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Articolo metodologico

Coltura espiantante renale di roditori e stabilimento della coltura cellulare epiteliale primaria del bocciolo ureterico

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DOI:

10.3791/69462

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30 dicembre 2025

 ,  ,  , 
1Stem Cells and Metabolism Research Program Unit, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 2GM Unit, Helsinki Institute of Life Science, University of Helsinki, 3Department of Pediatric Surgery, Section of Pediatric Urology, New Children's Hospital, Helsinki University Hospital, 4Laboratory Animal Centre, University of Helsinki

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'istituzione della coltura renale mammifera più comunemente utilizzata, che consente la crescita e la differenziazione renale in un sistema di interfase aria-liquido di tipo Trowell. Dettagliamo anche come impostare colture primarie di cellule epiteliali dei gemmi ureterici a partire dai primi rudimenti renali.

Abstract

Il rene in via di sviluppo è un sistema modello ampiamente utilizzato per studiare l'organogenesi dei mammiferi. La differenziazione renale è orchestrata dalle interazioni induttive reciproche tra mesenchima, stroma ed epitelio. La morfogenesi ramificata del germoglio ureterico epiteliale promuove non solo la crescita renale embrionale e la patterning 3D, ma induce anche transizioni mesenchima-epitelio all'interno del bacino progenitore di nefroni circostante, assicurando così la formazione di nefroni necessaria alla filtrazione funzionale.

Le decisioni critiche sul destino cellulare all'interno di tutti e tre gli strati tissutoriali, epitelio, mesenchima e stroma, sostengono un equilibrio dinamico tra il rinnovamento dell'auto-progenitore e l'equilibrio di differenziazione. Queste complesse interazioni regolatorie multilivello dipendono intrinsecamente dall'integrità strutturale dell'organo, rendendo i modelli renali intatti essenziali per studiare i processi morfogenetici e i comportamenti cellulari nel loro contesto nativo.

I metodi di coltura degli organi renali offrono piattaforme approfondite per visualizzare i processi di sviluppo e dissezionare i meccanismi morfologici, cellulari e molecolari che governano la differenziazione renale. Esistono diversi metodi di coltura renale, ognuno con vantaggi distinti. In questo articolo descriviamo l'istituzione di un sistema tradizionale di coltura in interfase aria-liquido di tipo Trowell per lo sviluppo renale in vitro . Per migliorare la risoluzione delle analisi cellulari e molecolari, descriviamo anche la configurazione di una coltura cellulare epiteliale a germoglio ureterico primario, che consente un'indagine mirata dei meccanismi epiteliali specifici.

Infine, dimostriamo che la tecnica tradizionale di coltura degli organi renali è applicabile al rene embrionale di un nuovo organismo modello, il topo spinoso (Acomys dimidiatus). Questo apre strade innovative per la ricerca sulle cellule staminali e sulla rigenerazione, poiché Acomys possiede una notevole capacità di riparazione funzionale in diversi sistemi d'organo studiati finora.

Introduzione

La pratica della coltivazione degli organi risale all'inizio delXX secolo. I reni furono tra i primi organi ad essere coltivati in vitro quando Rienhoff introdusse il metodo della goccia impiccata per i reni embrionali di pollo nel1922. Negli anni '50, le colture renali embrionali di topo (Mus musculus) hanno stabilito l'importanza delle interazioni mesenchima-epitelio nel guidare i processi di sviluppo 3,4. Da allora, le colture di tessuti e organi hanno servito come metodo per studiare la morfogenesiramificata 5,6,7,8,9,10,11,12, la segnalazione induttiva 3,4,13,14, la differenziazione 15,16,17, 18, 19, e i loro meccanismi. Tuttavia, la coltura in vitro altamente rilevante consente l'aggiunta di diverse molecole di segnalazione, agonisti o antagonisti/inibitori alle colture per monitorarne gli effetti sugli eventi morfologici 20,21,22.

