Articolo metodologico

Un approccio comparativo per studi quantitativi di conteggio cellulare in cervelli di mammiferi molto diversi

DOI:

10.3791/69446

⸱

16 gennaio 2026

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

In questo articolo

Sommario

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Le neuroscienze moderne devono esplorare le differenze tra molte specie, inclusi roditori da laboratorio e umani. Tuttavia, emergono difficoltà tecniche quando sono coinvolti mammiferi con cervello grande. Questo approccio affronta la variazione interspecie delle popolazioni neuronali in mammiferi molto diversi, producendo risultati comparabili da mappare per rivelare modelli evolutivi.

Abstract

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La maggior parte degli studi neurobiologici viene condotta su roditori da laboratorio. Nonostante le molte somiglianze tra i cervelli dei mammiferi, esistono anche differenze importanti, che possono essere fuorvianti nella traduzione. Sono state riscontrate differenze marcate tra specie nella plasticità cerebrale, in particolare nella neurogenesi. Processi neurogenici diversi possono essere diffusi a causa di compromessi evolutivi, mostrando variazioni tra strutture cerebrali e mammiferi e spostando il potenziale di plasticità in specie divergenti, come topi e esseri umani. Confrontare specie molto diverse solleva molteplici questioni: gli studi comparativi incontrano difficoltà tecniche quando sono coinvolti cervelli di grandi dimensioni; L'uso di approcci sperimentali eterogenei da parte di diversi laboratori può limitare il confronto dei risultati; L'eterogeneità può essere correlata a diversi percorsi temporali dei processi neuroevolutivi tra i mammiferi, aggiungendo così variabili al confronto.

Per affrontare queste limitazioni, è stato stabilito un approccio per studiare la variazione interspecie di una popolazione di neuroni corticali immaturi di livello II in mammiferi, ampiamente diverse per dimensione cerebrale, girencefalia, nicchia socioecologica ed età. Nonostante alcune variabili che non possono essere completamente standardizzate, si propone un metodo che combini una riduzione dell'eterogeneità nei cervelli collezionisti e l'istituzione di strutture anatomiche comuni come punti di riferimento per il conteggio cellulare sui corrispondenti livelli cerebrali. I dati ottenuti (ad esempio, densità cellulari) possono essere mappati su alberi filogenetici per rivelare modelli evolutivi e analizzati per la covarianza con le caratteristiche neuroanatomiche (ad esempio, dimensione del cervello, superficie corticale). Questo approccio ha dimostrato una notevole variazione nel numero di neuroni corticali immaturi tra gruppi filogenetici e ha scoperto la covariazione con la dimensione del cervello. Il metodo può anche essere utilizzato per quantificare differenze tra diverse fasi di sviluppo nella stessa specie e può essere esteso ad altri mammiferi diversi e processi biologici per mappare risultati comparabili che permettano una quantificazione più accurata delle diverse popolazioni cellulari nel cervello adulto per supportare la plasticità.

Introduzione

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La ricerca neuroscientifica utilizza principalmente topi e ratti consanguinei per tradurre i risultati agli esseri umani. Nonostante molte somiglianze molecolari, cellulari e persino anatomiche, esistono anche importanti differenze interspecie, che possono essere fuorvianti per l'interpretazione dei datipreclinici 1,2. Sebbene siano necessari studi comparativi, sono ostacolati da difficoltà tecniche e pratiche quando sono coinvolti cervelli di grandi dimensioni (ad esempio, da una media di 0,5 g nei topi a 1300 g negli esseri umani; Figura 1A). Inoltre, approcci sperimentali eterogenei di laboratori diversi possono limitare il confronto dei risultati, in particolare analisi quantitative, generando talvolta controversie. Questo è il caso della plasticità strutturale cerebrale, con particolare riferimento ai processi neurogeni 3,4,5, un argomento di interesse per comprendere la neuroplasticità dello sviluppo e la riparazionecerebrale 6,7.

Recenti scoperte nel campo della plasticità cerebrale suggeriscono fortemente che durante l'evoluzione sono emerse differenze sostanziali nella presenza, nella frequenza e nella localizzazione anatomica dei diversi tipi di processineurogenici. Un esempio è la evidente diminuzione della neurogenesi guidata dalle cellule staminali che si verifica nei mammiferi adulti con cervello grande rispetto ai roditoridi laboratorio 5,9,10, probabilmente collegata a una diversa espansione delle regioni cerebrali e delle funzioni come adattamento alle pressioniecologiche 7,8, così come a diversi corsi temporalineuroevolutivi 11,12. Il tasso di neurogenesi sembra variare notevolmente tra topi e umani, sollevando così la questione dellatraduzione 13.

