Modellizzazione della metastasi cerebrale: analisi standardizzata della colonizzazione metastatica e dei modelli di crescita istologica tramite iniezione intracorticale stereotattica

Sommario

La tecnica di iniezione intracranica stereotatattica consente l'impianto preciso e localizzato delle cellule tumorali nella corteccia del muro, rendendola un modello potente per studiare la colonizzazione metastatica del cervello.

Abstract

Le metastasi cerebrali sono una complicanza comune e devastante dei tumori solidi avanzati, frequentemente associata a una prognosi negativa, declino neurologico e riduzione della qualità della vita. L'incidenza di insufficienza del sistema nervoso centrale (SNC) e della morte neurologica sta aumentando rapidamente, tuttavia i meccanismi che guidano le fasi finali della metastasi cerebrale, come la diffusione secondaria, la ricolonizzazione e il contributo del modello di crescita istologico (HGP) come potenziale parametro surrogato, restano poco compresi.

Il modello standardizzato di iniezione intracorticale stereotattica consente l'impianto preciso e riproducibile di cellule tumorali, o popolazioni miste incluse componenti stromali o immunitari, direttamente nella corteccia cerebrale del muro. Questo protocollo supporta anche la creazione di un archivio tessuti preclinico, offrendo una piattaforma robusta per indagare aspetti essenziali della colonizzazione del SNC, come: crescita metastatica, dinamiche di crescita specifiche per HGP e meccanismi fisiopatologici che contribuiscono al fallimento neurologico. Inoltre, questo modello supporta test farmacologici in un contesto clinicamente rilevante riproducibile.

A differenza dei metodi di iniezione sistemica (ad esempio vena caudale o intracardiaca), ottimizzati per studiare le fasi metastatiche precoci ma che portano a tassi variabili e spesso bassi di colonizzazione cerebrale, il modello stereotassico garantisce una crescita metastatica costante e specifica del cervello e consente l'indagine delle fasi avanzate della metastasi del SNC. Rispetto ai sistemi ex vivo come organoidi o colture a taglio cerebrale, il modello stereotassico in vivo preserva la vascolarizzazione, la segnalazione sistemica e la complessità completa del paesaggio immunitario cerebrale, supportando studi a lungo termine sulla progressione tumorale e sulla risposta terapeutica.

Fornendo una piattaforma riproducibile e clinicamente rilevante, il nostro modello promuove la capacità del campo di identificare marcatori prognostici, esplorare strategie terapeutiche e comprendere i meccanismi delle metastasi cerebrali in stadio avanzato.

Introduzione

Le metastasi cerebrali sono una complicanza comune e devastante nei pazienti con tumori solidi, frequentemente associate a una prognosi scadente, un significativo declino neurologico e una riduzione della qualità della vita ^1,2,3. In particolare, l'insufficienza del sistema nervoso centrale (SNC) e la morte neurologica sono diventati esiti sempre più frequenti in tumori come polmoni, seno e ^melanoma 4,5,6,7. L'insufficienza del sistema nervoso centrale nel contesto delle metastasi cerebrali può derivare da una varietà di meccanismi, tra cui effetto di massa locale, edema peritumorale, emorragia intracranica e disseminazione meningea, che possono agire indipendentemente o sinergicamente fino a portare infine alla morte^{neurologica 8}.

Nonostante la sua importanza clinica, i meccanismi fisiopatologici alla base dell'insufficienza del SNC e delle fasi finali della progressione metastatica restano poco compresi. Processi come la diffusione alternativa, la diffusione secondaria e la ricolonizzazione raramente sono al centro di indagini^{dedicate 8}. Sia gli studi clinici che quelli preclinici spesso limitano le loro analisi a endpoint come il numero di metastasi cerebrale, la dimensione o la sopravvivenza complessiva (OS), trascurando così le intuizioni meccanicistiche critiche e le vere cause del declino neurologico e della morte.

In questo contesto, noi e altri abbiamo identificato distinti schemi di crescita istologica (HGP) nelle metastasi cerebrali che si correlano con gli esiti^{clinici 9,10,11}. Sono stati descritti tre principali HGP: i) non infiltrativo, caratterizzato da un bordo tumorale ben delimitato spesso circondato da un bordo astrocitotico reattivo; ii) infiltrativo epiteliale, in cui gruppi di cellule tumorali infiltrano il parenchima cerebrale adiacente senza contenimento astrocitico; e iii) infiltrativo diffuso, caratterizzato da un'infiltrazione diffusa di singole cellule tumorali o piccoli cluster, causando un'estesa astrogliosi^10,12.

