Un isolamento sequenziale ottimizzato di cripte e cellule stromali mesenchimali da tessuto intestinale suino

Summary

Questo studio fornisce un protocollo a passo a passo per l'isolamento sequenziale delle cripte intestinali e delle cellule stromali mesenchimali intestinali (iMSC) dal tessuto jegiunale suino. Il metodo genera monostrati enteroidi 2D e iMSC adatti per sviluppare modelli riproducibili e fisiologicamente rilevanti di co-coltura epiteliale-stromale per studiare la diafonia cellulare durante l'omeostasi intestinale e la rigenerazione.

Abstract

L'epitelio intestinale interagisce strettamente con le cellule stromali mesenchimali intestinali sottostanti (iMSC) per regolare lo sviluppo, l'omeostasi e la rigenerazione. Tuttavia, i metodi standardizzati per isolare in sequenza sia le frazioni epiteliali che quelle stromali dal tessuto suino sono limitati. Questo protocollo descrive un processo ottimizzato a passo a passo per isolare critte e iMSC dallo stesso segmento jejunale di maialini. Il metodo utilizza un buffer di dissociazione a base di etilendediamina, tetraacetico acido/ditiotreitolo (EDTA/DTT) per rilasciare cripti, seguito da una digestione collagenase/dispasi della matrice extracellulare per isolare gli iMSC. Questo approccio minimizza le variazioni spaziali nelle celle isolate. Le cripte isolate furono coltivate con successo e formarono tipici monostrati enteroidi bidimensionali (2D) espandenti su piastre rivestite di idrogel di collagene. Gli iMSC coltivati aderirono a fiaschette di coltura ed espressero marcatori stromali come il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) e il cluster di differenziazione 81 (CD81), determinati tramite immunocolorazione. Nel complesso, questo protocollo di isolamento ottimizzato produce sia cellule epiteliali che stromali dallo stesso segmento jejunale piglet, fornendo una base riproducibile per future ricerche che coinvolgono organoidi intestinali e sistemi di co-coltura iMSC per chiarire i meccanismi che controllano le interazioni epiteliali-stromali nei maiali, un modello traslazionalmente rilevante per replicare la fisiologia umana e far progredire le scienze animali.

Introduction

L'epitelio intestinale è un tessuto dinamico che subisce un continuo auto-rinnovamento e differenziazione per mantenere l'omeostasi intestinale e facilitare la rigenerazione dopo lesioni mucose ^1,2. Le cellule epiteliali intestinali hanno origine da cellule staminali intestinali (ISC) e interagiscono con diversi fattori^{microambientali} 3,4,5,6,7,8. I compartimenti subepiteliali, principalmente la lamina propria e la mucosa muscolare, sono costituiti da diverse popolazioni cellulari provenienti da diverse^{linee 9}. Tra queste popolazioni cellulari, le cellule stromali mesenchimali intestinali (iMSC), inclusi fibroblasti e miofibroblasti, producono fattori trofici e di crescita che modulano lo stemma, la proliferazione e la differenziazione degli ISC per regolare l'omeostasi epiteliale e^la rigenerazione 6,7,10,11.

Per studiare queste interazioni cellulari, studi recenti hanno sviluppato approcci innovativi per svelare possibili meccanismi d'azione che guidano la diafonia delle cellule epiteliali intestinali e delle iMSC. I sistemi di co-coltura che combinano organoidi con cellule stromali o immunitarie hanno fatto avanzare la nostra comprensione delle interazioni cellulari epiteliali-subepiteliali durante lo sviluppo, la rigenerazione, lo screening farmacologico e la modellazione delle malattie 12,13,14,15,16,17. Tuttavia, la maggior parte degli studi sulla co-coltura di organoidi ha utilizzato tessuti murini, che spesso non riescono a imitare efficacemente la fisiologia umana e i fenotipi delle malattie, limitandone la rilevanza traslazionale^{clinica 18}.