D'altra parte, un nuovo tipo di "neurogenesi senza divisione" rappresentato da neuroni bloccati nella maturazione arrestata (i cosiddetti neuroni immaturi odormienti 14,15,16,17,18,19) è stato ipotizzato come un aumento da specie a cervello piccolo a cervello grande 20,21. Curiosamente, la popolazione di neuroni immaturi indipendente dalle cellule staminali è ospitata nella corteccia cerebrale (un sito di cognizione di alto ordine nelle speciegirocefaliche 22,23) e lontana dai siti neurogeni canonici, che sono per lo più legati all'olfazione e alla navigazione spaziale, che mantengono grande importanza nelle specie lissencefaliche 7,8. Queste differenze tra le strutture cerebrali e le specie di mammiferi vanno oltre il semplice interesse comparativo, poiché possono essere rilevanti nella traduzione spostando il potenziale di plasticità in topi e esseri umani. Per questi motivi, è fondamentale valutare in modo "comparabile" fino a che punto le differenze rappresentino una variazione filogenetica tra mammiferi molto diversi, con particolare riferimento a roditori e primati di laboratorio.

È descritto un approccio recentemente stabilito per studiare la variazione interspecie di una popolazione di neuroni corticali immaturi (cIN) di livello II in mammiferi con dimensioni cerebrali molto diverse, girencefalia e nicchiasocioecologica 22,24,25. Questo metodo si basa su tre principi: i) considerare diverse specie di mammiferi (diverse) da processare in parallelo utilizzando le stesse procedure; ii) minimizzare variabili che non possono essere completamente standardizzate in cervelli molto diversi (procedura di fissazione, intervallo post-mortem, età) e affrontare la specificità di specie degli anticorpi per l'immunocitochimica utilizzando caratteristiche ampiamente condivise della popolazione cellulare in studio come controlli positivi interni; e iii) stabilire strutture anatomiche corrispondenti come punti di riferimento per effettuare il conteggio cellulare sui corrispondenti livelli cerebrali di diverse specie (Figura 1B e Figura 2). I dati ottenuti (ad esempio, densità cellulari) contando le cellule identificate con il ben consolidato marcatore doublecortin (DCX 15,17,26) possono essere mappati su alberi filogenetici per rivelare schemi evolutivi e analizzati per la covarianza con diversi parametri, come la dimensione del cervello, la girencefalia e l'area corticale.

Figura 1
Figura 1: Elaborazione di cervelli mammiferi molto diversi per valutare la distribuzione e la quantità di cIn nel mantello corticale. (A) I mammiferi appartenenti a specie e ordini diversi sono caratterizzati da dimensioni cerebrali molto diverse e da gradi di espansione girencefalia e corticale. Icone cerebrali riprodotte con licenza BioRender. (B) Sezioni coronali rappresentative con colorazione blu di Toluidina ricamate da cervelli di dimensioni molto diverse ed estensione del mantello corticale. Vengono utilizzate sezioni seriali istologicamente colorate (taglio criostatico, coronale, spesso 40 μm) per identificare le principali strutture neuroanatomiche in ciascuna specie animale (vedi Figura 3); Nota le notevoli differenze nella dimensione del cervello e nel perimetro corticale. Le icone degli animali nel pannello A sono state riprodotte con il permesso di La Rosa et al.22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Infine, poiché tutti i processi plastici generalmente subiscono una riduzione progressiva con l'aumento dell'età27,28, un ulteriore problema nella neuroplasticità comparativa è valutare i diversi percorsi temporali di tale riduzione, che possono essere correlati a diversi percorsi temporali dei processi neurosviluppali tramammiferi 12,29,30. In effetti, l'esistenza di specie a maturazione rapida (topo) rispetto a specie a maturazione lenta (primati) è un altro motivo per cui il sistema modello più comune, il topo da laboratorio, è limitato nella risoluzione delle sfide nelle scienze biomediche. Il metodo descritto qui può essere utile anche per considerare popolazioni cellulari a diverse età durante la durata della vita di ciascuna specie e poi confrontare le tendenze risultanti tra specie. Sono state riscontrate variazioni filogenetiche nella densità di cIN, così come differenze nella loro persistenza attraverso le età, tra mammiferi a cervello piccolo e a cervellogrande 22,28.