Clinicamente, gli HGP infiltrativi sono associati a una prognosi significativamente peggiore rispetto ai pattern non^{infiltrativi 9,10,11}. Inoltre, gli HGP sembrano riflettere aspetti chiave della dinamica della crescita tumorale e dei meccanismi che portano alla morte neurologica. Mentre le metastasi non infiltrative si espandono tipicamente come una singola lesione e costringono le strutture vitali nel cervello, le lesioni infiltrative mostrano una diffusione secondaria (a partire dalla lesione esistente e non dal tumore primario) all'interno del SNC, contribuendo a danni diffusi e distruzione completa degli organi (dati non pubblicati). Le lesioni infiltrative possono anche ricolonizzare le meningi, contribuendo alla metastasi meningea e complicando ulteriormente il corso della^{malattia 10,13}. Nonostante la loro rilevanza clinica, gli HGP delle metastasi cerebrali e le fasi finali della colonizzazione del SNC, inclusa la diffusione secondaria e la ricolonizzazione dello stesso organo, restano poco studiati, principalmente a causa della mancanza di modelli sperimentali adeguati.

Per colmare questa lacuna, presentiamo un modello stereotattico di iniezione intracranica che consente l'impianto preciso e riproducibile di cellule tumorali o miscele cellulari che comprendono cellule tumorali e uno o più tipi di cellule non tumorali nella corteccia cerebrale di topi sperimentali. Questo modello supera i limiti chiave dei modelli di metastasi sistemica e offre una solida piattaforma per indagare aspetti essenziali della colonizzazione del SNC, come: le interazioni tumore-cellule immuni durante la^{colonizzazione 14}, l'impatto delle miscele cellulari^{pretrattate 15}, la crescita^{metastatica 16}, la dinamica di crescita specifica per HGP e i meccanismi fisiopatologici che contribuiscono al fallimento neurologico (dati non pubblicati). Inoltre, questo modello supporta test farmacologici in un contesto riproducibile e clinicamente^{rilevante 14,15}.

Questo protocollo offre un quadro metodologico dettagliato per implementare il modello di iniezione stereotattica per studiare gli HGP nelle metastasi cerebrali. Supporta inoltre lo sviluppo di un archivio preclinico strutturato di campioni e di una libreria digitale di tessuti per l'indagine sistematica della biologia della colonizzazione del SNC in fase avanzata. Il nostro obiettivo è permettere l'identificazione di biomarcatori prognostici e potenzialmente predittivi, contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche migliorate e migliorare la nostra capacità di prevedere le risposte acute e croniche del parenchima cerebrale e del sistema immunitario. Attraverso questo approccio, cerchiamo di fornire una piattaforma standardizzata per uno studio sistematico della colonizzazione del SNC e della progressione metastatica.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo protocollo sono state condotte secondo le linee guida istituzionali e approvate dal Governo della Bassa Franconia (numero di permesso: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Questo protocollo è progettato per l'iniezione intracorticale stereotassica di cellule tumorali in topi adulti sintetici (10-12 settimane) come modello per la colonizzazione metastatica del cervello. Qualsiasi modifica al protocollo dovrebbe essere discussa con l'ufficiale designato per il benessere animale.

