Articolo metodologico

Caratterizzazione morfologica della rigenerazione anteriore in Diopatra claparedii

DOI:

10.3791/69421

⸱

13 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce un quadro focalizzato per caratterizzare il processo di rigenerazione anteriore in Diopatra claparedii, rappresentando un passo cruciale verso futuri studi rigenerativi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I policheti possiedono la capacità di rigenerare i segmenti anteriori e posteriori dopo lesioni o autoamputazioni, offrendo un sistema pratico per studiare la riparazione delle ferite e la modellazione dei tessuti. Per supportare studi comparativi e meccanicistici sulla rigenerazione degli anellidi, questo studio presenta un protocollo per indurre e caratterizzare la rigenerazione anteriore in Diopatra claparedii (D. claparedii). Il protocollo delinea i passaggi per la gestione del campione, l'immobilizzazione e l'amputazione precisa, seguiti da punti di osservazione programmati per documentare la progressione morfologica durante la rigenerazione. I D. claparedii venivano delicatamente rimossi dai loro tubi usando un bastoncino a estremità smussata e immobilizzati in cloruro di magnesio al 4% per indurre il rilassamento. L'amputazione anteriore è stata eseguita alquarto chaetiger sotto stereomicroscopio, e il processo di rigenerazione è stato monitorato nei giorni 1, 6, 15, 30 e 60 dopo l'amputazione. La procedura consente un'induzione coerente della rigenerazione anteriore e cattura caratteristiche morfologiche chiave durante la chiusura precoce della ferita, la formazione del blastema e il ripristino dei segmenti. Fornendo un flusso di lavoro riproducibile e un riferimento morfologico per D. claparedii, questo protocollo offre una base pratica che supporta future indagini volte a collegare le osservazioni morfologiche ai processi cellulari o molecolari sottostanti nella rigenerazione delle anellidi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I policheti costituiscono quasi il 65% di tutte le specie di anellidi descritte, rendendoli uno dei gruppi più diversificati di invertebratimarini 1. Una recente lista aggiornata delle specie di policheti (Annelida) ha registrato un totale di 57 specie appartenenti a 47 generi in 30 famiglie delle acque costiere malesi, con la maggior parte delle specie (53 specie) segnalate nella MalesiaPeninsulare 2. Tra queste, Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, localmente conosciuta come ruat sarung, è una delle specie di policheti commercialmente sfruttate in Malesia. Si trova prevalentemente lungo le pause fangose della costa occidentale della Malesia Peninsulare, inclusi siti come Jeram Beach, Selangor 2,3.

D. claparedii appartiene alla famiglia Onuphidae ed è un policheto sedentario che vive in tubo, noto per la sua capacità di rigenerare sia i segmenti anteriori che posteriori del corpo. Questo include componenti dei sistemi nervosi centrali eperiferici 4. Il suo piano corporeo segmentario ben definito e la pronunciata capacità rigenerativa rendono D. claparedii un modello invertebrato promettente e gestibile per studiare la rigenerazione tissutale in sistemi biologici relativamente complessi. La selezione di D. claparedii come organismo modello per gli studi sulla rigenerazione è dovuta alla sua rilevanza ecologica, al significato regionale e alle attuali lacune di conoscenza scientifica riguardanti la sua capacità rigenerativa. Questa specie è catturata commercialmente e ampiamente utilizzata come esca per la pesca in Malesia, il che indica che è ben conosciuta dalle comunità locali e non è consideratarara 2,3. Pertanto, indagare la rigenerazione in D. claparedii ha un valore pratico ed economico, poiché i risultati possono aiutare a diffondere la conoscenza scientifica agli stakeholder locali, informando al contempo strategie per sostenere la sostenibilità della popolazione attraverso una migliore comprensione dei meccanismi rigenerativi.

Inoltre, D. claparedii presenta una distribuzione geografica specifica nel Sud-est asiatico, con una rappresentazione particolarmente elevata negli ecosistemi costierimalesi. Tuttavia, la maggior parte degli studi sulla rigenerazione su policheti e altri anelidi si è concentrata su specie provenienti dalle Americhe o da altre regioni nonasiatiche 5,6. Ad esempio, la ben studiata Diopatra neapolitana (D. neapolitana), frequentemente utilizzata come specie biomarcatrice rigenerativa, ha una vasta distribuzione che si estende sul Mar Rosso, Oceano Indiano, Mar Mediterraneo e OceanoAtlantico 7. Di conseguenza, la ricerca sulla rigenerazione sugli annelidi originari del Sud-est asiatico, inclusa D. claparedii, rimane limitata.

