È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Immunocolorazione a montatura intera delle ovaie fetali e neonatali del topo

286 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

28 aprile 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per l'immunomarcatura a montaggio completo delle ovaie del topo in via di sviluppo, con applicazioni ad altri piccoli tessuti.

Abstract

La riserva ovarica è costituita dagli ovociti disponibili per la riproduzione femminili e si trovano nei follicoli primordiali, ciascuno contenente un ovocita circondato da diverse cellule di granulosa. Gli ovociti iniziano come cellule germinali primordiali che si formano all'esterno della gonade e migrano verso l'ovaio in via di sviluppo durante lo sviluppo embrionale. Una volta raggiunto l'ovaio, diventano oogonia e si dividono per mitosi, con citocinesi incompleta, formando gruppi di cellule interconnesse chiamate cisti germinali. Durante la presenza delle cisti, le cellule entrano in meiosi e diventano ovociti. Nel topo, due giorni prima della nascita, le cisti iniziano a disgregarsi e ogni ovocita viene confezionato in un follicolo primordiale. Solo alcuni ovociti sopravvivono durante questo processo, gli altri subiscono apoptosi. La regolazione della degradazione delle cisti e della formazione dei follicoli primordiali è solo parzialmente compresa, e identificare le molecole coinvolte è fondamentale per comprendere questo processo. L'immunocolorazione a montaggio intero delle ovaie del topo in via di sviluppo può essere utilizzata per determinare la localizzazione di potenziali molecole regolatorie e per valutare gli effetti sulla formazione dei follicoli primordiali dovuti a mutazioni o altri cambiamenti molecolari utilizzando marcatori oovociti e cellulari somatiche. Le ovaie vengono prelevate da topi fetali o neonatali, fissate nel formaldeide e bloccate. Le ovaie vengono quindi esposte ad anticorpi contro una proteina di interesse, seguite da anticorpi secondari coniugati a un tag fluorescente che rileva gli anticorpi primari. Infine, le ovaie vengono montate ed esaminate tramite microscopia confocale. Questa procedura può rilevare molteplici proteine di interesse e può essere applicata ad altri piccoli tessuti, come i testicoli del topo fetale.

Introduzione

L'immunocolorazione a montaggio intero combinata con imaging confocale è un metodo potente per analizzare l'espressione proteica e la morfologia cellulare nei tessuti piccoli senzasezionare 1. In questo metodo, i tessuti vengono prima prelevati, fissati e bloccati, e poi esposti ad anticorpi contro le proteine di interesse. Gli anticorpi sono o direttamente coniugati con fluorofori oppure seguiti da una marcatura con anticorpi secondari coniugati con fluorofori che riconoscono gli anticorpi primari. Il tessuto viene quindi incubato con il colorante fluorescente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare i nuclei cellulari. Questo passaggio è importante per fornire un orientamento spaziale durante l'imaging del tessuto. Infine, il tessuto viene montato e visualizzato tramite microscopia confocale. Un'altra tecnica utilizzata per studiare la morfologia tissutale prevede l'inserimento del tessuto nella paraffina, la sezionamento e la marcatura con coloranti come ematossilina ed eosina o con anticorpi. In alternativa, si possono preparare sezioni congelate e immunocolorare. Purtroppo, entrambe queste tecniche prevedono la sezionamento, che comporta la perdita di informazioni tridimensionali. Sebbene le sezioni seriali possano aiutare, l'analisi è noiosa e comporta la visione di un gran numero di sezioni. Pertanto, il metodo di montaggio completo è vantaggioso poiché preserva la struttura tridimensionale del tessuto che può essere visualizzata tramite sezionamento ottico.

Lo sviluppo delle cellule germinali primordiali (PGC) in ovociti e l'assemblaggio degli ovociti nei follicoli primordiali sono essenziali per la fertilità femminile. Le PGC si formano in modo extraembrionale e devono migrare verso l'ovaio durante lo sviluppo embrionale. Una volta che i PGC arrivano all'ovaio, a partire approssimativamente dal giorno embrionale (E) 10,5 nel topo, vengono classificati come oogonia2. Gli oogonia subiscono mitosi ma con citocinesi incompleta, formando gruppi interconnessi di cellule chiamate cistigerminali 3. Gli oogonia entrano in meiosi a partire da E 13.5 per diventare ovociti e progredire attraverso la profase I fino allo stadio diplotene. Man mano che gli ovociti si sviluppano, le cisti si rompono, permettendo a ciascun ovocita di essere circondato da uno strato di cellule di granulosa, formando follicoli primordiali, ciascuno contenente un ovocita4 bloccato da diplotene. Si verifica una perdita di un gran numero di ovociti in concomitanza con la degradazione delle cisti, e si ritiene che questo sia importante per il controllo della qualità durante la formazione dei follicoli primordiali. Il numero di ovociti arrestati da diploteni nei follicoli primordiali costituisce la riserva ovarica di ovociti disponibili per la riproduzione ed è direttamente correlato alla fertilità. Se la formazione dei follicoli viene interrotta, ciò potrebbe portare a una riserva ovarica più ridotta, limitando la durata della vita riproduttiva femminile.

