Articolo di revisione

Multi-omica e analisi integrativa nella scoperta di prodotti naturali

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DOI:

10.3791/69458

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28 novembre 2025

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1Department of Oncology, Deyang People's Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Laboratory of Translational Medicine Research, Deyang People's Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical Sciences, University Sains Malaysia, 4Inflammation & Allergic Diseases Research Unit, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University

In questo articolo

Sommario

Questa revisione enfatizza metodologie multi-omiche all'avanguardia, inclusi metabolomica, genomica, trascrittomica e proteomica, integrate con intelligenza artificiale e apprendimento automatico, nonché analisi di reti, per migliorare la scoperta e la validazione funzionale di nuovi prodotti naturali.

Abstract

I prodotti naturali (NP) sono da tempo una fonte essenziale di nuovi composti bioattivi per la scoperta di farmaci; tuttavia, i metodi tradizionali per lo screening e l'isolamento di questi composti possono essere lenti e spesso produrre rendimenti decrescenti. Fortunatamente, approcci avanzati multi-omici e computazionali offrono soluzioni potenti a queste sfide. Questa revisione mette in evidenza metodologie innovative che integrano metabolomica, genomica, trascrittomica e proteomica con bioinformatica e chimica analitica per accelerare la scoperta delle NP. Ad esempio, piattaforme metabolomiche non mirate come cromatografia liquida ad alta risoluzione con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e il networking molecolare Global Natural Products Social (GNPS) permettono una profilazione completa di nuovi composti, mentre strategie mirate di marcatura isotopica migliorano questo processo. Inoltre, strumenti di estrazione genomica e metagenomica come antibiotici e shell di analisi dei metaboliti secondari (antiSMASH), Deep Biosynthetic Gene Cluster (DeepBGC) e Pipeline for Reconstructing Integrated Syntheses of Metabolites (PRISM) identificano rapidamente cluster genici biosintetici (BGC) sia in organismi coltivati che non coltivati, spesso utilizzando espressioni eterologhe per convalidare i prodotti. Le analisi trascrivomiche, inclusi il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq), le reti di co-espressione e la fluxomica, aiutano a chiarire come le vie siano regolate, mentre le tecniche di proteomica quantitativa come i tag di massa tandem/tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta (TMT/iTRAQ) e i metodi senza marcatori, insieme ad approcci chemoproteomici come il saggio di spostamento termico cellulare e il profilaggio del proteoma termico (TPP), scoprono bersagli molecolari e i loro meccanismi d'azione. Questa revisione pone inoltre un'enfasi significativa sul ruolo dell'intelligenza artificiale (IA) e del machine learning (ML) nell'integrazione dei dati multi-omici, che spazia da attività che vanno dalla costruzione di reti di correlazione genico-metaboliti all'utilizzo di grafi di conoscenza e reti neurali a grafi per la fusione dei dati e la previsione funzionale. Infine, questa revisione si conclude discutendo i benefici sinergici della multi-omica per la scoperta di prodotti naturali, affrontando le sfide tecniche attuali ed esplorando le future direzioni verso un'integrazione intelligente e ad alta produttività per la ricerca NP di nuova generazione.

Introduzione

I prodotti naturali, che sono molecole prodotte da vari organismi, inclusi microbi e piante, sono da tempo una fonte vitale di medicinali, che spaziano da antibiotici come la penicillina a farmaci anticancerosi come il Taxol. Una parte significativa dei nostri attuali antibiotici e agenti chemioterapici deriva da questi compostinaturali 1. Tuttavia, i metodi tradizionali utilizzati per scoprire nuovi NP, come la coltivazione dei microbi e l'uso dell'isolamento guidato da bioassay, sono diventati sempre più difficili. Alla fine del XX secolo, l'interesse farmaceutico per i PN diminuì mentre le aziende affrontavano rendimenti decrescenti; molti composti facili da trovare erano già stati riscoperti, e le sfide tecniche associate allo screening e alla caratterizzazione di questi composti rendevano il processo laborioso. Fortunatamente, questa tendenza ora si sta invertendo. I recenti progressi nelle tecnologie omiche e analitiche stanno rivitalizzando la ricerca dei NP 2,3. Ad esempio, il sequenziamento del DNA ad alto rendimento permette ai ricercatori di esplorare genomi per cluster genici biosintetici nascosti (BGC), mentre la spettrometria di massa ultra-sensibile (MS) può identificare piccole quantità di nuovi metaboliti all'interno di miscele complesse. Queste innovazioni tecnologiche arrivano in un momento cruciale, poiché c'è un'urgente domanda globale di nuove terapie, in particolare antibiotici che possono combattere i batteri resistentiai farmaci 4. La ricerca moderna sugli NP sta emergendo per affrontare questa sfida integrando l'esperienza tradizionale nei NP con tecniche all'avanguardia di analisi genomica e chimica.