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Protocollo

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Tutte le procedure animali rispettavano le normative nazionali e istituzionali pertinenti. I tessuti topini sono stati ottenuti dall'Istituto di Neuroscienze Cavalieri Ottolenghi (NICO), Orbassano, Italia, con autorizzazione del Ministero della Salute italiano (RRID: MGI:3696370), grazie a Serena Bovetti e Charles River Laboratories. I tessuti nudi di topo talpa sono stati raccolti presso la Queen Mary University di Londra (Regno Unito) immediatamente dopo l'eutanasia, secondo l'Allegato 1 dell'Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Gli esperimenti sui conigli hanno seguito la Direttiva 86/609/UE del Consiglio delle Comunità Europee e la legge italiana (DL.vo 116/92), con l'approvazione del Ministero della Salute italiano (autorizzazione 66/99-A). Cervelli di pecore e cavalli sono stati prelevati post mortem da un mattatoio commerciale secondo la Direttiva 86/609/EEC e una supervisione veterinaria continua. I cervelli dei cani sono stati forniti post mortem dai laboratori MarshallBio (Lione, Francia) con le autorizzazioni necessarie; I cervelli di gatto sono stati prelevati post-mortem presso l'Università di Padova durante necropsie diagnostiche di routine con il consenso del proprietario. Tutte le procedure hanno seguito la legislazione UE e italiana. I campioni di scimpanzé sono stati gestiti secondo i principi guida internazionali del Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) e sotto il permesso A5761-01 del National Institutes of Health - Office of Laboratory Animal Welfare (NIH-OLAW) (per dettagli su ciascuna specie animale ed esperimento vedi la Tabella Supplementare 1 e le Rif. 22,25).

1. Raccolta di cervelli

  1. Raccogli cervelli direttamente o da altre istituzioni e banche tessutiche, ma considera solo l'intero emisfero. Istituire con le istituzioni la procedura migliore per estrarre cervelli dalla specie animale, con l'obiettivo di ridurre i danni all'emisfero e garantire il minimo intervallo post-mortem (PMI, vedi NOTA sotto) e un'immersione rapida nella soluzione fissativa dopo l'estrazione.
    NOTA: A seconda della sensibilità dell'anticorpo di interesse, è importante tenere presente il PMI. Data l'elevata sensibilità della doublecortin (DCX) alla degradazione, si devono raccogliere campioni con un intervallo PMI di 0-1 ora (ad eccezione dello scimpanzé, che ha un PMI fino a 14 ore, che tuttavia non ha causato alcuna alterazione nella qualità della colorazione, Tabella Supplementare 1).
  2. Data l'elevata variabilità della durata della vita dell'animale, si predetermina i gruppi d'età che verranno raccolti tra i diversi mammiferi considerati per lo studio, per ottenere dati comparabili.
    1. Per questo disegno di studio e per stabilire gruppi d'età comparabili, analizza le informazioni di due database sulla storia e diversità animale: AnAge, un database curato sull'invecchiamento e la storia della vita negli animali, e Animal Diversity Web, un database online sulla storia naturale degli animali, distribuzione, classificazione e biologia della conservazione.
    2. Dividere la durata della vita animale in quattro stadi (uno prepuberale e tre post-puberale, ovvero "adulto"), partendo dalla classificazione dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per le fasi di vita neicani 31, in cui la durata della vita è stata suddivisa in sei fasi: cucciolo, junior, adulto, maturo, senior e geriatrico.
    3. Compattando gli stadi senior e geriatrico, e gli stadi adulto e maturo, applica questa terminologia: prepuberale, giovane adulto, mezza età e senior/22 anni.

2. Fissazione e elaborazione del tessuto cerebrale

NOTA: Le procedure di fissazione possono essere diverse a seconda della dimensione del cervello e delle preoccupazioni etiche riguardo ad alcune specie animali (la maggior parte dei primati o cavalli dal cervello grande non può essere perfusa e deve essere fissata tramite immersione nella soluzione fissativa dopo l'estrazione).

  1. Mantenere il cervello completamente immerso nella soluzione fissativa (consigliato 4% di paraformaldeide o 10% di formalina).
    NOTA Il tempo di fissazione varia a seconda della dimensione del cervello (ad esempio, 3 settimane per il cervello canino; 3 mesi per il cervello equino, Tabella Supplementare 1). Evita di passare poco o troppo tempo nella soluzione fissativa per mantenere l'integrità dell'antigene di interesse.
  2. Taglia l'emisfero cerebrale preferito in fette uguali (spesse 1-1,5 cm) usando un righello (per eseguire un taglio dritto) e un coltello da pugnala.
  3. Immergi le fette cerebrali in un tampone fosfatico (PB) 0,1 M (28,49 g di fosfato di sodio dibase e 7,8 g di fosfato di sodio monobasico disciolti in acqua distillata, pH 7,4) e mantienile sotto una delicata agitazione su uno shaker per 24 ore. Se necessario (vedi NOTA sotto), scartare la soluzione e sostituirla con una soluzione fresca di PB 0,1 M, pH 7,4 il giorno successivo.
    NOTA: Il volume e il numero di lavaggi in PB 0,1 M variano a seconda della dimensione del cervello (ad esempio, 30 min per il cervello del topo, 3 giorni per il cervello del cavallo). Assicurati che il cervello sia completamente immerso in PB 0,1 M e che non siano più presenti formalina, sangue e residui tissuti per interrompere il lavaggio.
  4. Crioproteggi le fette immergendole in soluzioni di saccarosio a concentrazione gradualmente crescente (10%, 20%, fino al 30%) in PB 0,1 M, pH 7,4, e mantenle sottoposte a una delicata agitazione su uno shaker.
    NOTA: Il volume delle soluzioni di saccarosio varia a seconda della dimensione del cervello. Assicurati che i cervelli siano completamente immersi nelle soluzioni di saccarosio e che affondino completamente prima di spostarli in una concentrazione di saccarosio aumentata.

