Method Article

EasyFiji: un'interfaccia grafica per l'elaborazione di immagini a fluorescenza facile da usare nelle Fiji

DOI:

10.3791/69441

⸱

February 20th, 2026

 , 
1Center for Bioimage Informatics, St. Jude Children's Research Hospital, 2Cell and Tissue Imaging Center, St. Jude Children's Research Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EasyFiji è un plugin di interfaccia grafica per Fiji (ImageJ) che offre una suite curata di strumenti di visualizzazione e elaborazione delle immagini fluorescenti frequentemente utilizzati dagli scienziati della vita.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) è un pacchetto di elaborazione immagini open-source esteso e estesibile ampiamente utilizzato dalla comunità di analisi di bioimmagini. Tuttavia, per gli scienziati della vita non computazionali, interagire manualmente con le numerose capacità delle Fiji richiede di imparare e navigare in un sistema di menu profondamente stratificato. Inoltre, alcuni comportamenti predefiniti di alcuni comandi non sono ideali per la visualizzazione e l'elaborazione delle immagini a fluorescenza. Per aumentare l'efficienza degli scienziati della vita che lavorano con immagini microscopiche a fluorescenza, abbiamo sviluppato EasyFiji, un plugin di interfaccia grafica (GUI) curata per le Fiji. Ogni comando EasyFiji viene eseguito tramite pulsanti e cursori potenziati da tooltip e mostra sempre un'esecuzione specifica per canale, come richiesto per le immagini a fluorescenza. I comandi che modificano l'intensità dei pixel sono inoltre impossibili a un solo clic per consentire un'elaborazione più interattiva e possono essere automaticamente registrati e salvati come testo per la conservazione dei registri. Un pannello informativo dell'immagine mostra le impostazioni fondamentali per l'interpretazione delle immagini. Sono inoltre fornite nuove funzioni di rendering dell'immagine e correzione della candeggina. Il plugin è liberamente disponibile su GitHub e come sito di aggiornamento delle Fiji. Questo protocollo delinea i passaggi per utilizzare l'interfaccia di EasyFiji per la visualizzazione e l'elaborazione delle immagini microscopiche a fluorescenza.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) è un pacchetto di elaborazione immagini open-source esteso e estesibile ampiamente utilizzato dalla comunità di analisi di bioimmagini 1,2. La vasta base di codice di algoritmi generici delle Fiji, insieme al linguaggio macro e all'interfaccia dei plugin, può essere comodamente sfruttata dagli analisti computazionali per fornire una soluzione a quasi qualsiasi problema di elaborazione o analisi delle immagini. Tuttavia, per gli utenti delle scienze della vita con poca esperienza computazionale, i >1.100 comandi di FIJI distribuiti in un menu a tendina profondamente stratificato possono risultare estremamente complessi da navigare e utilizzare efficacemente. Sono stati adottati diversi approcci per semplificare l'uso manuale delle Fiji. La barra di ricerca delle Fiji è un'alternativa alla navigazione nei menu, fornendo accesso a un'ottima documentazione di aiuto, ma solo se l'utente conosce il nome dell'algoritmo di cui ha bisogno. I pulsanti della barra degli strumenti delle Fiji possono essere personalizzati per fornire un accesso rapido ai comandi definiti dall'utente, ma questa procedura richiede la scrittura di un codice macro e la previsione di quali comandi saranno più utili. Il plugin ActionBar offre una finestra di interfaccia grafica (GUI) autonoma con array di pulsanti personalizzabili e organizzabili, ma ancora una volta, sono necessari codice ed esperienza per popolare efficacementei pulsanti 3. Nessuna di queste soluzioni soddisfa le esigenze degli scienziati della vita con poca esperienza nell'elaborazione delle immagini.