Nella maggior parte dei protocolli di isolamento intestinale murino, le cellule epiteliali e stromali vengono prelevate da segmenti tissutali separati, che possono produrre campioni che riflettono caratteristiche leggermente diverse, potenzialmente influenzando la riproducibilità negli^{esperimenti 19,20}. Attualmente, non esistono protocolli ottimizzati standardizzati per isolare cripte intestinali suine e iMSC dallo stesso campione di tessuto. Inoltre, i limiti pratici nell'ottenere campioni intestinali umani adeguati hanno portato molti ricercatori a fare affidamento su tipi cellulari disallineati provenienti da organi diversi (come gli enteroidi umani con fibroblasti cutanei) per valutare la diafonia cellulare epiteliale-mesenchimatis, potenzialmente confondendo l'interpretazione dei dati 21,22,23.

Sebbene un protocollo di biopsia intestinale umana recentemente pubblicato abbia isolato cripte e ottenuto fibroblasti tramite estensione dal tessuto residuo depostato dall'epitelio, negli suini²⁴ sono presenti approcci standardizzati comparabili. I maiali sono utilizzati come modello animale adatto per la ricerca traslazionale grazie alla loro somiglianza anatomica e fisiologica con gli esseri^umani 2,18,25,26,27,28,29. Pertanto, questo metodo presenta un protocollo di isolamento sequenziale che recupera cripte intestinali e iMSC dallo stesso segmento jegiunale suino basandosi sulla struttura fisiologica, anatomica e morfologica^{dell'intestino 4,30}. La procedura fornisce un quadro riproducibile per isolare sia cripte che iMSC adatto a futuri studi di co-coltura intestinale suina.

Protocol

Un segmento di 5 cm è stato sezionato dal jegiuno prossimale espulso di maialini di 21 giorni di vita ospitati nella struttura per i maiali dell'Università del Maryland, College Park. La procedura (R-GIUN-22-30) utilizzata per sacrificare il maialino seguiva le linee guida per le politiche di cura e uso degli animali approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'università. Prima di procedere con i passaggi di isolamento, la panoramica del protocollo è presentata nella Figura 1, e l'elenco dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per l'isolamento sequenziale delle cripte intestinali suine e degli iMSC è fornito nella Tabella dei Materiali.

1. Fase di preparazione pre-isolamento

1. Prepara 30 mL di tampone di lavaggio per ogni segmento di tessuto da 5 cm in tubi conici da 50 mL.
2. Regola il volume in base al numero di campioni di tessuto raccolti.
   NOTA: Controlla la Tabella 1 per la composizione del wash buffer. Tutti i passaggi di preparazione dei tessuti e isolamento cellulare avvengono su un banco di lavoro.