La coltivazione di reni geneticamente modificati (GM) ha fornito informazioni preziose sulla regolazione della differenziazionerenale 6,7,9,20,23,24,25,26,27. I metodi di marcatura genetica e le tecniche di imaging dal vivo permettono la visualizzazione di specifiche popolazioni cellulari o addirittura di singole cellule, facilitando l'analisi del loro contributo ai processimorfologici 9,10,12,18,24,25,26,28,29,30.

Esistono almeno quattro diversi tipi di sistemi di coltura renale ex vivo: 1) il metodo delle gocce appendibili, in cui il tessuto viene coltivato in una piccola goccia media appesa a un coperchio a una copertura o a un coperchio in piastradi Petri 2,31; 2) Coltura in interfase liquida di tipo trowell, dove gli espianti sono posti su una membrana sopra una griglia metallica o appesi a una struttura di plastica (inserti commerciali) con substrati sotto lamembrana 32,33; 3) coltura a basso volume, in cui una quantità molto piccola (~85 μL) di mezzo di coltura e il tessuto vengono inseriti all'interno di un anello di silicone su un vetrinodi vetro 34; e 4) coltura a direzione Z fissa (FiZD) ottimizzata per immagini confocali live e in cui il rene viene compresso tra un vetrino di vetro e una membrana separata da spaziatori35. La coltura renale di tipo Trowell è presentata qui per la sua semplicità, l'elevata efficienza dei costi, la facilità di visualizzazione dei processi morfologici e perché non è collegata a una microscopiaspeciale 6.

I metodi di coltura renale offrono un modo per comprendere l'organogenesi in modo olistico. Le colture cellulari primarie rappresentano un approccio supplementare per studiare i meccanismi biochimici e molecolari, in particolare quelli coinvolti nell'adesione cellulare e nei suoi cambiamenti, delaminazione e motilità. Per questi, la coltura in vitro di cellule epiteliali è un eccellente modello36. La coltura monostrato di germoglio ureterico primario (UB) si stabilisce in circa 48 ore, dopo di che le cellule non si dividono ma sopravvivono vive per circa duesettimane. Un fenotipo non proliferativo può essere utilizzato efficacemente per analizzare, ad esempio, la migrazione cellulare con un test scratch o forze di adesione intercellulari ecellula-matrice 7,37,38. Inoltre, le cellule derivate da topi GM globali possono fornire informazioni essenziali specifiche per tipo cellulare sulla differenziazionerenale 6,7.

Lo sviluppo del rene permanente (metanefros) inizia con il processo noto come induzione renale, in cui le interazioni induttive reciproche tra il dotto epiteliale di Wolff (WD, chiamato anche dotto nefrico) e il mesenchima metanefrico (MM) inducono la formazione del germoglio ureterico iniziale (UB)13,39,40,41 . La MM secerne segnali come i fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF), causando che le cellule della WD si raggruppino prima e poi superino fino a formare la UB primaria iniziale, che invade la MM 5,40,42,43. Nel topo, il modello mammifero più comune usato per studiare l'organogenesi, questo avviene al giorno embrionale 10,5 (E10,5) e negli esseri umani intorno alla settimana gestazionale 4-5 40,44,45,46.

Il processo di induzione renale è seguito dall'inizio della morfogenesi ramificata UB. Qui, la punta del germoglio si allunga prima, poi si gonfia in un'ampolla per infine biforcarsi in una struttura a T-bocciola con due punte nuove di zecca (Figura 1)12,37,39,47,48. Le nuove punte UB non solo ricevono segnali regolatori dal MM, ma influenzano attivamente anche il destino e il comportamento del MM 6,42,49. Di conseguenza, la differenziazione dell'epitelio del nefrone è indotta da ciascuna punta UB (Figura 1). In questo modo, l'estensione della ramificazione UB determina il numero finale di nefroni nel rene. La morfogenesi ramificata continua con cicli iterativi fino alla nascita, ma la maggior parte della ramificazione avviene durante 10-13 cicli, avvenuta tramite E15.5 nei topi, dopo di che il tasso di formazione di nuove punte diminuiscesignificativamente di 30,49. Curiosamente, la formazione del nefroni continua più a lungo, e la base morfologica e molecolare di ciò sta solo iniziando a esserechiarita 50,51,52,53,54.