Oltre ai problemi di interfaccia utente, molti scienziati della vita che lavorano con immagini di microscopia a fluorescenza richiedono procedure di visualizzazione e di elaborazione specifiche per canale. Tuttavia, alcuni comandi Fiji comunemente utilizzati non sono canal-aware di default. Ad esempio, gli utenti possono voler rendere insieme i canali pseudo-colorati in modo ugualmente saliente, oppure per evidenziare specificamente regioni di intensità simile tra canali, o per preservare il contrasto in scala di grigi di un segnale morfologico mostrando allo stesso tempo la fluorescenza. In ciascuno di questi casi d'uso, la tecnica di rendering composito RGB delle Fiji oscura le informazioni desiderate a livello percettivo. Quando si elaborano immagini multicanale, i filtri nativi delle immagini Fiji (cioè, Process | Filtri), o processano solo il piano di bit attivo 2D oppure tutti i piani di bit nella finestra dell'immagine (cioè lo 'stack' come definito dalla classe ImageStack). Il primo comportamento non elabora attraverso la dimensione z o t per un dato canale, mentre il secondo comportamento è quasi sempre improprio, poiché ogni canale contiene un pattern di colorazione e un rapporto segnale-rumore unico, rendendo necessaria l'uso di parametri di elaborazione specifici per canale. I comandi di correzione della candeggina delle Fiji native (Immagine | Modifica | Correzione di candeggina) agiscono in modo errato quando applicate a immagini di fluorescenza multicanale, perché anche in questo caso correggono su tutto l'ImageStack, dove i dati del canale sono intercalati, invece di correggere la dimensione z o t all'interno di ogni canale individualmente.

Per affrontare questi problemi per gli scienziati della vita che lavorano con immagini di microscopia a fluorescenza, abbiamo sviluppato EasyFiji, un plugin di interfaccia grafica curata e guidata per le Fiji. EasyFiji è un insieme curato di comandi organizzati tematicamente che consentono il rendering e l'elaborazione consapevoli del canale. Quattro pannelli tabulati, Display, Process, Save e Image Info, contengono ciascuno raccolti tematici di pulsanti e cursori ottimizzati da tooltip per l'esecuzione dei comandi. Altre comodità includono una funzionalità di annullamento per l'elaborazione interattiva, un semplice registratore d'azioni in testo semplice che può salvare automaticamente azioni di modifica dei pixel insieme a un'immagine, e una visualizzazione formattata delle impostazioni di acquisizione importanti per l'interpretazione dell'immagine. EasyFiji offre anche nuovi strumenti per il rendering delle immagini e la correzione della candeggina. EasyFiji non supporta l'analisi quantitativa delle immagini o le funzioni di elaborazione batch, poiché queste procedure dovrebbero essere eseguite solo con l'aiuto di un analista esperto di bioimmagini. Sebbene EasyFiji sia conciso per natura, tutti i comandi nativi Fiji sono sempre disponibili tramite il sistema di menu nativo Fiji. Crediamo che il design di EasyFiji, rivolto alpubblico 4 , aumenterà l'uso delle Fiji tra gli scienziati della vita. Qui presentiamo il design, l'implementazione e l'applicazione di EasyFiji alle immagini di microscopia a fluorescenza. Il plugin è facile da installare tramite un sito di aggiornamento Fiji (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ e https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), mentre il codice open source può essere scaricato tramite GitHub; Il plugin e il codice sorgente sono liberamente disponibili (https://github.com/stjude/EasyFiji).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive come installare e utilizzare EasyFiji.

1. Per installare EasyFiji...

  1. Scarica l'ultima versione di Fiji (>1.54g) adatta al sistema operativo e installala in una cartella a cui l'utente ha accesso per lettura/scrittura (vedi la Tabella dei Materiali per un link al sito di download delle Fiji).
  2. Lancia Fiji e naviga su Aiuto | Aggiornamento... nella barra del menu.
  3. Nella finestra Aggiornatore , clicca su Gestisci siti di aggiornamento. Seleziona EasyFiji dalla lista e clicca su Applica e Chiudi. EasyFiji sarà installato automaticamente, e Fiji sarà aggiornata automaticamente con le future versioni di EasyFiji.
  4. Riavvia Fiji. Seleziona EasyFiji dal menu Fiji Plugins.
    NOTA: EasyFiji è pienamente compatibile con molte versioni più vecchie di Fiji ed è principalmente compatibile con ImageJ. Informazioni dettagliate sulla compatibilità e sulle dipendenze si trovano sulla pagina wiki di EasyFiji su GitHub (https://github.com/stjude/EasyFiji) e sulla pagina wiki di EasyFiji ImageJ.net (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). I feedback possono essere forniti tramite la pagina GitHub o il thread EasyFiji sul forum Image.sc (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) (vedi Tabella dei Materiali per i link a queste risorse).