L'integrazione multi-omica è centrale per i progressi attuali nella ricerca biologica. Il concetto di "multi-omics" prevede l'analisi simultanea di vari strati di dati biologici, come il DNA (genoma) di un organismo, i trascrivertiti di mRNA, le proteine e i metaboliti. L'applicazione degli approcci omici ha trasformato la ricerca sugli NP, permettendo screening ad alta produttività, l'identificazione rapida di nuovi composti e un'esplorazione più approfondita delle intricate reti che plasmano i sistemibiologici 5. Integrando questi dataset multilivello, i ricercatori possono collegare direttamente i geni ai metaboliti che codificano, costruendo così una comprensione più completa della biosintesi6 degli NP. Ad esempio, gli algoritmi di estrazione genomica possono individuare un gruppo di geni che potrebbe codificare un nuovo antibiotico, mentre i dati trascrittomici possono indicare se quei geni sono attivamente espressi. Inoltre, il profiling metabolomico può identificare la corrispondente molecola antibiotica nell'estratto della coltura dell'organismo 7,8,9. Questo approccio integrato accelera significativamente la scoperta di nuovi composti e la comprensione delle loro vie biosintetiche. Ancora più importante, l'identificazione dei bersagli di farmaci si basa sempre più su approcci integrati multi-omici, che stanno gradualmente soppiantando le strategie tradizionali di singolaomica 10. I recenti progressi nella chimica analitica, tra cui la cromatografia liquida ad alta risoluzione (LC-MS) e la risonanza magnetica nucleare (NMR), permettono ai ricercatori di rilevare e analizzare strutturalmente nuovi NP da campioni biologici complessi11,12. Queste tecniche producono enormi quantità di dati, ed è proprio qui che bioinformatica e machine learning (ML) diventano essenziali. Gli algoritmi di intelligenza artificiale (IA) e le analisi basate su rete sono sempre più utilizzati per analizzare dati multi-omici, scoprendo schemi e previsioni significative che sarebbero difficili da discernere manualmente13,14. Fondendo tecnologie omiche all'avanguardia con il data mining guidato dall'IA, i ricercatori possono ora creare una pipeline robusta per la scoperta e l'analisi più rapida e sistematica dei NP che mai.

Sebbene le strategie multi-omiche abbiano significativamente fatto avanzare la scoperta dei NP, la loro implementazione di successo si basa fortemente su una pianificazione sperimentale meticolosa. Ad esempio, il tipo e la qualità dei campioni sono cruciali; È essenziale raccogliere colture microbiche ben conservate, isolati ambientali o materiali clinici in condizioni che minimizzino la degradazione di acidi nucleici emetaboliti 15. La profondità del sequenziamento gioca anche un ruolo fondamentale nella risoluzione dei dati: il sequenziamento dell'intero genoma generalmente richiede una copertura di almeno il 30× per un assemblaggio accurato, mentre il profiling trascritomico spesso richiede decine di milioni di letture per identificare i trascritti a bassa abbondanza, come raccomandato da Genohub16. Inoltre, per la metabolomica, sono necessari solventi e metodi di estrazione appropriati per catturare diverse classi chimiche; Si dovrebbero scegliere consapevolmente protocolli di estrazione che minimizzino il bias e massimizzino la riproducibilità17. Tuttavia, queste metodologie comportano una serie di sfide proprie. L'integrazione di grandi insiemi di dati eterogenei può richiedere un discorso computazionale, e l'instabilità o la bassa abbondanza di metaboliti possono complicare le analisi successive18. Inoltre, gli elevati costi o le dimensioni limitate dei campioni possono limitare la progettazione deglistudi 19. La contaminazione e il bias nei dati di sequenziamento, in particolare nei campioni a basso input o diluiti, rappresentano anch'essi rischi significativi, come evidenziato da Lusk et al. riguardo alla contaminazione nel sequenziamentoad alto rendimento 20. Riconoscendo queste limitazioni pratiche e tecniche, i ricercatori possono prendere decisioni informate sulle combinazioni multi-omiche appropriate e interpretarne i risultati con la dovuta cautela.

Questa revisione mette in evidenza i metodi innovativi che stanno rivoluzionando la scoperta dei NP attraverso l'uso di multi-omica e analisi integrativa. Esplora inoltre l'importanza crescente di ML e IA nel collegare questi vari flussi di dati, inclusa la costruzione di reti di correlazione genico-metaboliti e l'identificazione di cluster genici che probabilmente producono nuovi composti bioattivi. Inoltre, esamina il significato e il potenziale futuro di questo approccio integrato. In conclusione, la combinazione di diverse tecnologie omiche con analisi avanzate non solo sta accelerando la scoperta di nuovi NP oggi, ma sta anche aprendo la strada allo sviluppo di farmaci di nuova generazione di cui la società ha urgentemente bisogno.