2. Fase di preparazione del tessuto intestinale

1. Inserire il tessuto intestinale espulso nei 30 mL di wash buffer in tubi conici da 50 mL.
   NOTA: I fazzoletti espulsi possono essere messi in un buffer a freddo per un'ora prima dell'uso.
2. Risciacquo il fazzoletto a 3× con un tampone di lavaggio freddo usando una siringa da 21 G per rimuovere i contenuti luminali.
3. Posizionare il tessuto su una superficie sterilizzata in schiuma di polistirene e rimuovere con cura il tessuto mesenterico e adiposo dalla serosa.
4. Dissezionare il tessuto longitudinalmente utilizzando una lama chirurgica per aprire il lumen (Figura 2A).
5. Trasferire il tessuto parzialmente pulito e dissezionato in un tampone di lavaggio fresco e lavare due volte, o finché il tampone non diventa pulito.
6. Inserire il fazzoletto nel tampone di lavaggio in una piastra di Petri da 100 mm e tagliarlo in pezzi da 10-15 mm usando una nuova lama chirurgica (Figura 2B,C). Questo passaggio aumenta la superficie esposta al buffer di digestione.
7. Trasferire il tessuto tritato in un nuovo tubo conico da 50 mL.
8. Lavare delicatamente con il tampone di lavaggio e lasciare che il tessuto tritato si depositi per gravità per circa 30 secondi (Figura 2D).
9. Aspirare delicatamente il soprantantante, lasciando solo il necessario tampone per coprire i pezzi di tessuto nel tubo conico.
10. Stadio di dissociazione epiteliale
    1. Aggiungi 30 mL di buffer di dissociazione epiteliale preriscaldato (Tabella 2) e incuba per 20-30 minuti a 37 °C in un bagno statico con perle o in un bagno d'acqua tremante a circa 9 × g.
    2. Scuotere delicatamente il tubo ogni 15 minuti per aumentare il rilascio delle cripte dalla membrana epiteliale.
    3. Lasciare che il tessuto si depositi e aspirare delicatamente il soprantantante con una pipetta sierologica, lasciando solo il necessario tampone necessario per coprire il tessuto depositato nel tubo conico.
    4. Aggiungi 30 mL di tampone fresco al tessuto sedimentato e scuoti vigorosamente per liberare villi, cripte e detriti (Figura 3A). Lascia che i residui tissutali si depositino, poi si decanta delicatamente il surnatant del wash buffer, che contiene i segmenti sospesi della cripta, attraverso uno scolpo cellulare da 100 μm in un nuovo tubo conico da 50 mL.
       1. Ripeti il processo di aggiunta di un nuovo tampone di lavaggio al tessuto residuo e decantazione tre volte (3×). Pipetta 10 μL di tampone di lavaggio contenente le cripte in una piastra di Petri da 100 mm ed esamina la densità della cripta al microscopio stereoscopico.
          NOTA: Mantenere ogni buffer di lavaggio contenente cripte dopo ogni lavaggio.
    5. Dopo il terzo lavaggio, il buffer di lavaggio contenente le cripte dovrebbe essere libero con il minimo di detriti (Figura 3B).
       NOTA: Conservare i residui del tessuto con la matrice extracellulare (ECM) nel tubo conico per il successivo processo di isolamento iMSC.
    6. Centrifuga la sospensione della cripta a 150 × g per 2 minuti a temperatura ambiente per bloccare i frammenti della cripta.
    7. Aspirare e risospendere la pellet cripta in mezzo di coltura epiteliale.
    8. Centrifugare nuovamente le cripte sospese a 150 × g per 2 minuti per raccogliere la pellet di frammenti della cripta.
    9. Aggiungere un mezzo di coltura epiteliale per sospendere le cripte e pipetta 5× usando una punta di pipetta da 1.000 μL.
    10. Seminare circa 100 cripte risospese su lastre pre-preparate di collagene tipo 1 rivestite con idrogel a 6 pozzi per coltivare ed espandere le cripte in monostrati enteroidi bidimensionali (2D).
        NOTA: Controlla la preparazione della piastra rivestita di collagene in idrogel nella Tabella 3. La concentrazione finale di collagene di tipo 1 dovrebbe essere di 1,0 mg/mL. Evitare di impiastrare cripte troppo dense o frammenti di detriti per prevenire la contaminazione da lievito o fungo. Antibiotici-antimicotici (anti-anti-anti) nel tampone di lavaggio e nel mezzo di coltura dovrebbero fornire protezione.
    11. Esaminare le cellule sotto un microscopio a contrasto di fase invertito prima di incubarle a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
    12. Sostituire il substrato di coltura entro 12 ore dopo la semina per rimuovere i detriti galleggianti e ridurre la contaminazione batterica.
    13. Coltivare gli enteroidi utilizzando un mezzo di coltura epiteliale (Tabella 4) e sostituire il mezzo a giorni alterni fino al giorno 8 circa, quando i monostrati 2D espansi raggiungono una confluenza dell'≥85% per la subcultura.
11. Stadio di dissociazione della matrice extracellulare
    NOTA: Continuare il processo di isolamento con i frammenti di tessuto residui che contengono la matrice extracellulare nel tubo conico (Figura 3C e Figura 4A).
    NOTA: Sebbene l'EDTA nel buffer di dissociazione epiteliale possa inibire l'attività della collagenasi, i tre passaggi precedenti rimuovono tutto l'EDTA e la DTT. Pertanto, l'attività della collagenasi non dovrebbe essere influenzata nel processo successivo.
    1. Trita nuovamente il tessuto rimanente in piccoli pezzi prima di procedere all'isolamento degli iMSC nella lamina propria.
    2. Aggiungere 25 mL di buffer digeritivo extracellulare (Tabella 5) al tessuto e incubare in un bagno statico di perle per 15-20 minuti a 37 °C (Figura 4B).
    3. Scuoti vigorosamente dopo l'incubazione.
       NOTA: Il surnatante diventerà torbido con meno frammenti di tessuto galleggianti. Pipetta 10 μL del sovrantante sotto un microscopio rovesciato per esaminare la densità degli iMSC nel sovrandante. Continuare a incubare il tessuto nel bagno di perle per altri 15 minuti se la densità osservata di iMSC è bassa.
    4. Scendere delicatamente il soprantantante (immediatamente dopo una scossa vigorosa nel passo 2.2.3) attraverso un filtro cellulare da 100 μm in un nuovo tubo conico per minimizzare i detriti.
    5. Centrifuga la sospensione a celle a 280 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare gli iMSC.
    6. Aspirare il soprandanante e risospendere gli iMSC nel mezzo di coltura mesenchimale (vedi il supporto di coltura iMSC nella Tabella 6).
    7. Centrifuga di nuovo gli iMSC risospesi a 280 × g per 5 minuti per lavare via il buffer di dissociazione.
    8. Aspirare e risospendere gli iMSC in un mezzo di coltura mesenchimatosa.
    9. Implacca gli iMSC in una fiaschetta di coltura T75 a circa 5 × 10⁵ cellule per fiaschetta.
       NOTA: Assicurarsi che le cellule placcate coprano circa il 60% della superficie del fiaschetto, poiché le cellule mesenchimali richiedono una densità di semina da moderata ad alta per una crescita ottimale.
    10. Sostituire il mezzo di coltura entro 12 ore dopo la placcatura per rimuovere i detriti in eccesso e prevenire la contaminazione batterica.
    11. Esaminare cellule simili a fibroblasti al microscopio a contrasto di fase invertito al secondo giorno dopo la semina.
        NOTA: Cambia il mezzo di coltura mesenchimale ogni due giorni. Gli iMSC dovrebbero raggiungere circa l'85% di confluenza ed essere pronti per la subcultura entro il quarto giorno.