2. Utilizzo del pannello display di EasyFiji

NOTA: Come mostrato nella Figura 1A, il pannello di visualizzazione supporta la pseudo-colorazione dei canali di fluorescenza utilizzando pulsanti di campione di colore, controlli intuitivi di regolazione del contrasto e nuove opzioni per rendering d'immagine multicanale calibrati percettivamente. Sono inclusi anche comandi nativi delle Fiji per la proiezione e il re-slicing di immagini 3D/4D. La Tabella 1 documenta la corrispondenza tra i comandi EasyFiji e i comandi nativi Fiji.

  1. Imposta il colore o la visibilità di un canale (Display Panel, sezione Colore del canale ).
    1. Seleziona il canale desiderato usando il cursore del canale della finestra dell'immagine.
    2. Premi un pulsante di campione colore per assegnare una nuova tabella di ricerca colore (LUT).
    3. Premi il pulsante nero per spegnere il display di un canale.
    4. Premi il pulsante AllChs per visualizzare tutti i canali insieme contemporaneamente.
    5. Premi il pulsante EachCh per visualizzare ogni canale in sequenza, scorrendo il cursore del canale nella finestra dell'immagine .
  2. Imposta il contrasto del canale all'interno o tra le immagini (Display Panel, sezione Contrasto Canale ).
    1. Per modificare l'intervallo di visualizzazione di un canale (contrasto), seleziona il canale usando il cursore del canale in basso nella finestra dell'immagine dell'immagine.
    2. Sposta il cursore per il guadagno di visualizzazione per specificare l'intensità del pixel dell'immagine (valore mostrato a destra) da mostrare come il valore più luminoso sullo schermo.
      NOTA: Usiamo il termine guadagno di visualizzazione per descrivere questa azione perché fa sì che il canale diventi linearmente più luminoso, analogo all'effetto di cambiare il guadagno su un rivelatore durante l'acquisizione dell'immagine.
    3. Premi il pulsante di reset del guadagno del display per visualizzare l'intensità massima possibile dei pixel del canale (determinata dalla sua profondità di bit) come il valore più luminoso sullo schermo.
    4. Sposta il cursore per lo spostamento del display per specificare l'intensità del pixel dell'immagine (valore mostrato a destra) da mostrare come il valore più scuro sullo schermo.
      NOTA: Abbiamo usato il termine display offset per descrivere questa azione perché imposta il livello di nero dell'immagine, analogo all'effetto di impostare lo offset su un rivelatore durante l'acquisizione dell'immagine.
    5. Premi il pulsante di reset dello spostamento del display per impostare l'intensità del pixel dell'immagine da zero al valore più scuro sullo schermo.
    6. Premi il pulsante AutoCh per regolare automaticamente il guadagno e lo offset del display.
    7. Premi il pulsante AutoAll per regolare automaticamente il guadagno e l'offset di visualizzazione per tutti i canali.
    8. Premi il pulsante Propaga per trasferire le impostazioni di guadagno e offset di visualizzazione dall'immagine attiva a tutte le altre immagini aperte che contengono lo stesso numero di canali.
  3. Crea un display multicanale (Display Panel, sezione Channel Views ).
    1. Per renderizzare due canali di fluorescenza insieme come un'immagine a colori, si usano i pulsanti con prefisso FF (fluorescenza con fluorescenza). Per renderizzare insieme un canale di fluorescenza e un canale morfologico in scala di grigi come immagine a colori, si utilizza il pulsante con prefisso FG (fluorescenza con scala di grigi). I rendering vengono creati in una nuova finestra dell'immagine.
      NOTA: Prima di creare qualsiasi Vista Canale, si regola prima il guadagno e l'offset di visualizzazione per ogni canale in modo che il segnale di interesse copra la gamma dinamica del display (sezione 2.2) e poi applica questi guadagni e offset utilizzando i pulsanti Applica Guadagno e Offset nella scheda Elaborazione (sezione 3.2.3). I rendering saranno non ottimali se i guadagni e gli offset non vengono regolati e applicati.
    2. Premi il pulsante FFColoc per produrre una resa dei colori da due canali di fluorescenza che evidenzia come pixel gialli dove l'intensità è simile in entrambi i canali (entro il 25%).