1. Procedure preoperatorie

1. Acclimatazione degli animali
   NOTA: I topi devono essere acclimatati per almeno 7 giorni prima dell'inizio delle procedure sperimentali.
   1. Ospitare animali sperimentali in gruppi in condizioni standard di laboratorio (22 ± 2 °C, 50-60% di umidità relativa, ciclo chiaro/buio di 12 ore) con accesso ad libitum a cibo e acqua.
   2. Per promuovere il benessere e ridurre lo stress, fornire arricchimento ambientale sotto forma di materiale per il nidificazione, rifugi e blocchi da rosicchiare.
   3. Maneggia gli animali una volta al giorno (3-5 minuti per sessione) durante il periodo di acclimatazione per familiarizzare con il contatto umano. Inoltre, esegui procedure simulate che simulano aspetti chiave dell'intervento imminente, inclusa la pesatura e l'esposizione all'impianto anestesico, senza effettuare alcun intervento invasivo. Queste sessioni mirano ad abituare gli animali all'ambiente procedurale e a minimizzare la variabilità legata allo stress.
2. Esame fisico (controllo pre-chirurgico)
   NOTA: Prima dell'iniezione delle cellule tumorali, tutti gli animali devono sottoporsi a un esame fisico e neurologico approfondito per escludere eventuali anomalie preesistenti non correlate allo studio. Gli animali che mostrano deficit o anomalie dovrebbero essere esclusi dallo studio. L'esame fisico può essere eseguito il giorno prima dell'iniezione.
   1. Esegui un'ispezione fisica completa valutando la salute generale, inclusa la condizione del mantello, la postura, la respirazione, l'andatura, il peso corporeo e il comportamento generale.
   2. Valutare la funzione neurologica utilizzando il Test del Filo Sospeso per valutare la forza della presa e la coordinazione. Per eseguire il Test del Filo Sospeso, sospendere un filo orizzontale (circa 2 mm di diametro) tra due supporti, con piattaforme di fuga posizionate alle estremità circa 30 cm sopra una superficie imbottita. Posiziona il topo al centro del filo e lascia che afferri il filo con le zampe anteriori. Rilascia il mouse e inizia subito a sincronizzare. Termina la prova quando il mouse raggiunge una delle piattaforme o cade. Considera un mouse riuscito se raggiunge la piattaforma entro 60 s; Registra come fallimento se cade o non raggiunge la piattaforma entro questo limite di tempo.
3. Preparazione delle postazioni di lavoro
   1. Il giorno dell'intervento (giorno 0), installare quattro postazioni di lavoro dedicate come descritto di seguito per garantire un flusso di lavoro efficiente e mantenere la tecnica sterile durante tutta la procedura.
      NOTA: Utilizzare materiali chirurgici sterili (sottostanti, impacchi di garza, suture, ecc.) e strumenti chirurgici autoclavati (bisturi, forci, forbici, spatola, ecc.).
      1. Postazione di lavoro #1 - Preparazione pre-operatoria degli animali: Usa questa postazione per pesare i topi, preparare la soluzione anestetica e somministrare l'anestesia. Prepara una superficie pulita contenente una bilancia, due gabbie con biancheria (designata una per topi anestetizzati), una siringa da 1 mL riempita con la soluzione anestetica e pomata per gli occhi.
      2. Postazione di lavoro #2 - Configurazione pre- e post-operatorio: Usa questa postazione per eseguire l'incisione del cuoio capelluto, sigillare il cranio e suturare la ferita. Prepara una superficie pulita contenente un bisturi, una siringa da 10 mL con 0,9% di NaCl, cera ossea, una spatola, materiale per sutura, pinze e forbici, cotton swab, disinfettante (70% etanolo), una siringa da 1 mL con analgesici e una borsa riscaldante o una piattaforma riscaldante simile.
      3. Postazione di lavoro #3 - Preparazione delle cellule tumorali: Usa questa postazione per preparare la soluzione delle cellule tumorali prima dell'inoculazione. Prepara una superficie pulita contenente una ghiacciaia con una siringa Hamilton da 10 μL e un tubo Eppendorf con sospensione cellulare in mezzo a matrice extracellulare (ECM), una pipetta con punte da 100 μL per la risospensione delle cellule, e tre recipienti per la pulizia della siringa Hamilton dopo l'inoculazione delle cellule tumorali contenenti acqua distillata, 70% etanolo e 0,9% NaCl.
      4. Postazione di lavoro #4 - Iniezione stereotattica: Usa questa postazione per eseguire l'iniezione stereotassica delle cellule tumorali nella corteccia cerebrale. Prepara una superficie pulita che contenga il telaio stereotassico per animali piccoli, un trapano dentale di precisione, pinze grandi e cotton fioc.
4. Preparazione della sospensione delle cellule tumorali
   NOTA: Tutte le procedure per la preparazione della sospensione delle cellule tumorali devono essere eseguite in un armadietto di sicurezza biologica certificato (cappuccio di Classe II) utilizzando dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti e protezione oculare, per garantire la sterilità e proteggere il personale da potenziali esposizioni a rischi biologici.
   1. Tripsinizzare le cellule usando 1 mL di tripsina 1x EDTA.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare le cellule tumorali nella fase di crescita esponenziale.
   2. Determina con precisione il conteggio cellulare utilizzando un metodo di conteggio appropriato (ad esempio, emocitometro o contatore cellulare automatizzato).
   3. Prepara una sospensione cellulare contenente 1 x 10³ celle in 3 μL di mezzo ECM per animale. Utilizzare una miscela 2:1 di ECM e mezzo di coltura standard contenente 10% di FCS e altri integratori se appropriato. Aumentare il volume di sospensione e il numero di celle in base al numero di animali (ad esempio, per 10 topi, preparare 10 ×^{10 3} cellule in mezzo ECM da 30 μL).
      NOTA: Il numero di cellule iniettate deve essere calibrato con attenzione per ciascuna linea cellulare.
   4. Tieni la sospensione cellulare sul ghiaccio fino all'iniezione, per un massimo di 2 ore.