3. Saggio immunocitochimico

1. Coltivare circa 5.000 iMSC per pozzo in una piastra da 96 pozzi con mezzo mesenchimale per 2-3 giorni fino a quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza.
2. Aspirare delicatamente il mezzo e risciacquare due volte gli iMSC colti con 100 μL di 1× PBS/pozzo a temperatura^{ambiente 31}. Tutti i riferimenti ai kit di immunocolorazione sono forniti nella Tabella dei Materiali.
3. Aggiungi 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per pozzo per fissare gli iMSC coltivati e incubare su un banco statico a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Lavare due volte gli iMSC fissi coltivati con 100 μL di 0,1% Tween-20/PBS (PBST) per 5 minuti ciascuno, poi permeabilizzare con 100 μL di 0,5% Triton X-100/PBS per 30 minuti.
5. Aggiungere 100 μL di albumina sieroica bovina (BSA)/PBST al 5% per pozzo per bloccare il legame aspecifico sulle cellule fissate.
   NOTA: Lascia a temperatura ambiente per 1 ora prima di lavare due volte con 100 μL di PBST per 5 minuti ciascuno.
6. Aggiungere 100 μL di anticorpi primari diluiti (1:250; cioè 1 μL di anticorpo primario in 250 μL di diluente anticorpale) in ciascun pozzo e incubare le cellule durante la notte a 4 °C. Gli anticorpi principali utilizzati sono PDGFRα e CD81.
   NOTA: Includere pozzi di controllo negativi aggiungendo solo diluente anticorpale senza anticorpi primari.
7. Il secondo giorno, lava via due volte gli anticorpi primari con 100 μL di PBST per 5 minuti ciascuno.
8. Diluire gli anticorpi secondari in 1× PBS utilizzando i seguenti rapporti: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL) e DAPI (1 μL:800 μL).
9. Controcolora le cellule con gli anticorpi secondari diluiti a temperatura ambiente per 1 ora.
10. Lava le cellule due volte con 1× PBS per 5 minuti ciascuno.
11. Aggiungi 100 μL di mezzo di montaggio per pozzo, copri la piastra di alluminio, avvolgila con carta stagnola e conserva a 4 °C fino a 6 mesi fino all'imaging fluorescente.

4. Isolamento dell'RNA e test qPCR

1. Estrarre l'mRNA totale da iMSC coltivati in fiaschette T75 utilizzando la tecnica di separazione guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio.
   NOTA: Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro.
2. Trascrive inversamente l'mRNA totale in cDNA da utilizzare come modello per il saggio quantitativo della reazione a catena della polimerasi inversa (qRT-PCR) per verificare i grafici di amplificazione per il primer selezionato del gene Sus scrofa, GAPDH (forward: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC; reverse: AAGTGTCGTTGAGGGCAATG), come riportato in studi^{precedenti 2,28}.