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Revisione e prospettiva

Per compilare questa revisione, abbiamo effettuato una ricerca completa nella letteratura su molteplici database e piattaforme di indicizzazione, tra cui PubMed, Scopus, Web of Science, ScienceDirect e Google Scholar. La ricerca ha coperto pubblicazioni da gennaio 2015 a luglio 2025. Le parole chiave e le combinazioni booleane includevano: "scoperta di prodotti naturali", "omici", "metabolomica", "genomica", "trascrittomica", "proteomica", "apprendimento automatico", "intelligenza artificiale", "cluster genici biosintetici" e "integrazione multi-omica." Sono state inoltre esaminate le liste di riferimenti degli articoli chiave e delle recensioni recenti per identificare ulteriori pubblicazioni rilevanti. Oltre agli studi peer-reviewed, è stato consultato un numero limitato di articoli preprint provenienti da piattaforme come bioRxiv e medRxiv quando fornivano approfondimenti tempestivi e rilevanti non ancora disponibili nella letteratura pubblicata. Tutte le preprint sono chiaramente etichettate per mantenere la trasparenza. Questa sezione esamina gli ultimi sviluppi e le prospettive future nelle aree chiave della scoperta degli NP basati sull'omica, concentrandosi in particolare su metabolomica, genomica, trascridemica e proteomica. Così come la loro integrazione tramite AI/ML. Gli strumenti e le risorse principali discussi in questi campi sono raccolti per riferimento nella Tabella 1.

1. Metabolomica nella scoperta dei NP

  1. Piattaforme analitiche per la metabolomica
    La metabolomica è fondamentale per scoprire le NP poiché consente un'analisi dettagliata delle piccole molecole generate da vari organismi. Gli strumenti analitici principali utilizzati per caratterizzare i metabolomi delle NP includono tecniche MS ad alta risoluzione, come LC-MS/MS e cromatografia a gas-MS (GC-MS), insieme alla spettroscopiaNMR 21,22. I flussi di lavoro LC-MS/MS non mirati, come il LC-MS ultra-altissimo abbinato a MS/MS, permettono l'identificazione di un'ampia gamma di metaboliti in miscele complesse, mentre GC-MS eccelle nel profilare composti volatili. Inoltre, nuovi metodi come la sclerosi multipla a infusione diretta e l'imaging SM stanno migliorando il toolkit di metabolomica per gli NP23,24. Tecniche avanzate di spettrometria di massa, inclusa la multimodale MS, che combina modalità ioniche positive e negative o impiega frammentazione MSn a più stadi, e metodi tratteggiati come LC-MS abbinati alla NMR, offrono approfondimenti strutturali più profondi sui metabolitirilevati 25,26.
  2. Strumenti di elaborazione dei dati e calcolo
    Gli strumenti software specializzati svolgono un ruolo cruciale nell'elaborazione e nell'interpretazione dei dati metabolomici. Programmi come XCMS, MZmine e OpenMS sono comunemente utilizzati per rilevare e allineare caratteristiche cromatografiche, o picchi, mentre passaggi meticolosi di preprocessing dei dati come l'allineamento, la normalizzazione e il filtraggio dei picchi sono essenziali per ottenere profili metaboliciriproducibili 27. L'identificazione dei composti è supportata dalle librerie spettrali MS/MS, inclusi NIST e mzCloud, così come da strumenti di frammentazione in silico come SIRIUS e MetFrag28. La piattaforma Global Natural Products Social (GNPS) è emersa come una risorsa chiave per il networking molecolare, che organizza spettri MS/MS correlati per enfatizzare le famiglie chimiche e facilitare la dereplicazione di compostinoti 29. Ad esempio, un'analisi utilizzando GNPS su dati di LC-MS/MS provenienti da colture di Streptomyces ha identificato con successo antibiotici noti come spiramicina e actinomicina, insieme ad analoghi precedentemente nonriportati 30,31. La tecnica del networking molecolare raggruppava efficacemente spettri sconosciuti correlati, e l'aggiunta del networking a identità ionica migliorò la connettività delle caratteristiche. Queste analisi basate su reti, se combinate con strumenti statistici multivariati come l'analisi a componenti principali e l'analisi discriminante a minima quadrata parziale ortogonale, così come l'analisi di reti di correlazione, possono collegare i modelli di produzione di metaboliti a specifiche condizioni biologiche o ambientali. In uno studio particolare, il networking molecolare GNPS di estratti di fermentazione da Streptomyces associato alla pianta ha mostrato profili metabolitici distinti che variavano a seconda del mediatore di crescita utilizzato. Sono stati rilevati metaboliti noti, tra cui spiramicina, actinomicina e un composto cancerogeno chiamato lyngbyatoxin; tuttavia, molti nodi di rete non corrispondevano a nessuna voce nei databasespettrali 32. Questa scoperta suggerisce la presenza di metaboliti veramente nuovi, evidenziando come la metabolomica non mirata, insieme al GNPS, possa identificare potenzialmente nuovi NP per ulteriori esplorazioni.
    Combinare lo screening metabolomico con i bioassahi funzionali facilita la rapida priorità di ceppi o estratti che producono composti bioattivi. Inoltre, risorse comunitarie emergenti come l'Atlante dei Prodotti Naturali (NPAtlas), insieme a pipeline integrate di analisi metaboloma-genoma, sono fondamentali nell'associare i metaboliti rilevati ai loro BGC negli organismi fonte33,34. Questa strategia integrativa consente ai ricercatori di correlare i segnali dei metaboliti con i dati genomici, migliorando così l'efficacia nell'identificare le NP e nel tracciarne le origini.