      NOTA: I pixel con intensità dissimili tra i canali sono resi in scala di grigi. I pixel gialli suggeriscono una localizzazione basata sullacorrelazione 5 quando il segnale di interesse su ciascun canale copre l'intervallo dinamico del display.
      ATTENZIONE: Il rendering FFColoc è destinato esclusivamente all'esplorazione o all'illustrazione dei dati. Non è un sostituto della quantificazione rigorosa della localizzazione con l'aiuto di un esperto.
    3. Premi il pulsante FFMerge per produrre una resa dei colori da due canali di fluorescenza, dove il segnale in ciascun canale è ugualmente percettibile.
      NOTA: A ogni pixel, la luminanza è impostata in base al segnale con l'intensità più alta, mentre la tonalità è funzione del rapporto tra le intensità tra i canali (seguendo i concetti descritti da Taylor et al.6). Vedi anche la sezione Discussione.
    4. Premi il pulsante FGMerge per ottenere una resa dei colori dai canali di fluorescenza e da un canale in scala di grigi, dove la colorazione dei canali di fluorescenza viene mantenuta, mentre il contrasto del canale in scala di grigi viene mantenuto.
      NOTA: Il canale in scala di grigi è tipicamente una modalità non fluorescente che contiene informazioni morfologiche, come DIC, contrasto di fase o microscopia elettronica.
    5. Premi il pulsante Montaggio per suddividere i canali in singole immagini, posizionarli automaticamente sullo schermo e sincronizzarne la visualizzazione.
    6. Premi il pulsante SyncWins per sincronizzare la visualizzazione di più immagini dello stesso tipo.
  4. Crea viste 2D di uno stack 3D z o t (Display Panel, sezione Stack Views ).
    NOTA: Ogni rendering viene visualizzato in una nuova finestra dell'immagine.
    1. Premi il pulsante MIP per creare una proiezione di massima intensità.
      NOTA: L'intensità in ciascuna posizione nell'immagine 2D risultante corrisponde all'intensità del pixel più intenso lungo laterza dimensione nell'immagine 3D. Questa procedura può accentuare il rumore, quindi può essere utile per smussare lo stack (vedi scheda Processing ) prima di creare un MIP.
    2. Premi il pulsante SIP per creare una proiezione di intensità somma.
      NOTA: L'intensità in ciascuna posizione nell'immagine 2D risultante corrisponde alla somma delle intensità lungo laterza dimensione nell'immagine 3D. Questa procedura preserva l'intensità totale, risultando in un'immagine meno rumorosa rispetto a qualsiasi singola fette.
    3. Premi il pulsante Ortho per creare un visualizzatore di fette ortogonali, che renderizza interattivamente i tre piani ortogonali di uno stack 3D (ad esempio xy, xz, yz) che si intersecano nella posizione attuale del cursore.
    4. Premi il pulsante Kymo per creare un kymograph.
      NOTA: Un kymograph è un'immagine 2D in cui l'asse verticale (y-) corrisponde alla terza dimensione di uno stack (di solito t-), e l'asse orizzontale (x-) corrisponde alla posizione lungo una linea tracciata dall'utente sullo stack di input. Quando laterza dimensione è il tempo, si usa un kimografo per illustrare o quantificare il movimento.
      Questo pulsante si basa sul plugin7 di KymographBuilder che viene fornito con Fiji ma deve essere scaricato separatamente se si utilizza ImageJ.
  5. Imposta opzioni varie (Pannello di visualizzazione ).
    1. Premi il pulsante Dup per duplicare la finestra dell'immagine attiva all'interno di Fiji. Apparirà una nuova finestra di immagine.
      NOTA: Disegna una regione rettangolare di interesse (ROI) sull'immagine usando lo strumento Rectangle ROI di Fiji, e il pulsante Dup ritaglia al confine ROI. Specificare i range di canali, z- e/o t- per rimodellare la dimensionalità dell'immagine duplicata.
    2. Premi il pulsante ToClip per copiare l'immagine attiva come attualmente mostrata sullo schermo sulla cartella di sistema. Per incollare l'immagine in un'altra applicazione (per preparare diapositive o modificare foto), attiva l'altra applicazione e seleziona incolla (Ctrl+V su Windows o Cmd+V su Mac).
    3. Premi il pulsante |--um--| per visualizzare una barra di scala sull'immagine come sovrapposizione. Attiva il pulsante |--um--| per rimuovere la barra della bilancia.