2. Procedure intraoperatorie

1. Anestesia dei topi
   1. Pesa ogni topo usando una bilancia di precisione e calcola il volume richiesto di anestetico in base al peso corporeo.
   2. Somministrare il volume calcolato dell'anestetico intraperitoneale.
      NOTA: Utilizzare un regime anestetico che copra l'intera procedura (circa 2 ore). Ad esempio: ketamina 10% (cloridrato di ketamina, 100 mg/mL; 100 mg/kg peso corporeo) combinata con Domitor (cloridrato di medetomidina, 1 mg/mL; 0,25 mg/kg peso corporeo), o un protocollo equivalente.
   3. Una volta confermata una profondità adeguata dell'anestesia, posizionare il topo su una borsa riscaldante preriscaldata (mantenuta a 37-38 °C) per supportare la termoregolazione e applicare una pomata per gli occhi per proteggere la cornea dall'essiccazione.
      NOTA: Confermare la profondità sufficiente dell'anestesia pizzicando delicatamente la zampa posteriore con la pinza. Procedere con l'intervento chirurgico solo se non si osserva alcun riflesso di astinenza.
2. Preparazione del cuoio capelluto e incisione
   1. Somministrare lidocaina preoperatoriamente per somministrare anestesia locale nel sito dell'incisione. Utilizzare una soluzione di lidocaina all'1% (5 mg/mL) e iniettare circa 0,05-0,1 mL sottocutaneamente lungo la linea di incisione prevista. Lascia almeno 2-3 minuti affinché l'anestetico faccia effetto prima di procedere con l'incisione del cuoio capelluto.
   2. Disinfetta accuratamente il cuoio capelluto usando una soluzione a base di iodio.
   3. Allunga la pelle fino a renderla tesa e fai un'incisione mediana di circa 3-4 mm lungo il cranio usando un bisturi sterile.
   4. Usando lo stesso bisturi, raschia delicatamente via il periosto per esporre la superficie del cranio.
3. Impostazione del quadro stereotatsico, identificazione delle coordinate e craniotomia
   1. Fissa la testa del mouse nel telaio stereotassico usando delle barre per le orecchie.
   2. Utilizzando il braccio stereotattico, individua il Bregma (l'intersezione delle suture coronale e sagittale del cranio), poi sposta il braccio stereotassico 2 mm anteriore e 1 mm laterale (destra) verso il sito di iniezione bersaglio nella corteccia frontale come indicato nella Figura 1B e segnalo con un marcatore chirurgico.
      NOTA: Se un vaso sanguigno è presente nel sito di iniezione previsto, la posizione può essere regolata fino a 0,5 mm per prevenire emorragie.
   3. Forare con attenzione il cranio con un trapano dentale di precisione, facendo attenzione a non penetrare la dura madre.
   4. Conferma l'apertura sondando delicatamente con una pinza sterile per sentire la percezione della rottura.
4. Iniezione di cellule tumorali
   NOTA: Lavora rapidamente durante questo passaggio, poiché l'ECM inizia a solidificarsi a temperatura ambiente, il che può interferire con la precisione e la consistenza dell'iniezione.
   1. Sospendi accuratamente la sospensione delle cellule tumorali pipettando su e giù per garantire una distribuzione uniforme.
      NOTA: Evitare il vortice per prevenire la formazione di bolle d'aria.
   2. Carica 3 μL della sospensione della cella in una siringa Hamilton da 10 μL e posizionala nel telaio stereotattico usando il supporto appropriato.
   3. Posiziona con cura l'ago della siringa sopra il foro della bava.
      NOTA: Assicurati che la smussatura dell'ago sia rivolta verso sinistra per aumentare la riproducibilità durante l'iniezione.
   4. Inserisci l'ago verticalmente nel tessuto cerebrale fino a una profondità di 3,5 mm. Una volta raggiunta questa profondità, si ritira lentamente l'ago di 0,5 mm per aiutare a prevenire il reflusso della sospensione cellulare durante e dopo l'iniezione.
   5. Iniettare lentamente i 3 μL di sospensione delle cellule tumorali per un periodo di 1 minuto. Dopo aver somministrato l'intero volume, tieni l'ago in posizione per altri 2 minuti per permettere alle cellule e all'ECM di stabilizzarsi, riducendo al minimo il rischio di reflusso.
   6. Ritira con attenzione la siringa e togli il topo dal telaio stereotattico.
5. Suture e recupero dall'anestesia
   1. Risciacquare delicatamente il cranio con una soluzione sterile di NaCl allo 0,9%.
   2. Asciuga e sigilla il foro della bava usando cera ossea.
   3. Chiudi l'incisione del cuoio capelluto usando 3-4 suture, assicurandoti che ogni punto sia legato con tre nodi stretti posizionati vicino ai bordi della ferita per una corretta guarigione.
   4. Segna le orecchie del topo con un motivo appropriato per i punzoni per le orecchie corrispondente al numero di identificazione designato.
   5. Riapplicare la pomata per gli occhi se necessario per evitare la secchezza corneale durante il recupero. Immediatamente dopo, riportare il topo a una borsa riscaldante preriscaldata (mantenuta a 37-38 °C) per supportare la termoregolazione e facilitare un recupero fluido dall'anestesia.
      NOTA: Si raccomanda di ospitare i topi individualmente durante il recupero per prevenire ferite dovute alle interazioni tra animali svegli e in fase di recupero.
   6. Pulisci e disinfetta accuratamente la siringa Hamilton risciacquando ago e barile tre volte consecutivamente: prima con acqua distillata, poi con etanolo al 70% e infine con una soluzione sterile di NaCl allo 0,9%.
   7. Dopo la pulizia, conserva la siringa Hamilton sul ghiaccio fino al prossimo utilizzo.