L'immunocolorazione a montaggio intero è stata utilizzata per identificare e analizzare l'espressione delle proteine durante lo sviluppo embrionale, fetale e neonatale degli ovociti. Le molecole esaminate includono MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT e STAT3 5,6,7,8,9. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata anche per scoprire come viene regolata la formazione dei follicoli primordiali. Le ovaie fetali o neonatali sono state coltivate ed esposte a molecole di segnalazione o inibitori. Gli ovociti nelle ovaie coltivate subiscono la formazione di follicoli primordiali in modo simile a quello invivo 10. La coltura ovarica è stata utilizzata con successo per esaminare la segnalazione dell'ormone steroideo 6,10,11, KIT 8 e PI3K12 durante questa fase dello sviluppo ovarico. Dopo la coltura, viene impiegata l'immunocolorazione a montatura intera utilizzando anticorpi contro l'elicase DEAD box 4 (DDX4, nota anche come omologo vasa del topo (MVH)), una proteina espressa nel citoplasma degli ovociti. Le ovaie vengono quindi esaminate tramite microscopia confocale per valutare la formazione dei follicoli primordiali.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure con topi sono state esaminate e approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Syracuse University (IACUC). Il seguente protocollo riguarda l'etichettatura delle ovaie neonatali del topo nei giorni post-natale 1–5 (vedi Figura 1 per lo schema). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Prelievo e riparazione delle ovaie

  1. Eutanasiate i topi neonatali C57BL/6 seguendo la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" dei National Institutes of Health e i protocolli sugli animali approvati dall'IACUC. Dissezionare le ovaie in una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    NOTA: Per questa procedura, i topi neonatali sono stati soppressi per decapitazione come approvato dal nostro protocollo IACUC sugli animali. Maschi e femmine della linea di topo C57BL/6 possono essere distinti nei neonati per la presenza di una piccola macchia scura tra le aperture anogenitali nei maschi. Per sezionare le ovaie, prima taglia lo stomaco e scava l'intestino. Poi, apri l'addome con un'incisione mediana sulla coda e fai due tagli orizzontali. Individua le ovaie sotto ciascun rene, isola ogni ovaio e rimuovi il tessuto in eccesso.
  2. Inserire le ovaie direttamente in 600 μL 5,3% paraformaldeide (PFA; PFA di grado EM al 16% diluito in 1x PBS) (fissare) in un tubo di microfuge a temperatura ambiente (RT). Incubare le ovaie fisse su un nutatore durante la notte (O/N) a 4 °C.
    ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico. Da usare in una cappa o in un ambiente ben ventilato. Indossa guanti, protezione per gli occhi e indumenti di protezione per evitare il contatto con pelle e occhi. Smaltire come rifiuti pericolosi.
  3. Rimuovi le ovaie due volte in 1 mL 0,1% Triton X-100 in 1 PBS (PT) rapidamente, poi una volta ogni 1 mL PT sul nutator per almeno 30 minuti a RT. Incuba in 1 mL PT + 5% BSA (blocco) per almeno 30 minuti in RT su nutator o conserva a 4 °C per fino a 2 settimane.

2. Incubazione con anticorpi primari e secondari

  1. Incubare con anticorpi primari diluiti in 500 μl PT + 5% BSA O/N a 4 °C sul nutatore. Lavare tre volte in 1 mL PT + 1% di BSA, 30 minuti a RT con nutator.
    NOTA: La diluizione dipende dall'anticorpo. I dati rappresentativi qui mostrati sono etichettati con DDX4 diluito 1:200. Gli anticorpi contro due proteine diverse possono essere usati contemporaneamente purché gli anticorpi primari siano prodotti in due specie diverse e un secondario non sia prodotto nella specie riconosciuta dall'altro secondario (non usare anti-topo per capra - Alexa 488 e anti-asino - Alexa 568).
  2. Durante l'incubazione delle ovaie con anticorpo primario, incubare un anticorpo secondario diluito con un pizzico di polvere embrionale in 500 μL PT + 5% BSA O/N a 4 °C su nutator (coperto con un foglio) per ridurre il legame aspecifico dell'anticorpo secondario. Centrifugare l'anticorpo secondario a 6000 x g per 30 secondi per raccogliere la polvere residua sul fondo. Assicurati di non prelevare questi residui quando si trasferisce in modo secondario al tubo campione.
    NOTA: La diluizione dipende dall'anticorpo. I dati rappresentativi qui mostrati sono etichettati con anti-coniglio per capre Alexa 488 diluita 1:200.
  3. Incubare con anticorpo secondario fluorescente preassorbito (prodotto nello step 2.2) per 2–4 ore a RT sul nutatore. Copri con la carta stagnola da quel momento in poi. Lava tre volte in 1 mL PT + 1% di BSA, per 30 minuti a RT su un nutator.