3. Utilizzo del pannello EasyFiji Process

NOTA: Come mostrato nella Figura 1B, la sezione Caratteristiche del Canale del pannello di Processo fornisce comandi di elaborazione immagini basati su cursori con tooltip che possono essere utilizzati per migliorare la visualizzazione dell'immagine. Il pulsante Annulla l'ultimo consente un'elaborazione interattiva. Le dimensioni dell'immagine possono essere modificate usando i pulsanti Modifica Dimensioni. La Tabella delle Azioni viene utilizzata per registrare come testo semplice comandi di elaborazione che modificano i valori di intensità dei pixel dell'immagine. Il log può quindi essere salvato automaticamente con l'immagine usando lo stesso titolo (vedi pannello Salva).

  1. Modifica le caratteristiche spaziali di un'immagine (Pannello di Processo , sezione Modifica Caratteristiche del Canale ).
    NOTA: Tutti i comandi si applicano solo al canale attivo e i risultati sono automaticamente mostrati nella finestra originale dell'immagine. Non viene creata una nuova finestra di immagine.
    1. Sposta il cursore Smooth per applicare una sfocatura gaussiana, riducendo così la variazione normalmente distribuita da pixel a pixel (~rumore di colpo e rumore di lettura).
      1. Per immagini campionate ~Nyquist (70-150 nm dimensione xy pixel), inizia con valori slider tra 1.0 e 2.0.
      2. Per una data dimensione di pixel, aumenta il valore dello slider man mano che il rapporto segnale-rumore (SNR) dell'immagine diminuisce.
      3. Dato un SNR, aumenta il valore dello slider man mano che la dimensione del pixel diminuisce.
      4. Per gli stack di immagini, applica un smoothing 3D, dove il raggio z viene impostato automaticamente a un terzo del raggio xy, come appropriato per i dati campionati da Nyquist.
        NOTA: Il valore dello slider corrisponde alla deviazione standard di un kernel gaussiano misurata in pixel.
    2. Sposta il cursore Denoise per applicare un filtro mediano, rimuovendo così valori estremi (pixel caldi della fotocamera o emissioni termoioniche PMT).
      NOTA: Il valore dello slider corrisponde al raggio di un kernel di scatola in pixel. Valori tra 0,5 e 1,0 sono un buon punto di partenza.
    3. Sposta il cursore Sharpen per applicare una maschera di non nitidezza 2D, riducendo così la sfocatura o la foschia, come può essere causata da luce fuori fuoco. L'acutidezza accentua anche il rumore.
      NOTA: Il valore del cursore corrisponde alla deviazione standard di un kernel gaussiano (in unità di pixel) utilizzata per definire la scala della sfocatura. Per immagini campionate da ~Nyquist (70-150 nm di dimensione xy pixel), valori slider tra 2.0 e 4.0 sono un buon punto di partenza. Il parametro di peso è fissato a 0,6.
  2. Alterare l'intensità dei pixel dell'immagine (Processo Panel, Modifica l'intensità del canale sezione).
    NOTA: Tutti i comandi si applicano solo al canale attivo e i risultati sono automaticamente mostrati nella finestra dell'immagine. Non viene creata una nuova finestra di immagine.
    1. Sposta il cursore Sub.Bkgd. per applicare l'algoritmo della 'palla rotolata', rimuovendo così lo sfondo (cioè variazioni di intensità spazialmente graduali).