2. Scoperta della genomica nelle NP

Negli ultimi dieci anni, la ricerca sui NP microbici è entrata in una trasformativa "era del deep-mining", alimentata da progressi come il sequenziamento ad alta produttività, la sclerosi multipla ultra-sensibile ad alta risoluzione e gli approcci integratimulti-omici 35. Questi strumenti hanno spostato gli sforzi di scoperta da un isolamento fortuito a un'esplorazione mirata guidata dai dati. Le pipeline di estrazione del genoma, inclusi antiSMASH 7.0 e DeepBGC, ora permettono l'identificazione sistematica di BGC criptici, in particolare nei taxapoco esplorati 36,37.

  1. Sequenziamento ad alta velocità e assemblaggio ibrido
    Le tecnologie di sequenziamento del DNA ad alto rendimento, come il sequenziamento del DNA a lettura breve e alta produttività combinato con piattaforme di sequenziamento a lettura lunga, hanno trasformato significativamente lo studio genomico degli organismi che producono NP. Utilizzando strategie di assemblaggio ibrido che integrano sia letture lunghe che brevi, i ricercatori possono ottenere assemblaggi genomici ad alta contiguità, essenziali per catturare interi BGC all'interno di ungenoma 38. Inoltre, il sequenziamento metagenomico, che include il recupero di genomi assemblati nel metagenoma, amplia la scoperta dei BGC ai microbi non coltivati, permettendo agli scienziati di esplorare il DNA ambientale per il suo potenzialebiosintetico 39. Nei casi in cui i metodi convenzionali di assemblaggio genomico non riescono a risolvere cluster genici grandi o ripetitivi, tecniche basate su librerie, come le librerie di cosmidi o cromosomi artificiali batterici, possono essere utilizzate per isolare e clonare frammenti genomici sostanziali. Questo approccio facilita la caratterizzazione di cluster genici completi tramite sequenziamento miro o espressione eterologa, migliorando così la nostra comprensione della base genetica della biosintesidegli NP 40,41.
  2. Strumenti per l'estrazione del genoma
    Strumenti bioinformatici specializzati sono essenziali per analizzare i dati genomici al fine di identificare le firme distintive delle vie metaboliche secondarie. Programmi come antiSMASH, PRISM e DeepBGC svolgono un ruolo cruciale in questo processo rilevando automaticamente i BGC candidati. Lo fanno riconoscendo specifici domini biosintetici, come quelli associati a sintetasi peptidiche non ribosomiche, sintasi polichetidiche, vie peptidiche sintetizzate e post-traduzionali (RiPP) sintetizzate e post-traduzionali (RiPP) e ciclasi terpeniche, tra gli altri. Per facilitare la dereplicazione, database come MIBiG, che compila BGC noti e i loro prodotti, e NPAtlas, che cataloga NP noti, aiutano i ricercatori ad abbinare nuove sequenze o composti a esempiconsolidati 37,42,43. Algoritmi di clustering, come BiG-SCAPE, insieme a strumenti come CORASON, organizzano i BGC correlati in famiglie, offrendo una visione di rete della diversità biosintetica e facilitando l'identificazione di nuove famiglie di cluster attraverso confronti con quelleconosciute 44. Ulteriori analisi bioinformatiche, incluse ricerche BLAST e scansioni nascoste con modelli di Markov, possono prevedere le funzioni potenziali degli enzimi codificati all'interno di un BGC, mentre gli approcci genomici comparativi, come l'analisi della sintenia e la coevoluzione dei geni, aiutano a perfezionare queste previsionifunzionali 45. Inoltre, i dati genomici permettono l'annotazione di elementi regolatori legati alla biosintesi degli NP, inclusi promotori specifici per via e regolatoritrascrizionali 46. Queste intuizioni forniscono una base per l'ingegneria dei percorsi; ad esempio, tecniche di biologia sintetica come la clonazione a ricombinazione associata alla trasformazione e la ricombinazione Red/ET permettono ai ricercatori di catturare ed esprimere BGC silenziose o criptiche in un organismo ospite eterologo, attivando così la produzione dei lorometaboliti 47.
    Gli sforzi di estrazione del genoma hanno portato con successo alla scoperta di nuovi NP concentrandosi su segnali genetici specifici. Ad esempio, una ricerca sistematica di geni collegati alla resistenza agli antibiotici glicopeptidici ha rivelato diversi BGC insoliti previsti per codificare nuovi antibiotici. Questo metodo ha portato all'identificazione di due nuovi composti, la compstatina e la cobramicina, entrambi con meccanismi d'azione unici mirando alle autolisinebatteriche 48. In modo simile, l'esplorazione del microbioma umano per il contenuto genetico biosintetico ha prodotto un candidato antibiotico lipopeptidico noto come "humicin", riconosciuto per la sua potenziale efficacia contro Staphylococcus e Streptococcus specie49. In questi casi, i composti sono stati inizialmente identificati tramite metodi computazionali, con le loro strutture chimiche previste sulla base dei dati genomici. Successivamente, queste molecole predetti sono state sintetizzate chimiche e hanno dimostrato le attività antibiotiche attese, convalidando così la strategia di scoperta basata sul genoma. Su scala più ampia, il sequenziamento su larga scala di vari batteri, inclusi molti atti aminomiciti rari, sta scoprendo una ricchezza di cluster genici BGC "criptici" i cui prodotti rimangono sconosciuti. Ad esempio, le indagini sui genomi di Streptomyces hanno rivelato migliaia di BGCsnon caratterizzati 50. Un approccio emergente per collegare questi cluster di orfani a metaboliti reali prevede l'integrazione di analisi metabolomiche con indagini genomiche. Corcorrelando la presenza o l'espressione di un cluster genico con la rilevazione di caratteristiche metabolitiche uniche tramite piattaforme come GNPS o database spettrali di massa, i ricercatori possono iniziare ad assegnare prodotti chimici provvisori ai numerosi nuovi BGC, facilitando così la scoperta di NP veramente nuovi dai dati genomici.