L'UB è suddiviso molecolarmente e funzionalmente in due sottopopolazioni, la punta e il gambo, che differiscono per i loro profili di espressione genica e per la capacità diproliferazione 12,55,56,57,58,59. La maggior parte delle biforcazioni che generano nuovi rami avviene nelle punte, mentre la differenziazione avviene nella regione del tronco dove nascono i due tipi di cellule ductali raccoglitrici, cellule principali e intercalate, 11,12,60,61,62. Studi fortemente dipendenti dalle colture renali in vitro hanno identificato che le punte UB ospitano una popolazione progenitrice capace di dare origine a nuove punte, il tronco, l'uretere e l'intero sistema dei dotticollettori 5,25. Nonostante la noto regionalizzazione tip-tronco, i meccanismi che controllano le decisioni di differenziazione rispetto a auto-rinnovamento all'interno dei progenitori dei condotti di raccolta sono poco noti. È importante sottolineare che l'identità in situ dei progenitori dei dotti raccoglitori e i mezzi per identificarli stanno emergendo solo37.

La punta UB costituisce una nicchia fondamentale per l'istituzione del mesenchima del cap, che costituisce il pool progenitore nefronico(NP) 13,63. Da un lato, il mesenchima del cappuccio è circondato dalla UB, e dall'altro dai progenitori stromali che danno origine alle cellule interstiziali, come periciti e cellule mesangiali (Figura 1)27,64,65,66,67,68. Durante ogni ciclo di ramo UB, un sottoinsieme di cellule NP si auto-rinnova per mantenere la popolazione NP, e un'altra parte viene indotta a differenziarsi in nefronifunzionali 66. Si sa molto meno sul comportamento dei progenitori stromali, che tuttavia persistono intorno alle cellule NP nella periferia del rene embrionalein crescita 65,69.

Il mesenchima cappuccio che ospita le cellule NP è altamente organizzato e dinamicoper natura 28,66. Le cellule più vicine alle punte sono i veri progenitori, mentre quelle che si localizzano un po' più lontano, nelle ascelle del T-bocciolo, sono pre-impegnate nella differenziazione 18,28,67. Pertanto, la posizione delle cellule NP all'interno del cappuccio influisce chiaramente sul loro destino, mentre il loro comportamento dinamico, come dimostrato dalla loro capacità di migrare dentro e fuori dal compartimento del cappuccio, suggerisce flessibilità nelle decisioni sul destino a livello di singola cellula. Studi comparativi recenti hanno stabilito che i temi regolatori generali dei progenitori renali sono ben conservati tra topi e noiumani 18,46,70,71,72, sostenendo anche l'uso futuro della cultura degli organi.

La differenziazione dei nefroni avviene nelle immediate vicinanze dell'epitelio UB e inizia quando i segnali provenienti dall'UB, e possibilmente dallo stroma circostante, inducono i progenitori nefronici impegnati a formare una condensazione cellulare nota come aggregato pretubolare (Figura 1)13,47. Questo cluster cellulare subisce quindi una transizione mesenchimale a epiteliale per formare la vescicola renale, una struttura assiale polarizzata con destini di nefroni prossimali e distali stabiliti. Ciò significa che la posizione della cellula nella vescicola determina se diventerà parte del corpuscolo renale contenente podociti, ciuffo glomerulare e cellule mesangiali, oppure se si incorporerà nei segmenti più distali del tubulo contorto prossimale, nell'anello discendente di Henle, nell'anello ascendente di Henle, nella macula densa e nel tubulo contorto distale. L'identità finale è determinata dai segnali intricati emanati dall'UB, dallo stroma e dalla vescicola stessa, e include, ad esempio, i percorsi NOTCH, RHO eWNT 19,21,73,74. La determinazione del destino nella vescicola renale rappresenta un classico esempio di interazioni induttive tissultali che avvengono in un organo intatto, che non può essere studiato senza un'organizzazione strutturale 3D.