3. Taglio criostatico dell'emisfero intero

  1. Rimuovi le meningi dalle fette cerebrali usando pinzette curve per evitare problemi durante il taglio.
  2. Metti le fette in stampi di incorporamento riempiti con composto a temperatura di taglio ottimale (OCT). Se la fetta non riempie lo stampo di incassamento, taglia un pezzo quadrato di Parafilm leggermente più grande della fetta cerebrale e aggiungi il medium OCT al centro del pezzo, poi posiziona la fetta sopra l'OCT.
  3. Congelare la fetta per immersione in 300 mL di isopentano raffreddato con azoto liquido a -50 °C finché il mezzo OCT non diventa completamente bianco. Le fette di cervello possono essere conservate a -80 °C per conservazione a lungo termine fino alla sezione.
  4. Prima di sezionare, mantenere la fetta cerebrale a -20 °C per almeno 5 ore per permettere al tessuto di raggiungere lentamente e in modo omogeneo la stessa temperatura del criostato.
  5. Tagliare la fetta in sezioni coronali seriali spesse 40 μm utilizzando un criostato, mantenendo un intervallo di temperatura interna della camera da -20 °C a -25 °C.
  6. Raccogliere sezioni libere in piastre a 12 pozzi e conservarle in soluzione crioprotettiva (150 mL di glicerolo, 150 mL di glicole etilenico, 150 mL di acqua distillata e 50 mL di tampone F [1,682 g di fosfato di sodio monobasico diidrato e 0,385 g di idrossido di sodio disciolto in acqua distillata, pH 7,4]) (1 mL/pozzo, o più per coprire completamente le sezioni nel caso di cervelli grandi) a -20 °C fino alla colorazione.
    NOTA: Le fette dell'intero emisfero variano a seconda della dimensione del cervello. I cervelli più grandi (ad esempio, scimpanzé, cavalli) devono essere divisi in due blocchi uguali (dorsale e ventrale) per essere processati nel criostato. In questo caso, le sezioni fluttuanti possono essere raccolte in due piastre a 6 pozzi. Un'alternativa è sezionare emisferi da specie con cervello grande con un microtomo scorrevole, che consente blocchi di dimensioni maggiori.

Figura 2
Figura 2: Elaborazione di cervelli molto diversi seguendo la stessa procedura e gestendo variabili che non possono essere standardizzate. Nel metodo descritto sopra, tutte le procedure che possono essere standardizzate vengono eseguite allo stesso modo (fissazione generale, taglio di sezioni coronali seriali dello stesso spessore in tutto l'emisfero, procedure immunocitochimiche generali, conteggio cellulare). Figura creata con BioRender (https://app.biorender.com/). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Colorazione istologica

  1. Scegli le sezioni coronali seriali (1 sezione su 12). Per ottenere questa spaziatura, si sceglie tutte le sezioni di un pozzo dalla piastra a 12 pozzi. Utilizzarli per ottenere una rappresentazione completa dell'intero emisfero e come riferimento per scegliere sezioni coronali a diversi livelli cerebrali comparabili tra le diverse specie studiate (vedi sezione 5). Montali su vetrini gelatinizzati all'1%. Lasciali asciugare per qualche ora.
  2. Preparare le seguenti soluzioni (150 mL/soluzione): etanolo 50%, 70%, 96%, 100%, Xylol e Toluidine Blue.
  3. Protocollo di colorazione: Posizionare i vetrini in concentrazioni crescenti di etanolo (50%-100%), 1 minuto ciascuna al 50%-70%, 2 minuti ciascuna al 96%-100%, e poi trasferire nella soluzione di xilolo per 1 minuto.
  4. Posizionare le diapositive in ordine inverso: soluzione di xilo per 1 minuto e poi concentrazioni decrescenti di soluzioni etanoliche (100%-50%), 2 minuti ciascuna al 100%-96%, 1 minuto ciascuna al 70%-50%.
  5. Metti i vetri in 150 mL di H2Odistillato (2 min).
  6. Metti le vetri nella soluzione di tinta Toluidine Blue (5-10 min). Dopo questo passaggio, le sezioni tinte appaiono di un blu scuro.
    NOTA: Il tempo in cui le sezioni vengono mantenute nelle soluzioni per la colorazione istologica può variare a seconda della specie. Testare le sezioni cerebrali della specie di interesse per impostare il protocollo ottimale di colorazione.
  7. Risciacqua i vetri con 150 mL di H2Odistillato per 1 minuto.
  8. Prosegue con la fase di differenziazione posizionando i vetrini in concentrazioni crescenti di etanolo (70%-100%) per 1 minuto al 70%, 2 minuti ciascuno al 96%-100%, e poi trasferisci nella soluzione di xilolo per 1 minuto e 30 secondi. Durante questi passaggi, le sezioni passeranno da un blu scuro a un azzurro cielo.
  9. Assicurati che le sezioni siano ancora umide dall'ultimo passaggio dello xilo prima di scivolare con un mezzo di montaggio (se si asciugano, risciacquale in soluzione di xilo per 5 secondi). Poi lasci asciugare le vetrine per qualche giorno.