3. Trascrittomica nella scoperta di prodotti naturali

Le analisi trascritomiche offrono una prospettiva dinamica sull'attività dei BGC misurando l'espressione dell'mRNA in varie condizioni. In particolare, gli esperimenti RNA-seq possono scoprire quali BGC vengono attivamente trascritti e come i loro livelli di espressione fluttuano in risposta a cambiamenti ambientali o sperimentali. Confrontando i livelli dei trascrizioni tra diverse condizioni, l'analisi dell'espressione differenziale, utilizzando strumenti come DESeq2 o edgeR, può individuare BGC che sono regolati all'alto o al basso, evidenziando così cluster genici che possono essere indotti o rimanere silenziosi nelle condizioni standard51. Sebbene l'approccio tipico per l'analisi dell'espressione di BGC sia il metodo convenzionale di RNA-seq su cellule coltivate in massa, tecniche più avanzate come il RNA-seq a singola cellula stanno iniziando a essere utilizzate nei microbiomi complessi. Questo cambiamento consente l'osservazione dell'espressione genica in organismi ambientali difficili dacoltivare 52,53. Un flusso di lavoro standard RNA-seq generalmente include la mappatura delle letture su un genoma di riferimento tramite aligner come STAR o HISAT2, la quantificazione dell'espressione genica con strumenti come featureCounts o Kallisto, e la normalizzazione dei dati per identificare cambiamenti significativi nell'espressione. Successivamente, l'analisi della rete di co-espressione, spesso eseguita con il pacchetto WGCNA, può raggruppare geni che mostrano schemi di espressione simili. Quando sono disponibili anche dati sui metaboliti, queste reti possono essere ulteriormente ampliate per incorporare metaboliti, collegando così composti specifici con genico-espressi 54.

I dati trascrivomici si sono dimostrati utili nell'identificare vie biosintetiche attive condizionalmente. Un esempio notevole di questo approccio si trova in un confronto dettagliato di quattro ceppi diSalinispora 51. In questo studio, è stato rivelato che più della metà dei BGC in ogni ceppo veniva espressa in una certa misura, con molti cluster inattivi in un ceppo che mostravano espressione in un altro. Analizzando i profili di espressione genica su questi ceppi, i ricercatori sono riusciti a individuare diversi fattori regolatori che sembravano silenziare o attivare specifici cluster. Questo metodo integrativo portò all'identificazione di una famiglia di NP precedentemente sconosciuta, nota come salinipostine. I dati trascritomici indicavano un cluster genico criptico come potenziale fonte di un composto non identificato; Quando questo gruppo è stato indotto a esprimersi (attraverso cambiamenti regolatori), ha portato alla produzione di molecole di salinipostina, che sono state successivamente isolate e caratterizzate strutturalmente. Questo studio esemplifica come la trascrittomica possa facilitare la scoperta delle NP: analizzando l'espressione genica differenziale, i ricercatori possono evidenziare i BGC candidati, e la correlazione tra espressione genica e profili metabolitici fornisce prove di supporto per relazioni gene-metaboliti che possono essere validate tramite esperimenti mirati.