3. Procedure post-operatorie

1. Analgesia postoperatoria
   1. Somministrare analgesici sottocutaneamente mentre il topo è ancora sotto anestesia per garantire un immediato sollievo dal dolore post-operatorio.
      NOTA: Utilizzare analgesici adatti a questo tipo di procedura. Ad esempio, Carprofen a 10 mg/kg di peso corporeo.
   2. Una volta che il topo è completamente sveglio e ha riacquistato la normale funzione motoria, trasferiscilo in una gabbia pulita con biancheria fresca. Monitora brevemente l'animale per il comportamento normale e i modelli respiratori.
   3. Dopo il recupero completo, somministrare analgesia potabile con acqua potabile (ad esempio, metamizolo a 200 mg/kg di peso corporeo) per almeno 24 ore dopo l'intervento.
      NOTA: Per favorire l'assunzione di acqua, dolcifica l'acqua potabile con lo 0,5% di saccarosio. Avvolgi le bottiglie in carta stagnola per proteggere la soluzione dalla luce e sostituisci le bottiglie ogni giorno. Etichetta ogni bottiglia per monitorare l'assunzione di analgesici. Se gli analgesici non vengono assumiti con acqua potabile o se si osservano segni di dolore, somministrare Carprofene (10 mg/kg di peso corporeo) sottocutaneamente ogni 12 ore fino al completo recupero.
2. Monitoraggio dei topi
   1. Monitorare attentamente tutti i topi ogni 24 ore durante le prime 48 ore dopo l'intervento, valutando la funzione motoria e il comportamento. Dal terzo giorno in poi, monitora i topi almeno ogni 3 giorni, comprese le misurazioni del peso corporeo.
   2. Se vengono osservati segni di disagio o comportamenti anomali (ad esempio, attività motoria compromessa, comportamenti insoliti), eseguire il Test del Filo Sospeso, come descritto in precedenza. Se il topo supera il test, continua a monitorare e ripeti il test a giorni alterni.
   3. Eutanasiare immediatamente i topi (vedi Sezione 3.4) dopo aver raggiunto uno degli obiettivi umani predefiniti: perdita di peso > 20% rispetto al peso corporeo iniziale (giorno 0), mancato superamento del test del filo sospeso o disagio moderato sostenuto fino a 48 ore.
3. Trattamento terapeutico (opzionale)
   1. Dopo il completo recupero post-operatorio, può essere avviato un regime terapeutico a seconda del disegno sperimentale. Se questo è il caso, definire chiaramente il momento dell'inizio del trattamento nel protocollo dello studio e adattare il piano di monitoraggio per riflettere gli effetti attesi e i potenziali effetti collaterali dell'intervento terapeutico.
      NOTA: Il trattamento non dovrebbe iniziare finché gli animali non mostrano un comportamento normale, peso stabile e nessun segno di disagio post-operatorio.
4. Eutanasia e raccolta dei tessuti
   NOTA: I topi devono essere eutanasiati immediatamente dopo aver raggiunto obiettivi umani predefiniti o in punti temporali sperimentali designati, come richiesto dagli obiettivi specifici della ricerca.
   1. Anestesiare il topo utilizzando un metodo appropriato (vedi passo 2.1.2).
   2. Aprire la cavità toracica ed eseguire la perfusione transcardica con 10-20 mL di NaCl sterile gelato al 0,9%, seguiti da 10-20 mL di paraformaldeide (PFA) gelido al 4%.
      NOTA: Se è necessario tessuto fresco per applicazioni a valle (ad esempio, isolamento di RNA o FACS), ometti la fase di perfusione PFA.
   3. Raccogli il cervello e altri organi di interesse.
      NOTA: Gli organi possono essere congelati a secco in azoto liquido, fissati in formalina per il trattamento del FFPE o utilizzati direttamente per analisi a valle.
5. Analisi post-mortem strutturata
   NOTA: Per confermare la crescita metastatica e caratterizzare le caratteristiche istopatologiche associate, l'analisi post-mortem del tessuto cerebrale deve essere eseguita utilizzando sia campioni nativi (fresco congelato) che fissi (FFPE).
   1. Dissezione tissutale
      1. Dissezionare il cervello al livello del sito di iniezione, come indicato nello schema fornito nella Figura 1C.
      2. Conservare la porzione anteriore per la lavorazione del fresco congelato (FF). Dividere questa porzione in emisferi iniettati (i.) e non iniettati (n.i.).
      3. Conservare la porzione centrale per la fissazione della formalina e l'incorporamento della paraffina (FFPE).
      4. Scartare la porzione posteriore, inclusi cervelletto e tronco encefalico.
   2. Elaborazione del campione
      1. Congelare bruscamente la porzione anteriore in azoto liquido e conservare i campioni di FF a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
      2. Fissare la porzione centrale in 5-7 mL di PFA al 4% a temperatura ambiente per 48 ore prima della lavorazione del FFPE.
         NOTA: La fissazione del PFA deve essere effettuata in una cappa chimica indossando DPI appropriati per evitare l'esposizione a fumi tossici.
   3. Quantificazione del carico metastatico (campioni FF)
      1. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit o protocollo di estrazione appropriato, ottimizzato per il tessuto cerebrale.
         NOTA: L'isolamento dell'RNA deve essere eseguito in un armadietto di sicurezza biologica utilizzando DPI appropriati per prevenire contaminazioni e esposizioni a reagenti pericolosi.
      2. Esegui una PCR quantitativa (qPCR) utilizzando un marcatore specifico per cellule tumorali, come Ck8.
         NOTA: Ulteriori bersagli (ad esempio, marcatori immunitari o stromali) possono essere valutati selezionando marcatori genici appropriati. Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) può essere utilizzato come alternativa per l'analisi a livello di trascrittoma.
      3. Calcola il carico tumorale relativo normalizzando il gene di interesse (GOI, ad esempio Ck8) a un gene di mantenimento (HK).
   4. Analisi istologica (campioni FFPE)
      1. Inserire tessuto fissato con formalina nella paraffina.
      2. Tagliare i campioni in fette spesse 3 μm utilizzando un microtomo.
         NOTA: L'uso dei microtomi deve essere eseguito da personale addestrato con DPI appropriati, utilizzando la protezione della lama quando non si taglia e smaltendo le lame in contenitori per taglienti per garantire la sicurezza.
      3. Eseguire la colorazione standard di Ematossilina ed Eosina (H&E) e immunoistochimica (IHC) utilizzando anticorpi rilevanti, come Ck8 (cellule tumorali), Cd3 (cellule T), Iba1 (microglia/macrofagi) e Gfap (astrociti).
         NOTA: Le procedure H&E e IHC devono essere eseguite in un'area ben ventilata o in una cappa per garantire la sicurezza e prevenire l'esposizione a sostanze chimiche.
      4. Scansiona digitalmente tutte le diapositive colorate utilizzando uno scanner ad alta risoluzione per creare una libreria digitale di tessuti.
      5. Valutare il modello di crescita istologico (HGP) della metastasi cerebrale seguendo il protocollo^{pubblicato 10,12}.