Dalla vescila renale, la nefrogenesi progredisce attraverso passaggi morfologici ben descritti fino a formare corpi a forma di virgola e S, dove le identità regionali si rafforzano ulteriormente e ulteriori tipi cellulari, come gli endotelii, invadono i glomeruliin sviluppo 48,75. Infine, alla cessazione dell'organogenesi, il pool progenitore indifferenziato viene utilizzato per fornire la capacità di filtrazione renale per la vita18,67. Le fasi anatomiche e morfologiche della nefrogenesi, inclusa l'innervazione, sono ben rappresentate nella nefrogenesi in vitro 76,77. Tuttavia, la vascolarizzazione del rene non avviene nei sistemi classici di coltura renale. Questo aspetto può essere studiato con alcune limitazioni tramite innesto renale sulla membrana corioallanttoicaaviaria 78,79.

Oltre alla coltura integrale degli organi, esistono metodi per generare organoidi simili a quelli renali a partire da cellule pluripotenti. Protocolli diversi con particolare enfasi sulla creazione di nefroni 80,81,82,83, gemme ureterico 84,85,86 e organoidi con strutture di ordine superiore 87, oltre a tubuloidi, colture 3D del segmento di nefroni e epitelio collettivo del dotto 88,89esistere. Questi sono strumenti preziosi per studiare la morfogenesi renale, ad esempio negli esseri umani, dove è disponibile una quantità limitata di materiale fetale. Tuttavia, i metodi organoidi non possono riprodurre l'organogenesi intatta in modo simile alla coltura d'organo in vitro. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate per stabilire colture renali di tipo Trowell e colonie primarie di cellule epiteliali dall'UB. Questi protocolli sono stati utilizzati principalmente per i reni embrionali dei topi, ma funzionano anche per lo sviluppo dei reni dei ratti. Dimostriamo che la coltura di tipo Trowell è efficace anche per i reni embrionali di topo spinoso (Acomys dimidiatus) - un modello innovativo di roditore con eccezionale capacità dirigenerazione 90,91,92,93,94. Il vantaggio della coltura renale embrionale è la facilità di installazione e l'uso economico.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida e le normative nazionali e dell'Unione Europea pertinenti. Il Comitato per gli esperimenti sugli animali dell'Università di Helsinki ha approvato l'uso di roditori per questi esperimenti sotto le licenze KEK22-016 (valide: 1.7.2022-30.6.2025) e KEK25-014 (valide: 1.7.2025-30.6.2028).

NOTA: Assicurati di smaltire tutti gli oggetti taglienti e le sostanze chimiche secondo le linee guida istituzionali e le buone pratiche di laboratorio. Le colture renali possono essere stabilite con rudimenti renali precoci provenienti da embrioni di roditori. Le fasi tipiche per l'installazione della coltura renale sono E11.5-E13.5. Più l'organo è precoce, più è difficile riconoscerlo. Inoltre, i rudimenti renali molto precoci (E10-11) crescono più male in vitro, poiché spesso non iniziano la morfogenesi ramificata dell'UB. D'altra parte, la complessità dell'albero epiteliale UB aumenta con la crescita renale e successivamente diventa un po' più difficile stabilire colture cellulari primarie di UB, poiché ciò richiede sia il riconoscimento visivo sia una separazione attenta delle punte dalla MM circostante. In definitiva, la questione scientifica affrontata determinerà la fase di sviluppo appropriata del rene da utilizzare nell'esperimento.