4. Proteomica nella scoperta dei NP

  1. Approcci a fucile a pompa e proteomica mirata
    La proteomica, che prevede lo studio su larga scala delle proteine, offre una prospettiva fondamentale nella ricerca sugli NP misurando direttamente gli enzimi e le proteine che svolgono un ruolo nelle vie biosintetiche. Generalmente, gli approcci proteomici possono essere suddivisi in due tipi principali: proteomica a fucile a pompa (non mirata) e proteomica mirata. Nella proteomica shotgun, le proteine estratte da campioni microbici o vegetali subiscono una digestione enzimatica, tipicamente con tripsina, e i peptidi risultanti vengono analizzati utilizzando LC-MS/MS ad alta risoluzione, spesso impiegando spettrometri di massa avanzati come il quadrupolo time-of-flight (QTOF) o lo spettrometri di massa orbitaliad alta risoluzione 55. I dati sulla SM raccolti, noti come spettri MS/MS, vengono poi confrontati con sequenze peptidiche effettuando una ricerca in un database proteico derivato dal genoma dell'organismo o da una specie strettamente correlata, utilizzando strumenti software come MaxQuant o Mascot56,57. Questo processo consente la quantificazione dei cambiamenti nell'abbondanza proteica in diverse condizioni, che può essere ottenuta sia tramite metodi senza marcatura sia utilizzando tecniche di marcatura isotopica, come la marcatura stabile degli isotopi tramite amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) o la marcatura isobarica con reagenti TMT/iTRAQ, per determinare quali enzimi biosintetici sono regolati all'alto o verso il basso58, 59. Al contrario, i metodi di proteomica mirata, inclusi il monitoraggio delle reazioni selezionate (SRM) o il monitoraggio parallelo delle reazioni (PRM), si concentrano su un insieme specifico di ioni peptidici, spesso peptidi unici provenienti da enzimi biosintetici chiave o proteine regolatorie, permettendo una quantificazione precisa e sensibile di questi peptidi su piùcampioni 60,61.
  2. Approcci innovativi nella proteomica
    Una sfida significativa nell'analisi proteomica del metabolismo secondario è la rilevazione di grandi enzimi biosintetici, come sintetasi peptidiche non ribosomiche e polissintasi, che spesso superano i 100 kDa di dimensione e producono pochi peptidi rilevabili secondo protocolli digestionali standard, rendendoli difficili da osservare. Per affrontare questo problema, Bumpus et al. hanno sviluppato un metodo noto come PrISM, che migliora la rilevazione delle proteine NRPS e PKS utilizzando un cofattore specifico presente su questienzimi 62. PrISM integra la proteomica convenzionale a fucile a pompa con un saggio di espulsione con fosfofinanteteinil (Ppant). In particolare, gli enzimi NRPS e PKS possiedono un braccio Ppant collegato covalentemente ai loro domini portatori acilici o portatori peptidilici; durante la frammentazione MS/MS, questo gruppo protesico genera frequentemente un unico ionione frammento, chiamato ione "Espulsione di Ppant". Filtrando computazionalmente i dati LC-MS/MS per questo ione diagnostico, il metodo PrISM può evidenziare efficacemente peptidi derivati dagli enzimi NRPS e PKS all'interno della complessa miscela di tutte le proteine cellulari. Questa strategia ha scoperto con successo vie biosintetiche nascoste attraverso la proteomica. Ad esempio, il flusso di lavoro PrISM ha permesso il rilevamento di peptidi dal complesso gramicidina S sintetasi (GrsA/GrsB) in colture di Bacillus brevis, stabilendo un collegamento diretto tra questi enzimi NRPS e la produzione dell'antibiotico gramicidina S in quell'organismo62. È importante sottolineare che l'identificazione proteomica di GrsA/GrsB non ha reso necessaria una conoscenza genomica preliminare di B. brevis, dimostrando che in alcuni casi l'analisi proteomica da sola può scoprire vie biosintetiche attive delle NPs anche in organismi i cui genomi non sono ancora stati sequenziati.
  3. Proteomica informata dal genoma
    Quando è disponibile una sequenza genomica, la potenza della proteomica può essere significativamente potenziata utilizzando un database specifico per ceppi per l'identificazione dei peptidi. Ad esempio, in uno studio che analizza il proteoma di Streptomyces lilacinus, i ricercatori hanno condotto due analisi: una cercando spettri in un database proteico generale e un'altra in un database personalizzato derivato dal genoma sequenziato di quel ceppo63. L'analisi informata dal genoma ha prodotto circa dieci volte più peptidi identificati e ha rilevato peptidi legati a sei BGC distinti all'interno dell'organismo. In particolare, tre di questi cluster identificati corrispondevano a metaboliti "orfani" già conosciuti, tra cui graybactina, rakicidina D e uno specifico sideroforo, con i loro enzimi biosintetici confermati come espressi. I restanti ammassi rilevati sembravano nuovi e non caratterizzati. Questo esempio dimostra che integrare le informazioni genomiche nei flussi di lavoro proteomici può confermare quali vie biosintetiche sono attivamente espresse in un ceppo, dando così priorità a quei cluster genici per l'isolamento e la caratterizzazione dei loro prodotti.
    Inoltre, i metodi proteomici possono illuminare i bersagli molecolari e le modalità d'azione delle NP, un'area spesso chiamata proteomica chimica. Ad esempio, il profiling proteico basato sull'attività (ABPP) impiega sonde a piccole molecole, tipicamente derivate o analoghi delle NP, che reagiscono con i bersagli cellulari del composto, etichettando tali proteine per arricchimento e identificazione tramite MS64. Questa tecnica può scoprire i bersagli proteici a cui una specifica NP o molecola correlata si lega all'interno della cellula. Un altro metodo, il profiling termo-proteoma (TPP), consiste nel riscaldare campioni proteici in presenza o in assenza di un composto per determinare quali proteine mostrano una stabilità termica alterata, indicando un'interazione di legame65. Questi approcci proteomici chimici sono preziosi per validare i bersagli biologici delle NP e chiarire i loro meccanismi d'azione, integrando così la scoperta delle NP stesse.