Risultati

Il protocollo di iniezione stereotassica (Figura 1) può essere applicato sia a modelli di topo singeneici che a quelli xenoinnesti, inclusi ceppi di tipo selvatico o geneticamente modificati, a seconda della questione scientifica. Può essere utilizzata qualsiasi linea cellulare adatta in grado di crescere nel cervello. Esempi di linee cellulari tumorali murine in grado di colonizzare il cervello includono, ma non si limitano a, le cellule tumorali al seno 4T1 e 410.4, le cellule tumorali colorettali CMT93 e la linea cellulare del melanoma B16-F10. Il tempo necessario alle cellule tumorali per stabilire metastasi nel cervello varia a seconda della linea cellulare, da pochi giorni a diverse settimane, e anche la penetranza è variabile. Raccomandiamo di utilizzare un modello con penetranza ~70%, il che significa che almeno 7 su 10 animali sviluppano metastasi entro un periodo sperimentale massimo di 20 settimane (Figura 2A). Ogni linea cellulare dovrebbe essere ottimizzata individualmente e il numero di cellule iniettate dovrebbe essere accuratamente titolato.

Ad esempio, abbiamo confrontato due modelli sintetici di metastasi cerebrale per il cancro al seno strettamente correlati: 410.4 e il suo derivato 4T1. Nonostante la loro somiglianza^{genetica 17}, queste linee cellulari mostrano comportamenti metastatici e modelli di crescita nel cervello marcatamente^{diversi 16}. Sebbene entrambi raggiungano un carico metastatico simile (Figura 2B), ciascuno presenta un corso temporale unico (Figura 2C) e HGP chiaramente distinti (Figura 2D). Per valutare e confrontare sistematicamente l'efficienza della colonizzazione tra le diverse linee cellulari, abbiamo sviluppato l'Indice di Colonizzazione, una formula matematica che integra il numero di cellule iniettate, il tempo mediano di sopravvivenza e il successo della colonizzazione (Figura 2E-G).

Quando si effettua per la prima volta l'iniezione stereotassica o si testa una nuova linea cellulare, è essenziale valutare attentamente i modelli di crescita e confrontare gli esiti tra animali, interventi chirurgici e sperimentatori per garantirne la riproducibilità. Un passaggio cruciale è l'iniezione delle cellule tumorali, durante la quale può verificarsi la perdita della sospensione cellulare. Ciò può portare a una localizzazione tumorale fuorviante, in particolare la semina iatrogenica delle cellule tumorali sul cranio e/o sulle meningi, portando potenzialmente a metastasi meningea falsamente positiva che non rappresenta una vera colonizzazione intracerebrale con successiva diffusione meningea secondaria. Questi scenari sono illustrati nella Figura 3.