Studi precedenti sui policheti hanno mostrato stadi distinti e riproducibili di rigenerazione, inclusa chiusura della ferita, formazione di blastema e differenziazione del tessutosegmentario 7,8. Sebbene studi a livello molecolare su D. claparedii siano già stati riportati, le indagini specificamente focalizzate sulla rigenerazione sono scarse. Inoltre, i lavori esistenti hanno principalmente enfatizzato la caratterizzazione molecolare piuttosto che i protocolli sperimentali di rigenerazione. Inoltre, D. claparedii mostra sia processi di dedifferenziazione che di redifferenziazione, riflettendo meccanismi più comparabili a quelli degli organismisuperiori 9. Questa complessità nella risposta rigenerativa evidenzia il crescente riconoscimento dei policheti come preziosi modelli intermedi, colmando efficacemente il divario tra invertebrati semplici e vertebrati complessi negli studi di rigenerazione.

Il presente studio colma questa lacuna stabilendo e ottimizzando un protocollo di rigenerazione per D. claparedii, fornendo un quadro solido per future indagini funzionali, di sviluppo e molecolari sulla rigenerazione in questa specie di policheti di importanza regionale. In particolare, questo protocollo offre un approccio affidabile per esaminare le fasi sequenziali e i meccanismi sottostanti della rigenerazione nei policheti. Ciò consente l'osservazione e la caratterizzazione sistematica dei principali processi rigenerativi, inclusa la guarigione delle ferite, la formazione di blastema e la segmentazione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichiarazione Etica

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca dell'Università Malaysia di Terengganu con il numero di approvazione UMT/JKEPH/2026/173

1. Raccolta e abituazione di D. claparedii

  1. Individuare D. claparedii nell'area di fango della zona intertidale estuarina (livello di marea media con sabbia fine media), che ne costituisce habitat naturale.
  2. Scava la parte superiore dei tubi policheti scavando delicatamente nel sedimento con una pala per evitare di danneggiarli.
  3. Conferma la presenza del verme all'interno di ogni tubo pizzicando delicatamente il tubo e controllando se ci sia movimento o resistenza.
  4. Seleziona solo esemplari con una lunghezza corporea rilassata minima di 5 cm.
    NOTA: Scegli i policheti in base alla lunghezza del corpo per ridurre i danni alla manipolazione ed evitare frammentazioni durante la pesata.
  5. Raccogli i sedimenti utilizzando una pala dagli stessi punti per mantenere la coerenza ambientale in laboratorio.
  6. Trasportare i campioni raccolti in laboratorio in contenitori portatili a temperatura ambiente. Copri i tubi con un asciugamano inumidito con acqua di mare per mantenere l'umidità e ridurre lo stress durante il trasporto.
  7. In laboratorio, separare manualmente i detriti dal sedimento, poi asciugare all'aria il materiale alla luce diretta del sole finché non è completamente asciutto e privo di umidità residua.
  8. Rimuovere o pulire qualsiasi altro organismo (ad esempio, piccoli granchi, conchiglie o sostanze estranee) per garantire che il sedimento sia libero da contaminanti.
  9. Risciacquare i tubi dei policheti con acqua di mare artificiale (ASW) per rimuovere detriti e eventuali organismi viventi attaccati alla superficie.
    NOTA: Per preparare ASW, mescola 1/4 di tazza di Sale Marino Oceanico Istantaneo in 1,9 L di acqua purificata declorata.
  10. Preparare acquari utilizzando acquari in plastica, con sedimenti dal sito originale e riempire con ASW artificiale regolato a 23-25 ppt di salinità (Figura 1). Mantieni la temperatura dell'acqua costantemente a 28 °C durante tutto il periodo di abituazione.
    NOTA: Il volume di ASW utilizzato era di 58 L, determinato in base alle dimensioni dell'acquario: 61,5 cm (L) x 32 cm (W) x 33,5 cm (H).
  11. Trasferire D. claparedii in contenitori cilindrici di plastica (7 cm di diametro, 15 cm di altezza) riempiti a metà con sedimenti, con una densità di un policheto per contenitore.
  12. Immergi completamente i contenitori in un acquario con ASW aerato. Permettete ai policheti di scavare e ristabilirsi.
  13. Nutrire i policheti con cibo per pesci di tipo affondante a una frequenza di 2-3 volte a settimana, per garantire un nutrimento continuo durante tutto il periodo di abituazione. Rimuovi regolarmente l'eccesso di cibo per prevenire accumuli, crescita fungina e contaminazione.
  14. L'abituazione è stata valutata attraverso osservazioni comportamentali, con l'esplorazione attiva (movimento del corpo) e il comportamento di ricerca del cibo (risposta agli stimoli) che indicavano un ritorno alla normale condizione fisiologica.
    NOTA: Consentire un periodo di abituazione di due settimane prima di iniziare qualsiasi procedura sperimentale, permettendo ai vermi di recuperare da stress o amputazione accidentale subita durante la raccolta.