1. Coltura renale embrionale

  1. Collezione di reni embrionali
    NOTA: Le femmine di topo e ratto presentano una specifica caratteristica biologica riproduttiva in cui formano un ostruizio vaginale, noto come plug, dopo il concepimento. Il giorno del plug vaginale è indicato come 0,5 giorni dopo il concepimento, noto anche come giorno embrionale 0,5 (E0,5)95. Dopo questa stadiazione embrionale, le colture renali vengono tipicamente stabilite a E11-12.5 sopportando il topo gravida con il riempimento graduale della camera con CO2 seguito da una lussazione cervicale.
    1. Spruzzare la pelle dell'addome con etanolo al 70% (Figura 2A). Apri la pelle addominale e gli strati muscolari, localizza l'utero contenente embrioni (Mus E11.5-E12,5, Acomys E18-E19) (Figura 2B) e ritaglialo. Inserire l'utero con gli embrioni in una piastra di Petri da 100 mm contenente PBS di Dulbecco.
      NOTA: Come nota di sicurezza, la camera aCO2 dovrebbe essere collocata o nella cappa o utilizzata in una stanza con ventilazione adeguata per evitare danni agli utenti. Inoltre, l'etanolo è facilmente infiammabile e non dovrebbe essere usato vicino a una potenziale fonte di scintilla o incendio. In generale, il PBS di Dulbecco è intercambiabile con il mezzo indipendente daCO2, dove embrioni e tessuti sono ben protetti per la conservazione a breve e lungo termine96. Inoltre, ricorda di utilizzare sempre strumenti di dissezione puliti e sterili per evitare qualsiasi fonte di contaminazione.
    2. Tieni l'utero con una pinza e contemporaneamente apri gli strati muscolari incidendo con forbici.
    3. Estrai gli embrioni e strappali via dai tessuti extraembrionali e dalla placenta tirando delicatamente con una pinza sottile (Figura 2C). Per preservare al meglio i tessuti, mantenere tutti gli altri embrioni tranne quello con cui lavora sul ghiaccio durante l'attività di dissezione.
    4. Utilizzando aghi come coltelli chirurgici, taglia l'embrione in due metà diagonalmente appena sotto il fegato (Figura 2D). Risparmia più tessuto dal lato dorsale rispetto al ventrale. Rimuovere gli arti posteriori, eventuali residui di fegato e intestino per osservare meglio i reni in sviluppo. Per favorire l'orientamento, nelle fasi di sviluppo E11.5-E12.5, i reni si trovano bilateralmente su entrambi i lati dell'aorta dorsale e del midollo spinale, ventrali rispetto al tubo neurale e al somite, al livello degli arti posteriori.
    5. Successivamente, disseziona i reni dalla cavità corporea. Per prima cosa, rimuovere la pelle dorsale e il midollo spinale. Poi, gira l'embrione per farlo sdraiare sulla schiena e rimuovi delicatamente le pareti laterali del corpo facendo scorrere gli aghi verso le cavità laterali, tagliando contemporaneamente con attenzione questi tessuti in eccesso. I reni ora si trovano come un blocco nella sottile striscia di tessuto, dove il dotto di Wolff è da un lato e il MM dall'altro lato (Figura 2E).
