIDd), della sistolica del diametro interno del ventricolo sinistro (LVID), dell'accorciamento frazionario del ventricolo sinistro (LVFS) e della frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF).
    NOTA: Mantenere il contatto della sonda con la parete toracica senza comprimere la cavità toracica; garantire la linea di campionamento M-mode perpendicolare al setto ventricolare; Eseguire misurazioni continue per ≥ 3 cicli cardiaci per ottenere valori medi.

5. Colorazione Masson

  1. Campionamento e fissazione cardiaca
    1. Anestetizzare il topo con pentobarbital sodico (80 mg/kg di pentobarbital sodico). Quindi, praticare un'incisione longitudinale di circa 1,5 cm nella cavità toracica utilizzando le forbici, legare i principali vasi cardiaci e asportare rapidamente il cuore per evitare lesioni da trazione12.
    2. Sciacquare immediatamente il cuore asportato con PBS pre-raffreddato per rimuovere il sangue e asciugare delicatamente l'umidità in eccesso utilizzando carta da filtro pulita. Successivamente, eseguire una sezione trasversale lungo il muscolo papillare per ottenere una fetta di tessuto di 3 mm di spessore.
    3. Per il fissaggio, immergere i campioni cardiaci in paraformaldeide al 4% per oltre 48 ore, garantendo un rapporto minimo tra tessuto e volume fissativo di 1:10.
  2. Rimuovere il tessuto cardiaco dal fissativo paraformaldeide al 4%. Quindi, sotto una cappa aspirante, affettare sottilmente il tessuto a uno spessore di 4 μm con un coltello chirurgico e trasferire le fette in una cassetta di disidratazione13.
  3. Caricare le sezioni di tessuto nell'essiccatore ed eseguire i seguenti passaggi: 70% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo per 1 ora ciascuno; 100% etanolo I e II per 45 minuti ciascuno; xilene I e II per 30 minuti ciascuno.
  4. Incorporare il tessuto nella paraffina, quindi solidificare i blocchi su una piastra fredda pre-raffreddata a -20 °C.
  5. Utilizzare un microtomo di paraffina per ottenere sezioni longitudinali spesse 4 μm dai blocchi di tessuto inclusi in paraffina. Quindi, immergere in sequenza le sezioni nelle seguenti soluzioni per 5 minuti ciascuna per deparaffinarle e reidratarle: xilene I, xilene II, etanolo assoluto, etanolo al 95%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e infine acqua distillata.
  6. Immergere il fazzoletto nella soluzione colorante di ferro ematossilina di Weigert preparata per 8 minuti. Quindi, risciacquare ripetutamente con acqua distillata per rimuovere la soluzione colorante in eccesso. Differenziare in soluzione di differenziazione acida di etanolo per 5 s, quindi azzurrare nella soluzione azzurrante di Masson per 5 minuti. Infine, risciacquare con acqua distillata14.
  7. Colorare le sezioni con rosso carminio per 10 min, applicando circa 200-300 μL per vetrino per garantire una copertura completa e uniforme del tessuto. Quindi, sciacquare le sezioni con acido acetico glaciale allo 0,2% per 1 minuto.
  8. Trattare le sezioni con una soluzione di acido fosfomolibdico per circa 5 minuti, o fino a quando le fibre muscolari diventano rosse. Quindi, colorare le sezioni con un volume sufficiente di soluzione di blu di anilina da coprire completamente il tessuto (in genere 200-300 μl per vetrino) per 5 minuti. Infine, sciacquare le sezioni con una soluzione di acido acetico glaciale allo 0,2%15.
  9. Disidratare le sezioni attraverso una serie di etanolo graduato. Procedere a liberare i tessuti con xilene utilizzando tre immersioni di 1-2 minuti ciascuna.
  10. Montare le sezioni applicando una piccola quantità di resina neutra e coprendo con un vetrino coprioggetti.
  11. Esame microscopico (vedi Tabella dei materiali): Osservare i tessuti macchiati di Masson con un ingrandimento del 40×, 20× e 10×. Fotografa ogni diapositiva per preservare le immagini rappresentative.
    NOTA: Smaltire tutti i rifiuti in conformità con i protocolli di sicurezza istituzionali. Raccogliere la soluzione di differenziazione acida e l'acido acetico glaciale in barili resistenti alla corrosione, neutralizzare i rifiuti ad alta concentrazione a pH 6-8 e non mescolare con soluzioni alcaline. Conservare l'etanolo in barili antideflagranti in un luogo fresco, lontano da fonti di fuoco. Tenere lo xilene in barili marroni, operare in una cappa aspirante con dispositivi di protezione indossati e non mescolare acidi (sostanze) con etanolo. Mettere i tessuti animali in contenitori etichettati, sigillarli e conservarli in condizioni di congelamento16. Infine, conferire tutti i rifiuti a istituzioni professionali qualificate per lo smaltimento; Vietare severamente di mescolare i rifiuti o di smaltirli casualmente.