      NOTA: Il valore del cursore è il raggio della palla rotolante nei pixel, quindi valori più grandi sottraranno meno sfondo totale. Il valore dipende dal contenuto dell'immagine ma generalmente dovrebbe essere ≥2x superiore alla dimensione (misurata in pixel) delle caratteristiche da preservare. Valori tra 10 e 20 sono spesso un buon punto di partenza.
    2. Sposta il cursore Gamma per migliorare la visualizzazione di segnali più deboli mescolati a segnali più luminosi, come quelli che potrebbero essere necessari per enfatizzare strutture fini quando mescolate con strutture grandi.
      NOTA: Dopo la normalizzazione, il valore di ogni pixel viene aumentato a una potenza (esponente) data dal valore dello slider. Il valore dipende dal contenuto dell'immagine, ma valori tra 0,6 e 0,8 sono spesso un buon punto di partenza.
      ATTENZIONE: Le immagini in cui è stato applicato gamma non possono essere utilizzate per la quantificazione dell'intensità.
    3. Premi il pulsante Applica Guadagno e Offset: ToCh o ToAll per mappare l'intervallo di visualizzazione dell'immagine (come specificato dai cursori di guadagno e offset nel pannello Display) sull'intera gamma di intensità fornita dalla profondità di bit dell'immagine.
      NOTA: Questo processo è anche noto come applicazione di tabella di ricerca (LUT). Il Guadagno e l'Offset di visualizzazione devono essere applicati in questo modo prima di creare le Viste di Canale nel pannello di visualizzazione .
    4. Usa i pulsanti Correzione dell'Intensità per correggere i cambiamenti di intensità artificiali nelle dimensioni z o t delle immagini 3D, come potrebbero essere causati da fotosbiancamento, aberrazioni o dispersione della luce.
      NOTA: L'azione viene applicata solo al canale attivo. Le correzioni locali e globali possono essere applicate in sequenza allo stesso dataset. Vedi la sezione Risultati per ulteriori spiegazioni dei metodi sottostanti.
    5. Premi i pulsanti Global per correggere le perdite graduali di intensità del segnale che si verificano su tutta la dimensione z o t, preservando la maggior parte delle variazioni di intensità guidate biologicamente. Ci sono due opzioni:
      1. Premi il pulsante GlobalL per correggere gli z-stack in cui le prime sezioni possono essere scure o nere, e la perdita totale di intensità dal primo all'ultimo fotogramma è lieve (<50%). L'algoritmo modella la perdita di intensità come una tendenza lineare e poi applica un fattore di correzione a ogni taglio in modo che la pendenza della linea di adattamento diventi zero.
      2. Premi il pulsante GlobalP per correggere le serie temporali in cui i primi fotogrammi sono i più luminosi e la perdita totale di intensità dal primo all'ultimo fotogramma è notevole (50%-95%). L'algoritmo modella la perdita di intensità come una tendenza polinomialedi ordine 2 e poi applica un fattore di correzione a ogni fetta tale che la curva di adattamento venga trasformata in una retta con pendenza zero.
    6. Premi il pulsante Locale per correggere cambiamenti locali e bruschi di intensità del segnale, preservando però cambiamenti graduali.