3. Marcatura dei nuclei con DAPI e montaggio delle ovaie su un vetrino

  1. Incubare in DAPI 1:1000 in PBS per 90 minuti a RT. Lavare una volta con 1 mL 1x PBS.
  2. Trasferire le ovaie su un vetrino al microscopio utilizzando una punta ampia di micropipetta da 200 μL. Rimuovere l'eccesso di PBS con ago o siringa. Aggiungi 3 gocce di supporto di montaggio sulle ovaie.
  3. Applica delicatamente una copertura sopra le ovaie, assicurandoti che il materiale di montaggio si diffonda ai bordi della copertura. Sigilla i bordi del copertino con lo smalto e lascia asciugare lo smalto, poi conserva a -20 °C.

4. Preparazione della polvere embrionale

  1. Omogeneizzare ~ E 12,5–E 14,5 embrioni di topo in un volume minimo di 1x PBS gelido. Aggiungi 4 volumi di acetone gelato, mescola e incuba sul ghiaccio per 30 minuti.
    ATTENZIONE: L'acetone è infiammabile e irritante per occhi e pelle. Da usare in una cappa o in un ambiente ben ventilato. Indossa guanti, protezione per gli occhi e indumenti di protezione per evitare il contatto con pelle e occhi. Smaltire come rifiuti pericolosi.
  2. Centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti, rimuovere il surnante, poi lavare il pellet con acetone gelato e girare di nuovo.
  3. Spargere il pellet su un foglio di carta filtrante, mettilo in un vassoio di plastica e lascia asciugare gli O/N in un cappuccio chimico. Macinare fino a diventare una polvere fine, lasciare asciugare completamente all'aria e conservare a -20 °C.

5. Analisi dell'espressione proteica tramite microscopia confocale

  1. Dopo aver marcato la proteina di interesse, visualizzarla con microscopia confocale. Per esaminare l'espressione proteica, tipicamente utilizziamo 3–4 animali (6–8 ovaie) e scattiamo diverse immagini di ciascun ovaio.
    NOTA: Le immagini descritte nella sezione dei risultati rappresentativi sono state ottenute con un microscopio confocale a disco rotante o su un microscopio a scansione laser confocale. I parametri utilizzati sono descritti nella sezione dei risultati rappresentativi e varieranno a seconda del microscopio utilizzato.

6. Analisi della formazione e dello sviluppo dei follicoli primordiali tramite microscopia confocale

  1. Dopo aver etichettato le ovaie per un marcatore oocitario citoplasmatico come DDX4, per ciascun ovaio, assegna casualmente due aree o "nuclei" per la visualizzazione.
    NOTA: Un nucleo è composto da 4 sezioni ottiche principali di 212 × 212 μm e ciascuna separata da una profondità di 15–20 μm. Le 4 sezioni ottiche si estendono sia sulla corteccia che sul midollo per garantire che tutte le regioni dell'ovaio siano valutate. Per ogni ovaio, ci saranno 2 nuclei con 4 sezioni ottiche, per un totale di 8 sezioni (vedi Figura 2).
  2. Dopo aver fotografato la sezione ottica principale per l'analisi, si può fare una pila Z di 5 immagini sopra e 5 immagini sotto la sezione principale, ciascuna distanziata da 1 μm. Per ogni sezione principale, si conta il numero totale di ovociti nella sezione
  3. Poi, per ogni ovocita nella sezione principale, si determina se è associato a un altro ovocita o meno esaminando la sezione principale e anche la pila di sezioni per determinare se gli ovociti nella sezione principale erano associati a ovociti sopra o sotto il piano di fuoco. Infine, per ogni singolo ovocito, determina a quale stadio dello sviluppo del follicolo si trova (primordiale, primario o secondario).
    NOTA: Si raccomanda di analizzare almeno 4 animali (8 ovaie) per ottenere dati statisticamente significativi.