5. ML e IA per l'integrazione e la previsione degli omici

  1. Integrazione di dati multi-omici con ML
    Un entusiasmante passo nella scoperta dei NP è l'applicazione di ML e IA per integrare dati omici per previsioni funzionali. Nel campo della genomica, algoritmi di ML supervisionati, inclusi foreste casuali, macchine a vettori di supporto e reti neurali profonde, sono stati sviluppati per identificare pattern nei BGC associati a tipi specifici di NP. Ad esempio, questi modelli ML possono categorizzare i BGC in base alla classe generale di molecole che producono o persino prevedere alcune caratteristiche della struttura chimica derivate dalla sequenza genica. Una revisione di Dason MS e colleghi evidenzia vari strumenti di ML progettati per decodificare il "linguaggio" dei BGC, utilizzando dati di sequenze di DNA o amminoacidi per dedurre le strutture e le bioattività dei corrispondenti NP66. Questi modelli si basano tipicamente su ampi database di cluster genici e composti noti per apprendere le relazioni tra di essi, permettendo previsioni sulla potenziale attività biologica di nuovi composti. Ad esempio, possono valutare se un prodotto di una BGC non caratterizzata possa possedere proprietà antibiotiche o antitumorali. Progressi significativi che hanno facilitato queste capacità includono l'utilizzo di grandi dataset di addestramento, come migliaia di strutture NP note e cluster genici, tecniche innovative di rappresentazione come embedding di sequenze e reti neurali a grafo che catturano le caratteristiche dei cluster genici e delle strutture chimiche, e modelli multiparametrici che combinano vari descrittori genomici e chimici per migliorare l'accuratezza della previsione.
    Nel campo della metabolomica, le tecniche di IA stanno migliorando significativamente l'interpretazione di dati spettrali di massa complessi. Un esempio notevole è lo strumento CSI:FingerID, che utilizza il ML per prevedere l'impronta strutturale di una molecola dal suo spettro MS/MS. Questa capacità aiuta a identificare metaboliti sconosciuti suggerendo potenziali sottostrutture e composti candidati67. Analogamente, i modelli di deep learning sono stati utilizzati per l'annotazione spettrale; le reti neurali convoluzionali e, più recentemente, le architetture basate su transformer, come il modello "DreaMS", apprendono i pattern di frammentazione da ampie librerie spettrali. Questi modelli possono proporre strutture per spettri sconosciuti basandosi sui modelli appresi, spesso superando i metodi euristici tradizionali, in particolare per i metaboliti che non hanno corrispondenze esatte nei database esistenti68. Oltre all'annotazione strutturale, il ML contribuisce anche alla metabolomica identificando i pattern globali. Ad esempio, algoritmi di visualizzazione non supervisionata come t-SNE (t-distributed stocastic neighbor embedding) e UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) possono ridurre la dimensionalità dei dataset di metabolomica non mirati, facilitando il raggruppamento dei campioni in base alle somiglianze nei loro profili metabolitici. Nel frattempo, i classificatori supervisionati possono collegare specifiche firme metabolitiche ai tratti fenotipici o alle bioattività dei campioni, arricchendo ulteriormente l'analisi69,70,71.
    Il ML viene sempre più utilizzato per integrare vari dataset omici, creando una comprensione più completa della biosintesi e della funzione degli NP. Unendo dati provenienti da genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica, i modelli integrativi possono rivelare connessioni che potrebbero essere trascurate esaminando ogni tipo di dato separatamente. Ad esempio, i ricercatori possono costruire reti di correlazione genico-metaboliti che colleghino i livelli di espressione di geni o proteine ai livelli di produzione dei metaboliti. I modelli ML addestrati su questi dati integrati possono quindi prevedere quali cluster genici sono probabilmente responsabili di metaboliti specifici o attività biologiche72,73. Tecniche avanzate multivariate, come l'analisi fattoriale multi-omica (disponibile in strumenti come MOFA) e i metodi regolarizzati multivariati (presenti in pacchetti come mixOmics), facilitano l'identificazione di fattori latenti che comprendono diversi tipi di dati, come un insieme di geni co-espressi insieme a un gruppo di metaboliti coesistenti74,75,76. In termini pratici, per la scoperta degli NP, vari approcci aiutano a dare priorità ai cluster genici candidati dimostrando una connessione con metaboliti o fenotipi osservati. Un esempio notevole di questa strategia integrativa guidata dall'IA è la scoperta di una nuova famiglia di RiPPs sintetizzati ribosomialmente e RiPP utilizzando l'algoritmo DecRiPPter. Questo algoritmo utilizza un modello basato su macchina a vettori di supporto (SVM) per analizzare dati genomici di peptidi precursori criptici di RiPP e poi incrocia queste previsioni con analisi pan-genomica per escludere composti noti. Se applicato a 1.295 Streptomyces genomi, DecRiPPter identificò con successo 42 presunte nuove famiglie di RiPP che erano state precedentemente trascurate dai metodi tradizionali di estrazione genomica. Tra questi cluster previsti, uno è stato convalidato sperimentalmente per produrre un nuovo lantipeptide di classe V, che i ricercatori hanno chiamato "pristinina A3". Inducendo l'espressione di questo cluster genico silenzioso, il composto pristinina A3 è stato isolato e la sua struttura è stata determinata tramite NMR e SM, rivelando due enzimi formatori di lattiionina precedentemente sconosciuti codificati all'interno della via77. Questo risultato evidenzia come le analisi guidate dall'IA possano scoprire NP nascosti: il modello ML ha rilevato un segnale genetico altrimenti non riconosciuto, guidando gli sforzi sperimentali per scoprire una nuova molecola.
  2. Applicazioni emergenti dell'IA
    Oltre alle applicazioni attuali, diverse strategie emergenti guidate dall'IA sono destinate a rivoluzionare ulteriormente la ricerca sugli NP. Un ambito promettente è la retrosintesi computazionale e la progettazione di percorsi, dove vengono sviluppati modelli di deep learning per suggerire vie biosintetiche o passaggi di chimica sintetica per NP noti e i loro analoghi, che potrebbero migliorare significativamente la progettazione e la produzione di nuovicomposti 78,79. Un'altra frontiera entusiasmante è la previsione della funzione enzimatica tramite l'IA. Sfruttando i moderni strumenti di previsione della struttura delle proteine basati su algoritmi di deep learning, insieme a tecniche di ML come l'apprendimento contrastivo sulle sequenze proteiche, i ricercatori stanno iniziando a dedurre le probabili attività degli enzimi non caratterizzati presenti nei BGC. Questo potrebbe fornire indicazioni sui tipi di trasformazioni chimiche che questi enzimicatalizzano 80,81,82. Sono in fase di sviluppo pipeline completamente integrate da omici a chimica, dove le piattaforme di IA mirano a collegare automaticamente le caratteristiche spettrali di massa ai datigenomici 83,84. In linea di principio, un tale sistema potrebbe analizzare un dataset LC-MS/MS da un campione complesso insieme a sequenze genomiche provenienti dallo stesso ambiente, permettendogli di prevedere quale cluster genico è responsabile di ciascun metabolita non identificato valutando le corrispondenze tra cluster genico-metaboliti. Sebbene questi approcci siano ancora agli inizi, suggeriscono un futuro in cui l'IA potrebbe collegare autonomamente geni a molecole, accelerando notevolmente il processo dai dati omici alla scoperta di nuovi NP.
  3. Governance dei dati e sfide etiche nella scoperta di NP assistiti dall'IA
    La ricerca moderna sulla multi-omica produce una quantità significativa di dati diversi, ma l'efficacia delle previsioni dell'IA dipende fortemente dalla qualità e dalla coerenza di questi dataset. Quando i set di addestramento sono poco annotati o di parte, possono portare a risultati fuorvianti e convalide fallite85. Per affrontare questo problema, i ricercatori dovrebbero implementare i principi FAIR - Trovabile, Accessibile, Interoperabile e Riutilizzabile - per promuovere trasparenza dei dati, riproducibilità e riutilizzabilitàestesa 86. Questo approccio prevede la condivisione sia di risultati positivi che negativi, la documentazione approfondita delle pipeline di preprocessing dei dati e la fornitura di codice di analisi per facilitare la verifica indipendente. Inoltre, l'adozione di infrastrutture digitali emergenti, come i quaderni elettronici da laboratorio (ELN) e i flussi di lavoro containerizzati, è essenziale per migliorare la raccolta dei dati e garantire una curatelastandardizzata 87,88.
    Sebbene l'IA acceleri significativamente la scoperta dei NP, solleva anche questioni etiche cruciali. Gli algoritmi addestrati su dataset incompleti o distorti possono rafforzare le disuguaglianze esistenti, sottolineando la necessità di dati di addestramento diversificati erappresentativi 89. Inoltre, l'impiego di metodi di IA spiegabili è fondamentale per aumentare la trasparenza e aiutare gli scienziati a comprendere le previsioni, assicurando che l'IA funga da strumento di supporto sotto il controllo umano piuttosto che dadecisore 85. Le considerazioni etiche comprendono anche la privacy dei dati, specialmente quando si utilizzano dataset clinici o derivati dall'uomo, così come le implicazioni per la forza lavoro poiché l'automazione influenza sempre più l'ambiente di ricerca. Per affrontare questi problemi, i sistemi di IA dovrebbero essere soggetti a audit regolari, valutazioni dei bias e rigorosa supervisione normativa, che aiuteranno a mantenere equità, responsabilità e affidabilità nel campo della ricerca sugli NP.