2. Rigenerazione

  1. Seleziona Chaetiger 4 come sito standard di amputazione per garantire risultati di rigenerazione coerentie di successo 7,9.
    NOTA: La selezione del sito di amputazione al quartotrimestre si basa su risultati preliminari. Usa il segmento 10 solo se necessario, poiché si rigenera più lentamente.
  2. Prepara una soluzione anestetica con cloruro di magnesio esaidrato al 4% (peso/volume) (MgCl₂·6H₂O) in ASW (4 g MgCl₂·6H₂O in 1 L ASW).
  3. Spingi delicatamente il policheto fuori dal tubo usando un bastone smussato inserito nell'apertura anteriore.
    NOTA: Evita di danneggiare il corpo durante la rimozione.
  4. Poi immergi il policheto nella soluzione anestetica finché non è completamente rilassato e immobilizzato (circa 15 minuti).
  5. Amputare a chaetiger 4 usando un bisturi sterilizzato sotto uno stereomicroscopio, garantendo precisione e danni tissutali minimi (Figura 1).
    NOTA: Indossa sempre l'attrezzatura protettiva personale adeguata e fai attenzione a evitare tagli durante la maneggiatura con il bisturi.
  6. Riportare la porzione posteriore del verme al suo tubo originale usando la pinza, inserendo prima l'estremità anteriore per facilitare il ri-scavo naturale.
  7. Dopo questa procedura, monitorare quotidianamente i vermi per eventuali cambiamenti comportamentali e condizioni fisiche, inclusi segni di infezione, carie tissutale o mortalità.
    NOTA: Gli individui che mostravano comportamenti anomali, necrosi visibile o deterioramento progressivo sono stati considerati non riusciti nel recupero e sono stati esclusi da ulteriori analisi.
  8. Trattieni il cibo in questa fase finché la rigenerazione non progrede, poiché la zona della bocca è assente a causa dell'amputazione anteriore. Riprendere il comportamento alimentare normale una volta che la bocca si è sviluppata, circa 60 giorni dopo l'amputazione (p.a).
    NOTA: Mantenere le stesse condizioni ambientali (intervallo di salinità dell'acqua 23-25 ppt e temperatura dell'acqua costantemente a 28 °C) durante tutto il processo di rigenerazione.
  9. Cattura le immagini di policheti rigenerati con successo usando uno stereomicroscopio in determinati giorni (1, 6, 15, 30 e 60) all'anno.
  10. Monitoraggio completo della rigenerazione dopo le 60 p.a.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il processo di rigenerazione in D. claparedii veniva monitorato continuamente fino alla completa rigenerazione della testa. Il modello complessivo di rigenerazione era comparabile a quello riportato per D. neapolitana (Figura 2). La chiusura della ferita nel sito dell'amputazione è stata completata entro un giorno dall'amputazione (p.a.). Entro il 6° giorno all'anno, è stato osservato un blastema chiaramente...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli annelidi, composti da vermi segmentati che abitano ambienti marini, d'acqua dolce e terrestri, possiedono notevoli capacità rigenerative su molteplici livelli di organizzazione biologica. Questi vanno dalla riparazione cellulare e il rinnovamento delle cellule germinali alla ricrescita strutturale e, in alcuni casi, alla rigenerazione completa del corpo a partire da piccoli frammenticorporei 8,10. L'attuale protocollo si conc...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro di ricerca è stato sostenuto dal TAPE Talent and Publication Enhancement Research Grant (55269) assegnato alla SZA.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acqua di mare artificialeOceano Istantaneo
Idrometro di salinità portatile digitaleScionix
MgCl2· 6H2OSigmaM2670
Scapolo
StereomicroscopioLeica Microsystem
TeraBits Cibo Completo per PesciTetra
Pinzetta