    6. Taglia i tessuti extra sia dalla parte posteriore che da quella caudale della striscia, e infine separi i due reni tagliando tra di essi dal lato del dotto di Wolff. Ora i due reni sono liberati dall'embrione e l'uno dall'altro (Figura 2F) e possono attendere nel PBS di Dulbecco per essere posizionati sulla piastra di coltura (1.2.2).
      NOTA: Quando studi i reni geneticamente modificati, processa sempre i reni a coppie per tenere traccia della loro origine e permettere la loro genotipazione. Questo può essere fatto, ad esempio, posizionando i due reni in uno dei pozzi a 24 pozzi a piastre di piastra a 24 pozzi.
  2. Installazione della coltura renale di tipo Trowell
    1. Prepara piatti di coltura. Inserire il filtro a inserimento Transwell di poro di 0,1 μm nel pozzo e aggiungere 1,5 mL di substrato colturale (DMEM/F12 integrato con FBS al 10%, 1x penicillina-streptomicina (100 U/mL penicillina, 100 ug/mL streptomicina) e 1x L-glutamina) sul fondo del pozzo (Figura 3A). Le bolle d'aria possono disturbare l'adsorbimento di nutrienti e reagenti dal mezzo. Assicurati che non ci siano bolle d'aria che potrebbero essere in contatto con il filtro. Per facilitare ciò, aggiungere il mezzo di coltura alle piastre Transwell pipettandolo attraverso i piccoli fori laterali tra l'inserto e la parete del piatto.
      NOTA: Gli inserti Transwell commerciali possono essere sostituiti con griglie metalliche come supporto per pezzi di membrana filtrante porosa (dimensione pori 0,1 μm). Con filtri supportati da griglia, il sistema di coltura può essere stabilito in qualsiasi tipo di piatto di coltura cellulare. Si noti che le membrane filtranti porose devono essere pre-risciacquate con H2Odistillato e conservate al 70% di EtOH prima dell'uso. Per stabilire il sistema di coltura, risciacqua bene i filtri con H2Odistillato o PBS di Dulbecco e posiziona l'intero filtro o pezzi più piccoli tagliati dal filtro sopra la griglia. Usa un substrato giusto in modo che sia a contatto con il filtro senza coprirlo. Questo garantirà un corretto attacco del tessuto per evitare che fluttui via.
    2. Usa il capillare o una pipetta molto piccola (0,5-10 μL) per posizionare un singolo rene alla volta sul filtro (Figura 3B). Evita liquidi in eccesso quando si posiziona il rene e rimuovi qualsiasi liquido visibile intorno al rene succhiando delicatamente con un capillare. Evita di colpire il fazzoletto.
      NOTA: È estremamente importante posizionare i reni su un filtro in un ordine specifico quando si ottengono colture renali provenienti dalle linee di topi GM, poiché le informazioni sul genotipo al momento della creazione della coltura sono carenti. L'ordine numerato dei reni sul filtro ne permette il riconoscimento durante e dopo la coltura. Con inserti Transwell che ruotano liberamente, usa le marcature sopra il coperchio ma anche sui lati della piattaforma per evitare di perdere l'orientamento se l'inserto Transwell ruota.
    3. Inserire nel cubicolatore la piatta/i contenente gli espianti renali con temperatura di +37 °C e 5% diCO2 per la coltura del tempo desiderato (Figura 3B).