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Conclusioni

Lo stato attuale della scoperta dei NP sfrutta una combinazione di chimica analitica e bioinformatica, creando una sinergia potente. Come illustrato nella Figura 1, tecnologie omiche avanzate come la metabolomica LC-MS, il sequenziamento ad alto rendimento, RNA-Seq e la proteomica collaborano con l'analisi computazionale, inclusi networking e ML, per formare una pipeline efficace di scoperta. Gli sviluppi recenti nel campo in...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano che non ci sono relazioni finanziarie o personali che possano essere percepite come potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32500813), dal Programma di Borse di Studio Postdottorato del CPSF (GZC20251503), dal Programma di Scienza e Tecnologia del Sichuan (2024ZYD0149), dalla Fondazione Speciale per la Ricerca per il Programma Post-Dottorato della Provincia del Sichuan (TB2024017), dal Progetto Chiave di Ricerca e Sviluppo del Deyang Science and Technology Bureau (2024SZY016, 2023SZZ009), dal Centro di Sviluppo delle Capacità e Formazione Continua della Commissione Nazionale della Sanità (GWJJMB202510025060). e Fondo Speciale per Progetti di Incubazione dell'Ospedale Popolare Deyang (FRH202501, FHT202501). Riconosciamo che la Figura 1 è stata creata utilizzando BioRender,

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