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, D. T. Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. International Series of Monographs in Pure and Applied Biology Zoology. 50, Elsevier. (2013).
  2. Razmi Shah, R. S. B., Ibrahim, Y. S., Villalobos-Guerrero, T. F., Sato, M. Updated Checklist of Polychaete Species (Annelida) Recorded from Malaysia, with Remarks on the Research History. Biodivers. Data J. 11, e110021(2023).
  3. Idris, I., Arshad, A. Checklist of Polychaetous Annelids in Malaysia with Redescription of Two Commercially Exploited Species. Asian J. Anim. Vet. Adv. 8, 409-436 (2013).
  4. Rouse, G., Pleijel, F. Polychaetes. , Oxford University Press. (2001).
  5. Lindsay, S. M., Jackson, J. L., Forest, D. L. Morphology of Anterior Regeneration in Two Spionid Polychaete Species: Implications for Feeding Efficiency. Invertebr. Biol. 127, 65-79 (2008).
  6. Whitford, T. A., Williams, J. D. Anterior Regeneration in the Polychaete Marenzelleria viridis (Annelida: Spionidae). Invertebr. Biol. 135, 357-369 (2016).
  7. Pires, A. Studying Annelida Body Regeneration under Environmental Stress in Diopatra neapolitana. Methods Mol. Biol. 2450, 195-206 (2022).
  8. Kozin, V. V., Filippova, N. A., Kostyuchenko, R. P. Regeneration of the Nervous and Muscular System after Caudal Amputation in the Polychaete Alitta virens (Annelida: Nereididae). Russ. J. Dev. Biol. 48 (3), 198-210 (2017).
  9. Nazri, M. U. I. A., Mahmud, M. H., Saidi, B., Mat Isa, M. N., Ehsak, Z., Ross, O., Idris, I., Ismail, W. I. W. Cellular and Molecular Profiles of Anterior Nervous System Regeneration in Diopatra claparedii Grube, 1878 (Annelida, Polychaeta). Heliyon. 7 (2), e06307(2021).
  10. Bely, A. E. Early Events in Annelid Regeneration: A Cellular Perspective. Integr. Comp. Biol. 54 (4), 688-699 (2014).
  11. Górska, B., Gromisz, S., Włodarska-Kowalczuk, M. Size Assessment in Polychaete Worms-Application of Morphometric Correlations for Common North Atlantic Taxa. Limnol. Oceanogr. Methods. 17, 254-265 (2019).
  12. Qu, F., Nunnally, C., Rowe, G. T. Polychaete Annelid Biomass Size Spectra: The Effects of Hypoxia Stress. J. Mar. Sci. 983521, (2015).
  13. Galasso, H. L., Richard, M., Lefebvre, S., Aliaume, C., Callier, M. D. Body Size and Temperature Effects on Standard Metabolic Rate for Determining Metabolic Scope for Activity of the Polychaete Hediste (Nereis) diversicolor. PeerJ. 6, e5675(2018).
  14. Kostyuchenko, R. P., Kozin, V. V. Comparative Aspects of Annelid Regeneration: Towards Understanding the Mechanisms of Regeneration. Genes. 12 (8), 1148(2021).
  15. Pugliese, C., Mazza, R., Andrews, P. L., Cerra, M. C., Fiorito, G., Gattuso, A. Effect of Different Formulations of Magnesium Chloride used as Anesthetic Agents on the Performance of the Isolated Heart of Octopus vulgaris. Front. Physiol. 26 (7), 610(2016).
  16. Vervoort, M., Gazave, E. Studying Annelida Regeneration using Platynereis dumerilii. Methods Mol. Biol. 2450, 207-226 (2022).
  17. Wibowo, E. S., Atang, A., Setiyono, E., Hana, H., Simanjuntak, S. B. I., Susilo, U., Sucharitakul, P., Apriyanti, Y., Pamungkas, J. Biological Aspects of Diopatra claparedii Grube, 1878 (Onuphidae, Polychaeta) Maintained at Different Salinity Levels. Ilmu Kelaut.: Indones. J. Mar. Sci. 30 (1), 1-6 (2025).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Rigenerazione dei polichetiRigenerazione degli anellidiFormazione del blastemaRipristino dei segmentiOsservazione al stereomicroscopioChiusura della feritaProtocollo di amputazione

Articoli correlati