Figura 1: Procedure pre-, intra- e post-operatorie per l'iniezione stereotassica intracorticale di cellule tumorali nei topi. Panoramica schematica della procedura. (A) La fase preoperatoria include l'acclimatazione animale, la valutazione della salute, la preparazione del sito chirurgico e la sospensione delle cellule tumorali. (B) La fase intraoperatoria prevede l'induzione dell'anestesia, incisione del cuoio capelluto, posizionamento nel quadro stereotattico, craniotomia precisa, iniezione di cellule tumorali nella corteccia cerebrale tramite coordinate stereotattiche, chiusura della ferita e recupero dall'anestesia. (C) La fase post-operatoria comprende la somministrazione di analgesici, il monitoraggio di routine per valutare il recupero post-chirurgico, lo stato generale di salute e lo sviluppo dei sintomi neurologici (Test del Filo Sospeso), seguita da eutanasia e prelievo di organi. È inclusa un'analisi post-mortem strutturata per valutare il carico metastatico nel tessuto fresco congelato (FF) tramite qPCR e per valutare i modelli di crescita istologica nei campioni FFPE da una libreria digitale di vetrine. Le principali fasi procedurali sono illustrate in modo sequenziale per enfatizzare i tempi e il flusso di lavoro chirurgico. Immagine creata in BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi della crescita metastatica nei modelli murini di metastasi cerebrale dopo iniezione stereotattica di cellule tumorali 4T1 e 410.4. (A) Immagini macroscopiche che mostrano l'assenza di crescita tumorale nei topi Balb/C di controllo iniettati con ECM (Control) e la presenza di lesioni metastatiche visibili nei topi iniettati con sospensioni di cellule tumorali ECM (Met). (B) Quantificazione del carico metastatico nei topi di controllo iniettati con ECM (CTRL) e nei topi con metastasi cerebrali derivate da cellule di cancro al seno 4T1 e 410.4. Il carico metastatico è stato valutato tramite qPCR utilizzando Ck8 come marcatore tumorale, con Gapdh e Pgk1 come geni di mantenimento (HK). I dati sono presentati come valori medi con singoli punti dati. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett (n = 5; ****P < 0,0001). (C) Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier che confrontano la sopravvivenza complessiva (OS) di topi iniettati stereotaticamente con solo ECM (controllo, nero), 4T1 (arancione) o 410,4 (blu). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test del rango logaritmico (Mantel-Cox) (4T1 vs 410,4; n = 10; ***P < 0,001). (D) Immagini istologiche rappresentative delle metastasi cerebrali derivate da cellule 4T1 e 410.4, che illustrano differenze nei modelli di crescita, inclusi rispettivamente HGP epiteliali infiltrativi a catena e filamento. Le sezioni tissutali sono state colorate con un anticorpo anti-citocheratina 8. (E) Analisi comparativa dell'efficienza della colonizzazione utilizzando l'Indice di Colonizzazione (CI). Sono mostrati i valori di IC 4T1 (arancione) e 410,4 (blu). (F) Formula usata per calcolare l'IC. (G) Tabella che riassume i parametri inclusi nell'IC per entrambi i modelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi rappresentativi di risultati di iniezione stereotattica riusciti e subottimali. (A,C) Immagini macroscopiche che mostrano crescita metastatica in diverse località: (A) crescita tumorale nel cranio e meningi dovute a un'iniezione e perdita errata di cellule tumorali, e (C) metastasi parenchimale riuscita dopo una corretta iniezione intracorticale. (B,D) Sezioni istologiche corrispondenti che confermano (B) la crescita tumorale intrameningea con successiva infiltrazione nel parenchima cerebrale e (D) la diffusione secondaria alle meningi da una metastasi parenchimale già stabilita. Le sezioni tissutali sono state colorate con un anticorpo anti-citocheratina 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La tecnica di iniezione intracranica stereotattica consente la somministrazione precisa e localizzata di cellule tumorali o miscele cellulari direttamente nella corteccia cerebrale dei topi sperimentali. Se combinato con un'analisi post-mortem strutturata, questo modello è particolarmente utile per studiare le fasi avanzate della metastasi cerebrale, inclusa la crescita metastatica, la diffusione secondaria intraorganica e la possibile causa di decesso. Al contrario, i metodi di iniezione sistemica (ad esempio, vena caudale o iniezione intracardiaca) sono più adatti a indagare le prime fasi della cascata metastatica, come la sopravvivenza delle cellule tumorali nella circolazione, l'estravasazione e la semina in organi distanti. Tuttavia, questi approcci non sono specifici del cervello e tipicamente portano a tassi bassi e incoerenti di colonizzazione^cerebrale 18,19,20.

I modelli sistemici mostrano anche un'elevata variabilità biologica, in particolare per quanto riguarda le regioni cerebrali interessate, rendendo gli studi terapeutici difficili e richiedendo grandi coorti animali. Inoltre, gli animali spesso sviluppano metastasi extracraniche, che possono portare all'interruzione precoce dello studio¹⁹. Queste limitazioni ne riducono significativamente l'utilità nello studio delle metastasi cerebrali in fase avanzata. Inoltre, la diffusione secondaria e la ricolonizzazione sono particolarmente difficili da indagare utilizzando modelli sistemici, poiché distinguere tra diffusione primaria (originata dal tumore primario) e diffusione secondaria (derivante da metastasi già stabilita) è quasi impossibile. Inoltre, un'analisi post-mortem strutturata, specialmente per valutare la crescita macro-metastatica e gli HGP delle metastasi cerebrali, è limitata in questi contesti.