5. Selezione dei livelli cerebrali e colorazione immunoistochimica

  1. Utilizzando le sezioni istologicamente colorate ottenute nella sezione 4 come riferimento, identificare i livelli cerebrali in base a specifiche caratteristiche neuroanatomiche: Livello 1 (L1) - dall'apertura anteriore del ventricolo laterale fino a L2; Livello 2 (L2) - dall'inizio anteriore della capsula interna fino a L3; Livello 3 (L3) - dall'inizio anteriore dell'amigdala fino a L4; Livello 4 (L4) - dalla chiusura posteriore del ventricolo laterale a un'estensione equivalente a quella di L2 (stesso numero di sezioni seriali spesse 40 μm; Figura 3).
    NOTA: I riferimenti neuroanatomici sopra elencati hanno lo scopo di permettere il confronto tra le cortecce cerebrali appartenenti a cervelli di dimensioni e girencefalia molto diversi. A seconda della regione cerebrale di interesse, le caratteristiche anatomiche utilizzate come riferimento possono cambiare.
  2. Scegli tre sezioni coronali equamente distanziate da ciascun livello cerebrale.
    NOTA: Il volume di ogni buffer utilizzato nei passaggi successivi varia a seconda della dimensione del cervello (ad esempio, 0,5 mL/pozzo per sezioni di topo, 1,5 mL/pozzo per sezioni di cavallo). Assicurati che le sezioni fluttuanti siano completamente coperte da ogni buffer.
  3. Lavare le sezioni tre volte in PBS 0,01 M, pH 7,4, per 5 minuti ciascuna.
  4. Incubare sezioni in soluzione bloccante perossidasi endogena (0,6%H2O2, 1% Triton X-100 in 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 min) oppure eseguire il recupero dell'antigene utilizzando acido citrico (10 mM di acido citrico in acqua distillata integrato con 0,05% Tween 20, pH 6,0), per 5 minuti a 90 °C.
    NOTA: A seconda della procedura/tempo di fissazione e dell'antigene di interesse, può essere necessario un prelievo di antigene per ottenere una colorazione ottimale (tampon, temperatura, pH e tempo di incubazione utilizzati possono variare a seconda dell'antigene di interesse).
  5. Lava di nuovo le sezioni in PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min lavaggi).
  6. Incubare sezioni in soluzione bloccante (albumina sieroica bovina 1-5% (BSA), siero normale, 1-1,5% Triton X-100 in 0,01 M PBS, pH 7,4; 90 min a RT).
  7. Incubare sezioni con soluzione primaria di anticorpi (1-5% BSA, 2-3% siero normale, 1-1,5% Triton X-100, anticorpo primario in 0,01 M PBS, pH 7,4; 48 ore a 4 °C sotto lieve mescolamento).
    NOTA: Gli anticorpi contro l'antigene di interesse possono dare risultati diversi in termini di qualità della colorazione quando utilizzati in diverse regioni cerebrali e in speciediverse. È necessario un confronto tra un insieme di anticorpi di diversi produttori per scegliere lo strumento ottimale da utilizzare nelle diverse specie considerate per lo studio (per ridurre la variabilità tra i campioni).
  8. Ripeti il passaggio di lavaggio descritto nel passo 5.3.
  9. Incubare sezioni con soluzione secondaria di anticorpi biotinilati (1-5% BSA, 2-3% siero normale, 1-1,5% Triton X-100, anticorpo biotinilato secondario in 0,01 M PBS, pH 7,4; 2 h a RT).
    NOTA Il metodo del complesso avidina-biotina perossidasi è utilizzato per il conteggio cellulare su Neurolucida (vedi sezione 6), poiché fornisce un precipitato denso e duraturo, permettendo così di mettere a fuoco lo spessore della sezione durante il conteggio. L'immunofluorescenza e l'analisi confocale possono essere utilizzate anche per eseguire doppia/tripla immunocolorazione al fine di caratterizzare ulteriormente le cellule (per i protocolli vedi Rif.22,25,32).
  10. Prepara il complesso avidina-biotina-perossidasi utilizzando il kit disponibile.
    NOTA: Prepara una soluzione complessa di avidina-biotina perossidasi in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (che fornisce un pH stabile per la formazione del complesso) almeno 1 ora prima dell'uso, per consentire la formazione del complesso.
  11. Lava le sezioni due volte in PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 lavaggi da 5 min) e una volta in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 min).
    NOTA: Poiché il complesso avidina-biotina-perossidasi è in soluzione con Tris-HCl 0,05M, il risciacquo con Tris-HCl 0,05 M permette l'abituazione del tessuto alla soluzione.
  12. Incubare sezioni nel complesso avidina-biotina-perossidasi (1 ora alla RT).
  13. Lava le sezioni in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 x 5 min lavaggi).
  14. Sotto una cappa fumi, incubare sezioni in una soluzione di colorazione 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (H2O2, DAB in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) fino a ottenere la colorazione ottimale. Durante questo passaggio, le sezioni passano da un colore trasparente a un rosso marrone/bordeaux.
    NOTA: Il tempo per ottenere la colorazione ottimale varia a seconda della specie analizzata (ad esempio, per DCX, 2-5 minuti per sezioni di topo, 20-30 minuti per sezioni di cavallo). Controlla le sezioni che si tingono ogni 2 minuti per evitare che si macchino troppo.
  15. Lava le sezioni in PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min lavaggi).
  16. Monta le sezioni su una slitta, una volta asciutta, copri con un supporto di copertura usando un mezzo di montaggio e lascia asciugare le sveglie per qualche giorno.