7. Utilizzo di ioduro di propidio come marcatore nucleare alternativo

  1. Dopo lo step 2.3, incubare per 30 minuti con 0,1 mg/ml RNasi A (10 μL di 10 mg/ml in 1 mL di PT + 1% di BSA). Rimuovere RNasi A e incubare in 10 μg/mL di propidio ioduro (10 μL di 1 mg/mL in 1 mL PT + 1% BSA) per 20 minuti a RT su un nutator. Copri il tubo con la stagnola da questo punto in poi.
    ATTENZIONE: Il propidio ioduro è tossico e mutagenico. Da usare in una cappa o in un ambiente ben ventilato. Indossa guanti, protezione per gli occhi e indumenti di protezione per evitare il contatto con pelle e occhi. Smaltire come rifiuti pericolosi.
    NOTA: Toto-3 può anche essere usato come marcatore nucleare.
  2. Rimuovere il propidio ioduro e lavare per 30 minuti con 1 mL PT + 1% di BSA. Salta il passaggio 3.1 (colorazione DAPI).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Sono mostrati i risultati tipici del metodo di immunocolorazione descritto qui. Le immagini nelle Figure 3, 4, 5 e 6 sono state scattate con un microscopio confocale a disco rotante utilizzando un obiettivo olio a 40x, NA 1.3, con un tempo di esposizione tra 100 e 250 ms e potenza laser compresa tra 0,01 e 0,1%. Nella Figura 3

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo rapporto descrive un metodo per marcare con fluorescenza ovaie intere per le proteine di interesse. Questa procedura è stata ampiamente utilizzata per determinare l'espressione delle proteine durante la formazione del follicolo primordiale e anche per caratterizzare i cambiamenti nella formazione dei follicoli in condizioni diverse 4,5,6,7,8,9,10,11.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

L'imaging è stato eseguito presso il Blatt Imaging Center della Syracuse University. Le immagini nella Figura 7 sono state ottenute da uno Zeiss LSM980 con Airyscan2 supportato da NIH S10 OD026946-01A1. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R03 HD102016 e R21 HD112756 dal NIH (al MEP).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anti-umano VASA (prodotto in capra)R& DAF2030
anti-DDX4/MVH (realizzato in coniglio)Abcamab13840
anti-GCNA1/TRA98 (prodotto in ratto)Abcamab82527
Albumina Sirica Bovina (BSA)FisherBP-1600
Stuoi di copertura 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (polvere)Sigma AldrichD-9542preparare una soluzione da 5 mg/ml in dH2O
Ambito di dissezione
Alexa 568 anti-Goat AsinoInvitrogenA11057
Alexa 488 anti-Mouse per asiniInvitrogenA21202
Anti-Coniglio Alexa 568InvitrogenA10042
Anti-Coniglio Alexa 647InvitrogenA31573
Alexa 488 anti-Ratto di AsinoInvitrogenA21208
Proof di etanolo 200Pharmco111000200
Forbici Fine - AffilateStrumenti scientifici di qualità14060-09per lavori fini rimuovendo ovaie e ripotando il tessuto in eccesso
Pinza (Pinza Dumont, Stile 5)Scienza della microscopia elettronica72705-01 (0209-5-PO)
Goat anti-Rabbit Alexa 488InvitrogenA11008
Tubi microcentrifuga 1,5 mLThermo Scientific3451PK
Vetri per microscopioFisherbrand12-550-123
Mixer di nutazioneLabNetS0500
Paraformaldeide 16%Scienza della microscopia elettronica15710
Piastre di Petri 100 x 15 mmProduzione di bioplasti940-10774
Soluzione salina tamponata con fosfato 1X(Fisher) S271-1;                   (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O                            80 g NaCl                                        2.0 di KCl                                                14,4 g Na2HPO4                  2,4 g KH2PO4                  Regolare il pH a 7,4 con HCl; volume finale 1 L Poi diluire da 10X a 1X per l'uso
PortaspilliStrumenti scientifici di qualità26016-12per tenere l'ago dritto piegato in una leggera curvatura
Punte per filtro a pipettaOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
Punte per pipetteOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
Pipette 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0.1-2 uL) F144054M;       (2-20 uL) F144056M;     (20-200 uL) F144058M;       (100-1000 uL) F144059M
Propidio ioduro, 1mg/ml in dH2OInvitrogenP3566
Polvere RNase ASigma AldrichRG513-50mgpreparare una soluzione da 10 mg/ml in acetato di sodio 0,1 M (pH 5,2). Riscalda a 100 oC per 15 minuti. Raffreddare fino a RT e regolare il pH aggiungendo 0,1 volume di 1 M Tris-Cl (pH 7,4)
Ago drittoago dritto piegato in una curva per recidere tessuto in eccesso dall'ovaio
Triton X-100Thermo ScientificX100-100ML
Siringa per tubercolina 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
VectashieldLabratori vettorialiH-1900
Forbici di WagnerStrumenti scientifici di qualità14068-12Per la decapitazione e i tagli più grandi
Punta a pipetta a largo calibro 20 ulLabCon1026-965-008-9

Riferimenti

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Follicoli primordialicisti di cellule germinalimarcatori degli oocitimarcatori delle cellule somatichemicroscopia confocaleovaie fetali di topoformazione dei follicoli

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.