6. Analisi statistica

  1. Raccogli tutti i dati numerici e analizzali utilizzando GraphPad Prism 9.0.
  2. Utilizzare il t-test campione indipendente per analizzare le differenze tra i gruppi.
  3. Impostare la significatività statistica come **P < 0,01 per altamente significativo e *P < 0,05 per significativo.

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Results

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Dodici topi sono stati impiantati per via sottocutanea con pompe osmotiche e sono sopravvissuti. Tutti i gruppi modello hanno sviluppato ipertensione (n = 6). Sette giorni dopo l'impianto, la PAS media nel gruppo modello ha superato i 160 mmHg (Figura 1A). Nei giorni 14, 21 e 28, l'SBP nel gruppo modello è rimasto costantemente al di sopra di 160 mmHg. Al contrario, il gruppo di chirurgia fittizia ha mantenuto livelli normali di SBP (circa 90-110 mmHg) per tutta la durata dell'esperimento se...

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Discussion

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Questo protocollo ha ottimizzato i passaggi chiave coinvolti nell'infusione continua di Ang II per indurre la fibrosi miocardica ipertensiva utilizzando una pompa osmotica e ha dettagliato gli aspetti critici, come il posizionamento dell'impianto della pompa osmotica e l'impostazione della concentrazione di Ang II. La pompa modello 2004 è stata scelta per la sua durata di 4 settimane e la dose di Ang II è stata calcolata in base alla velocità di infusione nominale, tenendo conto della mi...

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Disclosures

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Tutti gli autori dichiarano che questo manoscritto non presenta conflitti di interesse.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82074378), dal Progetto del Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2022YFS0618), dal Progetto dell'Ufficio di Scienza e Tecnologia e dal lavoro di talento di Luzhou (2023JYJ029), dal Progetto di Laboratorio Provinciale del Guangdong di Medicina Tradizionale Cinese 2024 (HQCML-C-2024005), dal Programma di Scienza e Tecnologia di Shenzhen (JCYJ20230807094603007, JCYJ20240813152440051), dal Fondo di Ricerca Medica di Shenzhen (A2403028), Progetto dell'Associazione Medica del Sichuan (Q2025014) e Progetto della Southwest Medical University (2024ZKZ007, 2024ZKY073, 2023ZYYQ04). Il finanziatore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nell'analisi dei dati o nella decisione di pubblicarlo.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ang IISigma-Aldrich CorporationSigma, A9525
Macchina per anestesia animaleShenzhen Reward Life Science Co., LtdR530
Ventilatore per animaliShenzhen Reward Life Science Co., LtdR415
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.Versione 9.0
Monitor intelligente non invasivo della pressione sanguignaNippon Soft Dragon Co., LtdSoftron, BP-98A
Microscopio otticoYijingtong Optical Technology (Shanghai) Co., LtdOLYMPUS, SZ61TR
Soluzione e kit per la tintura tricolore MassonBeijing Soleibao Technology Co., LtdSolarbio, G1340
TopiChengdu Dossy Exprimental Animals CO., LtdC57BL/6J
Pompe osmoticheALZA CorporationAlzet, Modello 2004
Sistemi di imaging a ultrasuoniFUJIFILM VisualSonics Corporation, CanadaFUJIFILM, Vevo 3100

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