Figura 3
Figura 3: Stabilimento dei livelli neuroanatomici cerebrali per lo studio della distribuzione e quantità immatura di neuroni DCX+ nella corteccia cerebrale. Quattro strutture neuroanatomiche corrispondenti (inizio anteriore del ventricolo laterale [livello 1, L1]; inizio anteriore della capsula interna [L2]; inizio anteriore dell'amigdala [L3]); chiusura posteriore del ventricolo laterale [L4]; indicati da cerchi rossi) sono stati considerati come l'indicazione di quattro corrispondenti "livelli cerebrali" anteriori-posteriori in tutti i mammiferi considerati, per studiare il numero di cIN all'interno della corteccia cerebrale in modo "comparabile". (A) Un esempio è fornito per roditori da laboratorio (topo, sinistra) e primati (scimpanzé, destra). Tre sezioni coronali per ciascun livello cerebrale (per un totale di 12 sezioni; punte di freccia rosse) sono considerate per il conteggio cellulare sull'intero perimetro dello strato II di ciascuna sezione coronale (NOTA: tutte le sezioni contengono neocorteccia, mentre solo alcune di esse conterranno anche paleocortecce). Questo approccio mira a permettere di eseguire analisi su livelli neuroanatomici corrispondenti in cervelli di dimensioni molto diverse. (B) Viene fornito un esempio per l'identificazione del primo livello (L1) in sezioni istologicamente colorate di specie di mammiferi molto diverse. Icone di cervello e animali create con BioRender. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Conteggio delle celle