Results

Durante la dissociazione epiteliale, l'acido etilendediaminatetraacetico (EDTA) chela gli ioni calcio per interrompere le aderenze cellulari dipendenti dal calcio, mentre il ditiotreitolo (DTT) taglia i legami disolfuro nelle glicoproteine mucinotiche per facilitare la mucolisi. Pertanto, l'uso combinato di un composto chelante (EDTA) e di un agente riducente (DTT) consente il rilascio efficace delle criptografie dalla membrana epiteliale senza disturbare la struttura della matrice extracellulare (ECM^)<...

Discussion

Isolare cripte intestinali e iMSC dallo stesso segmento jegiunale suino offre un approccio innovativo per preservare le caratteristiche cellulari e funzionali specifiche del segmento tissutale. Questo è fondamentale perché i tessuti intestinali mostrano identità regionali e spaziali, come dimostrato in precedenti studi suini 2,36,37,38. Studi precedenti sugli ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5M EDTA	Promega	PR-V4231
Buffer HEPES 1 M	ThermoFisher	15630080	Per la preparazione delle piastre di collagene idrogel
Punte per pipette da 1000 uL	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10x PBS	Invitrogen	AM9624	Per la preparazione delle piastre di collagene idrogel
1N idrossido di sodio	Thermo	SS266-1	Per la preparazione delle piastre di collagene idrogel
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hyclone	SH30256FS
4% paraformaldeide (PFA)	ThermoFisher	AAJ61899AK
Tubi conici da 50 mL	ThermoFisher	12-565-271
Piastre a 6 pozzi	Fisherbrand	FB012927
Soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5%	Corning	MT25035CI	Per la preparazione delle piastre di collagene idrogel
DMEM Avanzato/F12	Gibco & nbsp;	12634-010
Alexa fluor plus 647	Invitrogen	A32728	Anticorpo secondario
Alexa plus 555 - A32732	Invitrogen	A32732	Anticorpo secondario
Carta stagnola	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTI	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81	Proteinintech	66866-1-ig	Anticorpo primario
Acqua di grado coltura cellulare	Hyclone	SH30529FS	Per la preparazione delle piastre di collagene idrogel
Collagene, Tipo 1	Corning	356236	Per la preparazione delle piastre di collagene idrogel
Collagenasi IV	Gibco	17104019
Piastra di Petri di Corning da 100 mm	Corning	07-202-011
Mezzo di crioconservazione per celle Cryostor	Tecnologie Stemcell	7930
Cryovial per cellule	Fisherbrand	1050026
Diluente anticorpale Dako	Dako/Agilent	Numero di parte: S302283-2	diluente anticorpale primario
Supporti di montaggio fluorescenti Dako	Dako/Agilent	Numero di parte: S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	Colorazione del DNA
Dispase II	Roche	4942078001
DMEM, glucosio alto	Corning	MT10013CV
DTT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS (HI)	Avantor	1300-500H
Gastrin	Anaspec	AS-64149
Gentamicina	MP Biomedici	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
Microscrrope fluorescente invertita	Nikon	ECLIPSE Ti2	Imaging fluorescente
Microscopio a contrasto di fase invertito	Nikon	Eclipse TS100	Per cellule coltivate imaging
Kit di sintesi cDNA avanzato iScript	Bio-Rad	1725038	Kit RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	Kit qPCR
Media condizionali LWRN	ATCC	CRL-3276	I media LWRN sono stati preparati internamente secondo la procedura ATCC
N-acetilcisteina	Biografia MP	194603
Spettrofotometro Nanodrop 2000	ThermoFisher	ND 2000
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Piastre ottiche a 384 pozzi con codice a barre	Biosistemi applicati	4483285	Kit qPCR
PDGFRα	Abcam	ab230457	Anticorpo primario
Prostaglandina E2 (PGE2)	Chimica delle Cayman & nbsp;	14010
QuantStudio 5	Biosistema applicato	A28570	Strumento qPCR
SB202190	LC Laboratories	S-1700
Microscopio stereo	Nikon	SMZ745
Fiaschetta T 75	Fisherbrand	FB012937
Triton X100	Fisherbrand	PI85111
Reagente Trizol	Invitrogen	15596026
Preadolescente, detergente 100% nonionico	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200