Rispetto ai sistemi ex vivo, come gli organoidi derivati dal paziente (PDO) e le co-colture organotipiche a fette^{cerebrali 21,22,23,24}, l'iniezione stereotatsistica offre diversi vantaggi critici. Sebbene i modelli ex vivo preservino aspetti dell'architettura cerebrale nativa e possano includere cellule immunitarie residenti e infiltrate di pazienti o donatori, mancano di vascolarizzazione, segnalazione sistemica e della piena complessità del microambiente tumorale in vivo, in particolare dell'ulteriore infiltrazione di cellule T o altre cellule immunitarie derivate dal midollo osseo^{o sanguigno 23}. Queste limitazioni ne limitano l'applicazione a studi a breve termine e contesti semplificati, come lo screening farmacologico o i test di interazione metastatica base. Al contrario, l'approccio stereotassico supporta studi a lungo termine sulla progressione tumorale, la risposta immunitaria e l'intervento terapeutico all'interno di un organismo vivente e intatto. È importante sottolineare che la valutazione dei sintomi neurologici come endpoint umano consente una misura clinicamente rilevante dell'inizio macro-metastatico. Questo rende il modello ancora più riflessivo del corso delle malattie umane, particolarmente prezioso nella ricerca traslazionale. Sebbene preveda l'uso di animali, sollevando considerazioni etiche affrontate dall'adesione alle 3R (Sostituzione, Riduzione e Raffinatezza), questo modello attualmente non può essere completamente sostituito da alternative ex vivo. La sua capacità di replicare l'intero contesto fisiologico delle metastasi cerebrali lo rende indispensabile per far avanzare la nostra comprensione della dinamica metastatica e della fisiopatologia specifica del SNC.

Nonostante i suoi numerosi vantaggi, il modello di iniezione stereotattica presenta alcune limitazioni che vanno considerate. Una preoccupazione chiave è la possibile perdita della sospensione delle cellule tumorali durante l'iniezione, che può causare modelli di crescita fuorvianti. In particolare, l'adesione non intenzionale delle cellule tumorali alle meningi può portare a metastasi meningea^{iatrogenica 8}, che non riflette accuratamente il naturale decorso della diffusione metastatica in questa particolare linea cellulare. Per garantire l'affidabilità dei dati, i modelli di crescita di una data linea cellulare tumorale dovrebbero essere confrontati in modo coerente tra animali, procedure chirurgiche e sperimentatori. Per minimizzare la perdita di cellule tumorali, proponiamo di utilizzare la matrice extracellulare (ECM), poiché la sua consistenza simile a un gel e la capacità di solidificarsi a temperatura corporea la rendono uno strumento utile. Tuttavia, l'ECM presenta anche delle sfide, tra cui la necessità di una gestione rapida durante l'iniezione per prevenire una solidificazione prematura. Un'altra considerazione nel nostro protocollo è che le cellule tumorali vengono iniettate in una miscela di ECM e substrati contenenti siero. Sebbene la FBS migliori l'ingrazione delle cellule tumorali fornendo nutrienti tipicamente limitati nel cervello, può anche favorire l'infiammazione. Se questo è un problema, come alternative possono essere usati mezzi senza siero o soluzioni saline bilanciate (ad esempio HBSS o PBS).

Inoltre, l'iniezione stereotassica è tecnicamente più impegnativa rispetto ad altri metodi, come l'iniezione endovenosa (i.v.). Richiede un addestramento specifico per garantire la riproducibilità, e la procedura richiede molto più tempo, richiedendo tipicamente 15-30 minuti per animale rispetto ai 3-5 minuti per le iniezioni endovenose. Questa durata più lunga limita il numero di animali che possono essere processati per sessione, il che può rappresentare una sfida per studi terapeutici che richiedono grandi coorti per raggiungere la potenza statistica. Tuttavia, questa limitazione può essere efficacemente affrontata distribuendo le iniezioni su più giorni, il che non solo aumenta la flessibilità e la fattibilità sperimentale, ma introduce anche una preziosa variabilità biologica, riflettendo differenze interindividuali più realistiche sia nel comportamento delle cellule tumorali sia nella risposta dell'ospite.

Infine, è importante notare che questo modello bypassa i passaggi precedenti della cascata metastatica, come discusso in precedenza. Il modello sperimentale appropriato dovrebbe essere selezionato in base alla domanda di ricerca e alla fase specifica della metastasi studiata. Per l'indagine della colonizzazione cerebrale in stadio avanzato, l'iniezione intracorticale stereotatattica rimane il punto di riferimento ideale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinze per orecchie animali	LabArt
Bepanthen® Pomata per occhi e naso	Bayer Vital GmbH	1578675
Cera ossea	B.Braun	210434
Cotton bob	Hartmann	143213
Estratto della membrana basale di Cultrex (ECM)	B& D	3432-005-01
Disinfettante	B.Braun	107190
Punta da trapano	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Forbici per gli occhi	Hermle	501
Siringa Hamilton (10µ Volume L)	VWR	5491135
Cuscina riscaldante	Intergastro	258122
Analisi con Nase del Mouse/Barra del Dente (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Forbici per gli occhi Noyes	Hermle	545
Paur 60° Consiglio non noptore Mouse Ear Bars	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Bisturi	PFM Medical AG	17027
Pinze standard di Semkin	Hermle	710
Sutura in poliammide Seralon (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Trapano stereotassico - Jacobs Chuck - 18000 rpm	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Stereotassica senza adattatore Rat	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Siringa HDDER per 5 e 10µ I Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
TC Portaaghi Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425