  1. Apri il software Neurolucida sulla workstation e posiziona il vetrino sotto il microscopio con l'obiettivo selezionato per il conteggio delle cellule.
    NOTA: Per il conteggio delle celle DCX+, è stato utilizzato un obiettivo di 20x.
  2. A basso ingrandimento (ad esempio, 4x), disegna il contorno dello strato corticale II usando lo strumento a mano libera a mano libera nella linea di contorno nel menu Traccia del software, per ottenere il perimetro di lunghezza (sia paleocorteccia che neocorteccia).
  3. Seleziona i simboli preferiti per il conteggio delle celle nella barra degli Marker, presenti nella parte sinistra dello schermo. Per questa analisi, si contano differenzialmente due cellule diverse in ciascuna regione di interesse (paleocortecce, neocortecce) a seconda della loro morfologia (corrispondenti a diversi stati maturi: tipo 1, con soma piccolo e forma bipolare, intervallo di diametro soma 3-9 μm; tipo 2, con soma più grande e arborizzazione dendritica complessa, intervallo di diametro soma 9-18 μm).
    NOTA: Per questa analisi, nella Barra degli Strumenti dei Marcatori vengono selezionati due diversi simboli/tipi di celle per ogni regione di interesse. Dividere il diametro del soma in diversi intervalli è fondamentale per categorizzare meticolosamente le cellule senza una morfologia chiara, che potrebbe trovarsi in uno stato intermedio di maturazione. Per evitare il sovraconteggio, le cellule tagliate sulla superficie superiore della sezione vengono escluse dall'analisi.
  4. Raccogliere i dati per l'analisi filogenetica da tre diverse regioni: paleocortecce, neocorteccia e corteccia cerebrale (quest'ultima ottenuta aggiungendo dati da paleo- e neocortecce).
  5. Raccogli in un file di foglio di calcolo il perimetro dello strato corticale due (mm), visibile nella barra delle Misure di Contorno del software.
  6. Sullo stesso foglio di calcolo, raccogli il numero di celle di tipo 1 e tipo 2 (visibili nella Barra degli Indicatori) e il numero totale di cellule (ottenuto sommando le cellule di tipo 1 e tipo 2) in ciascuna regione cerebrale e il livello cerebrale considerato (tre sezioni/livello, totale di 12 sezioni/campione).
  7. Usa questi dati per ottenere, per ogni sezione in ogni regione, la densità lineare delle celle (numero di celle/mm) e la percentuale di celle di tipo 1 e tipo 2 (numero di celle di tipo 1/tipo 2 diviso per il numero totale di celle e moltiplicato per 100).
  8. Calcola il valore mediano della densità (usando la funzione mediana sul foglio di calcolo) delle 12 sezioni considerate/campione, per rappresentare graficamente la densità lineare delle celle. Usare la mediana come misura centrale perché il campione per gruppo è relativamente piccolo (4 animali/gruppo) e alcuni gruppi presentano distribuzioni asimmetriche (la mediana è meno influenzata dai valori estremi).
  9. Calcola la percentuale di celle di tipo 1 e 2 in ogni campione (usando la formula descritta sopra) e poi ottieni il valore medio delle percentuali tra i quattro campioni considerati/specie (usando la funzione Media sul foglio di calcolo). Successivamente, si utilizza la densità cellulare lineare per eseguire analisi filogenetiche (vedi sezione 7) e si utilizza il totale delle cellule conteggiate in ogni sezione coronale per stimare il numero totale di neuroni/emisferi immaturi.
  10. Usa lo strumento di contorno a mano libera su Neurolucida Software per tracciare una linea attraverso il diametro del soma perpendicolare al suo asse principale. Eseguendo questo passaggio, calcola la lunghezza del diametro di almeno 100 cellule DCX-positive (DCX+) selezionate casualmente di entrambi i tipi in ciascuna specie (25 cellule/campione) in ciascuna regione cerebrale, per ottenere l'intervallo di diametri del soma tra cellule di tipo 1 e tipo 2.

7. Analisi filogenetiche: generazione di alberi filogenetici

  1. Crea una lista delle specie analizzate in Notepad usando i loro nomi scientifici, e poi caricala sul sito https://timetree.org/.
    NOTA I nomi scientifici possono essere verificati utilizzando il sito: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Esporta il file ad albero ottenuto cliccando sul pulsante verso il file Newick .

8. Analisi filogenetiche: Integrazione dei dati nel conteggio dell'albero filogenetico

  1. In colonne separate di un foglio dati, elencare tutte le specie analizzate e i relativi dati con cui correlare (in questo caso: densità cellulare DCX+ dell'intera corteccia, densità cellulare DCX+ della neocorteccia e densità cellulare DCX+ della paleocorteccia). Se sono disponibili più individui per specie, calcola la media della densità mediana per i parametri selezionati.
  2. Scarica il software Mesquite Project (https://www.mesquiteproject.org/) per unire l'albero filogenetico con i dati di conteggio.
    NOTA: Questo software richiede che Java sia già presente sul computer.
  3. Apri il file Newick precedentemente salvato da Timetree cliccando su Apri file. Poi, seleziona l'opzione Simple Newick/Phylip Treefile . Tratta il file come testo e salvalo come ".nex".
  4. Nella nuova pagina che si apre, seleziona Taxa&Alberi seguiti da Nuove Tre Finestre, e seleziona Con Alberi dalla Fonte. Nella finestra pop-up, seleziona Albero Memorizzato e premi OK. Verrà visualizzata una nuova scheda chiamata Alberi Importati .
  5. Modifica graficamente l'albero filogenetico (ad esempio, font, dimensione, rami proporzionali alla lunghezza) nella sezione Visualizzazione .
  6. Aggiungi una nuova scheda su Mesquite, selezionando Aggiungi seguito da Nuova matrice di caratteri e scegli il numero di caratteri (per questo studio, numero = 3, che corrisponde alle tre densità di celle DCX+). Tratta i caratteri come dati continui.
    NOTA: I caratteri rappresentano i dati da correlare con l'albero filogenetico.
  7. Copia in questa scheda appena creata i dati che saranno correlati con l'albero filogenetico (pt. 6.4) e salvali.
  8. Nella scheda Alberi Importati, seleziona Analisi:Albero e Traccia Storia dei Caratteri per eseguire un'analisi degli Stati Ancestrali Parsimonia.
  9. Salva il file in PDF.