2. Stabilimento di colture epiteliali primarie dei gemmi ureterici

  1. Isolamento dei germogli ureterici e preparazione della coltura cellulare
    1. Raccogli i reni come descritto nel passo 1.1.
    2. Incubare i reni con 4 mg/mL di collagenasi in D-MEM/F12 integrato con siero fetale al 10% per 15 minuti a +37 °C. Per risparmiare l'enzima, pipetta una piccola quantità (1-2 mL) di collagenasi su una piastra secca e pulita da 30 mm in modo che formi una bella goccia e preriscalda a 37 °C. Aggiungi e rimuovi i reni con l'aiuto di un capillare di vetro per il trattamento. Quando si utilizza il trattamento con collagenasi su piastre a 24 pozzi, è più sicuro aggiungere e rimuovere la soluzione piuttosto che spostare i reni, che diventano appiccicosi durante questo trattamento.
    3. Fermare la funzione della collagenasi aggiungendo 25 U/mL di DNasi in DMEM/F12 + 10% FBS. Lascia riposare i reni per 10-15 minuti sul ghiaccio.
    4. Scollega meccanicamente l'UB libero dal MM. Per questo, usa aghi (ad esempio 26 G) per raschiare delicatamente via il mesenchima circostante. Per un isolamento efficace degli UB, è estremamente importante comprendere la morfologia precisa del rene precoce, e in particolare dove si trova il UB all'interno del MM. Il UB è più chiaramente visibile nei reni dello stadio iniziale, dove il MM non è spesso e lo copre da più angolazioni. L'epitelio UB appare come un tubo cavo a forma di bocciolo o a T a E11-11.5, e la forma si ripete nelle fasi successive ma in una forma più complicata.
      1. Inizia l'isolamento dell'UB penetrando il mesenchima con aghi nella regione del germoglio del germoglio. Rimuovi il MM spingendolo via, partendo dal gambo e spostandoti verso le punte. Il peduncolo si troverebbe vicino al dotto di Wolff ai reni E11.5 e sul lato midollare ai reni E12.5. Poiché l'albero E12.5 UB è più complesso in 3D, può essere più accessibile e quindi più facile da raggiungere dalle punte piuttosto che dal fusto. È possibile stabilire la coltura cellulare primaria dell'UB solo dalle punte. È importante notare che questo genera meno cellule ed è quindi raccomandato solo per reni E11.5 o più vecchi.
        NOTA: Per permettere confronti, il numero di UB o la quantità relativa di epitelio UB utilizzata per preparare la coltura cellulare primaria deve essere il più possibile simile tra diversi campioni e/o trattamenti. Questo stabilisce culture comparabili per qualsiasi tipo di analisi a valle.
    5. Aggiungere in anticipo 0,5-0,75 mL di mezzo di coltura (DMEM/F12 integrato con FBS al 10%, 1x penicillina-streptomicina e 1x L-glutamina) integrato con GDNF (5 ng/mL), FGF2 (25 ng/mL) e HGF (50 ng/mL) sulla piastra di coltura rivestita di fibronectina. Poi, posizionare le UB isolate al centro del pozzo rivestito di fibronectina (Figura 4A). Tutti i gemmi dovrebbero essere vicini tra loro per formare una singola coltura monostrato.
      NOTA: Le piastre già pronte rivestite di fibronectina sono disponibili in commercio. Tali piastre dovrebbero essere preriscaldate almeno 30 minuti prima dell'uso. Tuttavia, il rivestimento interno con fibronectina è un'opzione più economica. Le piastre (o vetture di vetro, ideali per l'imaging) vengono incubate con 10 mg/mL di fibronectina per 1 ora a temperatura ambiente / 30 minuti a 37 °C. Per rimuovere l'eccesso di fibronectina, lavare con BSA allo 0,2% 3 x 15 min a 37 °C, seguita da aggiungere un substrato di coltura affinché le piastre siano pronte all'uso.
    6. Metti il piatto nell'incubatore di colture cellulari con molta attenzione per non spostare le UB che galleggiano facilmente nel pozzo. Sii estremamente attento quando sposti le piastre dopo che le UB sono state inserite nei pozzi. L'aderenza ai tessuti/cellule alla fibronectina richiede alcune ore, quindi qualsiasi movimento improvviso può spingere le cellule a fluttuare tutto intorno alla placca. Questo può causare la diffusione degli UB ai bordi della placca, il che non è ottimale per documentare la loro crescita e il loro comportamento durante l'esperimento.
    7. Lascia che gli UB si stabiliscano e si attenzionino. Durante la coltura di 42-48 ore, formeranno un monostrato (Figura 4B). Per avere un'idea di dove si stanno depositando gli UB nel pozzo, le colture possono essere monitorate una volta al giorno durante le prime 48 ore. Se gli UB provengono da background genetici diversi, potrebbe essere utile documentarne il processo di delaminazione tramite immagini time-lapse per stimare possibili differenze nelle proprietà adesive o nella capacità di formazione di monostrati.