      NOTA: Tali cambiamenti possono essere causati dallo sbiancamento di alcuni piani all'interno di uno stack z più grande o da fluttuazioni di potenza di eccitazione (sfarfallio). L'algoritmo modella le variazioni di intensità biologicamente rilevanti come un polinomio di quarto ordine e poi applica un fattore di correzione per garantire che l'intensità mediana di ogni frame sia uguale al valore della curva adattata.
    7. Premi il pulsante Equalize per rendere uguale l'intensità mediana del segnale di ogni fotogramma, simile al metodo di correzione della candeggina a 'rapporto simple' delle Fiji.
      ATTENZIONE: Equalize può essere utile per scopi di visualizzazione quando tutti gli altri metodi falliscono, ma cancella le variazioni biologicamente rilevanti nell'intensità mediana e quindi non può essere usato insieme alla quantificazione dell'intensità.
  3. Modifica la dimensionalità di un'immagine (Pannello di Processo , sezione Modifica Dimensioni ).
    NOTA: Questi comandi si applicano a tutti i canali nella finestra dell'immagine e non possono essere invertiti usando il pulsante Annulla .
    1. Premi il pulsante Ruota per ruotare l'immagine, ad esempio per allineare gli assi anatomici di un embrione o di un tessuto con la pagina o lo schermo.
    2. Premi il pulsante Ritaglio per ridurre le dimensioni xy dell'immagine. Cerca lo strumento di ROI rettangolare che viene selezionato automaticamente e osserva il prompt per disegnare un ROI sull'immagine che verrà usata per il ritaglio.
    3. Premi il pulsante Sottoinsieme per creare una nuova pila di immagini da un sottoinsieme delle dimensioni non xy dell'immagine di input.
      NOTA: Questo viene usato per rimuovere canali e/o troncare le fette in z o t.
  4. Registra i comandi di elaborazione applicati a un'immagine (Process Panel, sezione Record Actions).
    NOTA: Lo scopo del Registratore di Azioni è registrare automaticamente le azioni come testo semplice e poi salvare l'immagine con le azioni applicate, che modificano i valori dell'intensità dei pixel. Il registro è una comodità affinché l'utente non debba prendere appunti manualmente o decifrare le voci del registratore macro delle Fiji. I comandi che non modificano l'intensità dei pixel non vengono registrati.
    1. Premi il pulsante Rec per iniziare la registrazione dei comandi.
      NOTA: Il quadrante del pulsante segna 'ON' quando il registratore registra. I comandi eseguiti e i parametri associati appariranno nella Tabella delle Azioni. I comandi che vengono 'annullati' vengono rimossi dalla tabella.
    2. Premi il pulsante Clr per liberare la Tabella delle Azioni.
    3. Premi il pulsante Salva per salvare la Tabella delle Azioni come file di testo. Se le azioni applicate a più immagini sono state registrate, le azioni saranno raggruppate secondo il titolo dell'immagine quando il file di testo viene salvato.
      NOTA: In alternativa, salva un'immagine utilizzando il pannello Salva (sezione 4 sotto). Seleziona la casella Salva azioni e tutte le azioni applicate all'immagine verranno automaticamente salvate come file di testo usando il nome e il percorso del file dell'immagine.