9. Analisi filogenetiche: correlazione tra dimensioni cerebrali e densità cellulari DCX+

  1. Nella scheda dati precedentemente creata, aggiungi una colonna con la dimensione del cervello per ciascuna specie.
  2. Calcola il logaritmo naturale delle densità cellulari DCX+ e della dimensione del cervello.
  3. Avvia il pacchetto software statistico preferito (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) ed esegui una semplice regressione lineare
  4. Scarica i file dei risultati e salva i residui come nuove colonne nel foglio dati.
    NOTA: I residui rappresentano la deviazione dei punti dati dalla linea di regressione.
  5. Nel datasheet, seleziona la colonna dei residui e quella contenente i nomi delle specie. Poi, vai su inserimento e scegli il grafico istogrammatico per visualizzare graficamente i residui.

10. Analisi filogenetiche: estensione neocorticale e correlazione della densità cellulare neocorticale DCX+

  1. Nella scheda tecnica precedentemente creata, aggiungi una colonna con i dati sull'area superficiale dello strato neocorticale II di ciascuna specie e calcola i logaritmi naturali.
  2. Nel software statistico, si esegue una semplice regressione lineare utilizzando i valori dell'area superficiale logaritmica dello strato neocorticale II come variabile X e la densità cellulare DCX+ della neocorteccia logaritmica come variabile Y.
  3. Scarica i file ottenuti e salva i residui in una nuova colonna del datasheet, dove il grafico residuo può essere creato come nel passo 9.5.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule DCX+ nella corteccia cerebrale di tutte le specie studiate condividono costantemente una serie di caratteristiche che indicano l'esistenza di una popolazione ben conservata di neuroni indifferenziati (Figura 4A). In breve, esse: (i) sono disposte topograficamente per formare un monostrato lungo lo strato corticale II; (ii) mostrare i sottotipi morfologici descritti per le diverse fasi di maturazione nei neuroni immaturi, (a) con una grande prevalenza di piccole cellule unipolari/b...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo qui descritto fornisce dati quantitativi comparabili quando si considerano specie diverse con dimensioni cerebrali e neuroanatomia molto diverse. Può essere utilizzato per valutare la coerenza delle popolazioni cellulari nell'intero cervello di mammiferi diversi, nonché per seguirne lo sviluppo in una singola specie nelle fasi successive, dal postnatale all'invecchiamento. Si parte dall'assunto che un numero relativamente alto di cervelli (interi emisferi) e specie sarà coinvol...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Matteo Piumatti e Chiara La Rosa per aver contribuito a definire il protocollo qui riportato per i neuroni corticali immaturi. Il lavoro è stato supportato dalla Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (finanziamento RF=2022.0618) a LB; PRIN2022 (concessione 2022LB4X3N) a LB; National Science Foundation (sovvenzioni EF-2021785, DRL-2219759) e National Institutes of Health (sovvenzioni NS092988, AG067419) al CCS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% formalinaSigma-AldrichHT501128
2-metilbutano Sigma-Aldrich320404Isopentano
3,3′-Diaminobenzidina tetracloridratoSigma-AldrichD5637
4% di paraformaldeideSigma-Aldrich441244
Albumina Sirica BovinaSigma-AldrichA9647
Acido citrico  SigmaC0759
Montante DPX per istologiaSigma-Aldrich  06522
EtanoloMerck1.00983
Glicole etilenicoSigma-Aldrich102466
GliceroloSigma-AldrichG7893
Soluzione di perossido di idrogenoSigma-AldrichH1009
Killik - Complesso O.C.T.Bio-ottica  05-9801
Software MesquiteProgetto MesquiteMesquite versione 3.81 (build 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Fosfato tamponato (PB)nanaPersonalizzati
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)nanaPersonalizzati
Idrossido di sodioRiedel-de Haen6213
Diidrato di fosfato di sodioSigma-Aldrich71645
Diidrato monobasico fosfato di sodioSigma-Aldrich71500
SucrosioSigma-AldrichS9378
Blu ToluidinaSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Preadolescenti 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Peroxidasi (Standard)Laboratori VectorPK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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