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Risultati

Il metodo della coltura renale ex vivo può essere utilizzato per affrontare una vasta gamma di domande di ricerca relative allo sviluppo renale, e l'esito di ogni esperimento dipende dall'impostazione sperimentale. Tuttavia, con l'uso di campioni di controllo appropriati, è importante assicurarsi che le condizioni della coltura stesse non influenzino lo sviluppo. Idealmente, i campioni di controllo ex vivo ripetono lo sviluppo renale in vivo. Il topo domestico è stato il modello standard degli ...

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Discussione

Il rene è un organo vitale con funzioni significative di filtrazione del sangue e di equilibrio dei fluidi corporei. La base della capacità funzionale renale si costruisce durante la vita fetale, quando tutti i nefroni per la vita siformano 44,51,97. La comprensione sia della crescita renale tramite morfogenesi ramificata sia della differenziazione del nefrone in sé ha ampiamente benefi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la signora Agnés Viherä per il suo aiuto tecnico esperto in tutte le nostre colture di cellule epiteliali renali e di globuli rossi. Gli animali venivano ospitati presso il Centro per gli Animali da Laboratorio dell'Università di Helsinki. Il lavoro ha ricevuto finanziamenti dalla Aamu Pediatric Cancer Foundation; HiLIFE e iCANDOC presso l'Università di Helsinki; Fondazione Väre per il Cancro Pediatrico, Fondazioni Liv och hälsä e Perklén.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10X PBSLonza Biosciences51226Soluzione 1X per l'uso
Siringhe da 1mlThermo Fisher Scientific10564431
Aghi di iniezione usa e getta da 23-25GThermo Fisher Scientific10482792
Piastre a 24 pozziGreiner662160
Lastre CellStar a 6 pozzi  MerckM8562
70% etanolo (EtOH), diluito in MilliQ-H2OQualsiasi fornitore commercialeUtilizzato per sterilizzare superfici e pelle
Albumina sierica bovina (BSA)Thermo FisherB14Concentrazione finale dello 0,2%
Collagenase Invitrogen17018029Brodo da 200mg/ml in PBS
DMEM/F12 Thermo Fisher31331028
DnaseFisher10649890
Micro Dispenser Drummond Wiretrol II, 10-20 & micro; lPipette transcatDRMC064
Dulbecco' s PBS (con Ca2+ e Mg2+)Thermo Fisher Scientific14040117Dulbecco' s PBS è intercambiabile con il mezzo indipendente CO2 (Gibco/ThermoFisher), dove embrioni e tessuti sono ben protetti per la conservazione a breve e lungo termine. 
E11.5 - Embrioni di topo E12.5Qualsiasi allevatore commerciale / proprietario di bestiamehttps://janvier-labs.com/en/Gli embrioni di topo sono tipicamente prodotti tramite tinteraggio interno. Il giorno in cui compare il plug vaginale è E0,5. Commerciale  sono disponibili anche topi femmine con pregrancy a tempo.
Embrioni di topo spinosi E18-19N/AN/ACorrispondente alternativa per embrioni di topo. 
Siero fetale bovino (FBS)GibcoA5256801
FibronectinaNovus Biologicals1030-FN-05MBrodo da 1mg/ml
Piatti di vetro o plastica (100mm, 60mm e 30mm).Gibco150476, 174888, 153066
GlutaMAXGibco35050061
Fattore di crescita dei fibroblasti ricombinanti umani (rFGF2)PeproTech100-18B
Fattore Neurotrofico Derivato dalla Linea Cellulare Gliale Ricombinante Umana (rGDNF)R& D212-GD-010/CF
Fattore di crescita epatocitario ricombinante umano (rHGF)PeproTech100-39
Penicillina-streptomicinaGibco15140122
Forbici piccole e pinze sottili  Strumenti scientifici di qualità14040-10, 11254-20Usa solo strumenti di sezionamento puliti e sterili per evitare qualsiasi fonte di contaminazione.
StereomicroscopioLeica MZ7.5 o Olympus SZ x9https://www.leica-microsystems.com/
Support permeabili Transwell, inserti da 24mm  Fisher10619141

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