4. Utilizzo del pannello di salvataggio di EasyFiji

NOTA: Come mostrato nella Figura 1C, il pannello di salvataggio è progettato per aiutare i non esperti a selezionare il formato di file immagine corretto per il caso d'uso previsto. Quando la casella Salva Azioni è selezionata, tutte le azioni di elaborazione applicate a un'immagine, come elencate nella Tabella delle Azioni, vengono automaticamente salvate insieme all'immagine, utilizzando lo stesso nome file e percorso, ma con l'estensione *.txt. Se più immagini sono aperte e sono state elaborate in parallelo, tutte le azioni eseguite su tutte le immagini sono visualizzate nella Tabella delle Azioni. Tuttavia, solo le azioni applicate all'immagine salvata vengono salvate con quell'immagine. Il file di testo salvato appare nel file system ma non si apre nelle Fiji. Se desiderato, i file di testo possono essere aperti a Fiji trascinando l'icona del file nella barra delle strumenti delle Fiji.

  1. Salva un'immagine (Pannello di salvataggio , sezione Metodi di salvataggio ).
    1. Premi il pulsante Raw Data per salvare l'immagine come file *.tif, dove vengono preservati i valori esatti dei pixel, la struttura dei canali e alcuni metadati. Usa questa opzione quando l'obiettivo è quantificare o analizzare ulteriormente un'immagine.
    2. Premi il pulsante Salva per la presentazione per salvare l'immagine come attualmente visualizzata usando compressione jpeg ai fini di inviare email o di utilizzare in una presentazione di diapositive.
      ATTENZIONE: Questa opzione non dovrebbe mai essere utilizzata per creare figure o per analisi quantitative.
    3. Sposta lo slider Quality Level per impostare il livello di compressione jpeg.
      NOTA: Valori maggiori corrispondono a una migliore conservazione delle intensità e delle caratteristiche dei pixel (e a una dimensione del file maggiore), ma mai tutte le caratteristiche sono conservate.
    4. Premi il pulsante Salva per la figura per salvare l'immagine come attualmente visualizzata in formato png compatibile con altri programmi grafici (ad esempio Photoshop, Illustrator, Publisher o GIMP). L'immagine viene salvata come mostrata sullo schermo, ma canali e metadati non vengono conservati.
      ATTENZIONE: Questa opzione non dovrebbe mai essere utilizzata per la quantificazione.
    5. Premi il pulsante Salva come Film per salvare una pila di immagini come film in formato mov che riproduce le sezioni in sequenza (z o t).
      NOTA: La riproduzione di file mov su un sistema operativo Windows richiede l'open source VLC Media Player.

5. Utilizzo del pannello Informazioni Immagine di EasyFiji

NOTA: Come mostrato nella Figura 1D, il pannello Informazioni Immagine mostra impostazioni di acquisizione specifiche per il fornitore in testo semplice, cruciali per l'interpretazione delle immagini. Vedi la Tabella 2 per un elenco dei tipi di formati di immagine confocale attualmente supportati.

  1. Premi il pulsante Informazioni canale per caricare le impostazioni di acquisizione.
  2. Consulta la sezione Informazioni sul canale per le impostazioni specifiche di acquisizione del canale, inclusi percentuale di potenza laser, lunghezza d'onda laser, bandpass di emissione, guadagno e dimensione dei fori stenopeici.
  3. Consulta la sezione Configurazione del Sistema per le impostazioni a livello di immagine,inclusi nome ystem, obiettivo, modalità di scansione, tempo di permanenza e dimensione voxel.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le rappresentazioni pseudo-colorate di immagini a fluorescenza multicanale possono essere utilizzate per illustrare le relazioni spaziali o di intensità tra i segnali; tuttavia, la Fiji nativa offre solo una tecnica di rendering composito RGB che confonde colorazione e luminosità a livello percettivo. Per illustrare questo problema, la Figura 2 utilizza un'immagine a due canali di N-Myc e RNA Polimerasi II (RNAPolII). Nella Figura 2A

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji è un software open source per l'elaborazione e l'analisi delle immagini molto popolare tra gli analisti di immagini. Tuttavia, la sua complessa interfaccia di menu e i comportamenti talvolta poco intuitivi rispetto alla visualizzazione e all'elaborazione delle immagini a fluorescenza rappresentano sfide per gli scienziati della vita non computazionali. EasyFiji offre agli scienziati della vita un set selezionato di pulsanti e cursori tematicamente organizzati e migliorati da tooltip...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i membri del St. Jude's Cell and Tissue Imaging Center e del Center for BioImage Informatics per i commenti sul manoscritto. Le immagini biologiche sono state gentilmente fornite da: Figura 2: Melissa Marzahn e Tanja Mittag; Figura 3: Peng Wei e James Morgan; Figura 4A: Aaron Pitre; Figura 4B: Aaron Pitre e Woo Jung Cho; Figura 5A: Helen Chen e Heather Mefford; Figura 5B: Sauradeep Sinha e Giedre Krenciute.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sito EasyFiji su GitHubOpen Sourcehttps://github.com/stjude/EasyFiji
Forum Image.sc EasyFijiOpen Sourcehttps://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
Sito ImageJ.net EasyFijiOpen Sourcehttps://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
FIJI SoftwareOpen Sourcehttps://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC Media PlayerOpen Sourcehttps://www.videolan.org/vlc/

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