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Articolo metodologico

Purificazione efficiente dei polipeptidi simili all'elastina (ELP) da E. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico

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DOI:

10.3791/69465

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9 gennaio 2026

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1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo rapido e riproducibile di estrazione e precipitazione a base di solventi organici per purificare polipeptidi simili all'elastina (ELP) da Escherichia coli, offrendo un'alternativa potenzialmente scalabile ai metodi convenzionali di purificazione ELP.

Abstract

I polipeptidi simili all'elastina (ELP) sono biopolimeri ingegnerizzati costruiti a partire da sequenze ripetitive di pentapeptidi che imitano motivi presenti nella tropoelastina dei mammiferi. Le loro caratteristiche uniche li rendono candidati ideali per una vasta gamma di applicazioni biomediche, che vanno dalla somministrazione di farmaci e geni all'ingegneria tissutale e all'imaging molecolare mirato. Gli approcci convenzionali di purificazione dall'espressione di Escherichia coli (E. coli) possono essere inefficaci per la ELP a causa della formazione di corpi di inclusione. Altri metodi, come il ciclo di transizione inverso (ITC), utilizzano le proprietà a bassa temperatura critica della soluzione (LCST) dell'ELP per separarla da contaminanti come i lipopolisaccaridi (LPS), ma tipicamente richiedono molteplici fasi di riscaldamento e raffreddamento che richiedono molto tempo e possono portare a recuperi bassi a seconda della sequenza, della concentrazione e del peso molecolare del costrutto ELP. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di estrazione-precipitazione a base di solventi organici che sfrutta l'idrofobia intrinseca dell'ELP per consentire una purificazione rapida, robusta e ampiamente applicabile direttamente dai pellet di cellule di E. coli . Questo metodo utilizza solventi organici polari per aiutare nella disgregazione cellulare e solubilizzare selettivamente l'ELP in un unico passaggio. Una successiva fase di precipitazione rimuove efficacemente solventi organici residui, impurità a basso peso molecolare ed endotossine, producendo ELP altamente puro con livelli di LPS inferiori a 1 EU/mL in meno di 3 ore. I dati della microscopia a forza atomica suggeriscono che le proteine di fusione ELP-purificate in questo modo possono auto-assemblarsi in strutture inverse simili a micelle, mantenendo la funzione delle proteine di fusione. Questo metodo di purificazione rapida offre ai ricercatori un modo semplice e potenzialmente scalabile per purificare l'ELP, creando nuove possibilità per l'utilizzo dell'ELP e delle loro proteine di fusione come mattoni flessibili per applicazioni materiali e biomediche.

Introduzione

I polipeptidi simili all'elastina (ELP) sono biopolimeri composti da motivi ripetuti (VPGXG)n 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Il residuo ospite X nell'unità pentapeptidica può essere qualsiasi amminoacido diverso dalla prolina. Le variazioni in X possono essere utilizzate per regolare l'idrofobicità, il comportamento della transizione termica e le caratteristiche funzionali del costrutto ELP per creare materiali modulari biocompatibili ampiamente esplorati in varie applicazioni biomediche 10,11,12.

Sebbene la sintesi chimica possa essere utilizzata per produrre peptidi brevi, è poco adatta per ELP ad alto peso molecolare o per mantenere la funzionalità delle proteine difusione 13,14. Per ragioni come queste, gli ELP sono tipicamente espressi ricombinantemente in E. coli, permettendo una produzione definita dalla sequenza in grandi quantità. Tuttavia, questo approccio può anche portare delle sfide. Durante la loro espressione in E. coli, le ELP spesso si accumulano all'interno di corpi di inclusione densi, richiedendo strategie di recupero efficienti per estrarre la proteinafunzionale 15. Inoltre, l'espressione batterica introduce biomolecole indesiderate come proteine della cellula ospite, acidi nucleici e lipopolisaccaridi (endotossine) che devono essere separati dall'ELP durante la purificazione. Le strategie tradizionali di solubilizzazione con detergenti (ad esempio, dodecil solfato di sodio (SDS) o Triton X-100) o agenti caotropi come l'urea hanno avuto un successo limitato per le nostre sequenze di fusione ELP. Nella nostra esperienza, Tritone e urea non riuscivano a estrarre le ELP dalla fase di pellet, mentre la SDS permetteva la solubilizzazione parziale ma interferiva con la purificazione dell'affinità a valle ed era difficile da rimuovere completamente dalla sequenza ELP idrofobica.

Ad oggi, il ciclo di transizione inversa (ITC) rimane il metodo di purificazione più utilizzato per le ELP. Questa tecnica sfrutta il loro comportamento LCST per precipitare e risolubilizzare selettivamente l'ELP attraverso gradienti di temperatura e sale16. Tuttavia, con proteine a peso molecolare più basso, l'ITC è un processo lungo e a più fasi poco adatto agli ELP intrappolati nei corpi di inclusione, richiedendo più cicli ITC che possono portare a perdita di proteine a ogni passo 7,16.

Per superare queste limitazioni, abbiamo adottato un flusso di lavoro di estrazione e precipitazione a base di solventi organici. Mentre Yakhnin et al. hanno dimostrato per la prima volta una strategia di partizionamento guidata dall'idrofobia per la purificazione da GFP utilizzando gradienti di etanolo e sale nel1998-17, il nuovo metodo che abbiamo sviluppato impiega miscele di solventi organici per estrarre direttamente le proteine di fusione ELP dalle cellule di E. coli 7. Sweet et al. e Darji et al. hanno adattato questo approccio alle fusioni ELP, dimostrando che l'estrazione con solventi organici consente un rapido recupero delle ELP funzionali mantenendo l'integrità strutturale e la bioattività 8,9. Questo approccio utilizza la sonicazione e solventi organici per lisare le cellule batteriche ed estrarre le ELP in un'unica operazione, precipitando la maggior parte delle proteine ospiti e degli acidi nucleici. Il recupero della fase organica ricca di ELP, seguito da una rapida precipitazione per isolare gli ELP da solventi e impurità solubilizzate, produce ELP altamente puri. Questo approccio è anche in grado di produrre ELP puro da pellet di E. coli con livelli di endotossine inferiori a 1 EU/mL in meno di tre ore 7,8.

Gli studi finora mostrano che questo metodo è in grado di purificare costrutti ELP e proteine di fusione ELP di peso molecolare e punto isoelettrico variabili, senza cicli multipli ITC o fasi di solubilizzazione (Figura 1). La microscopia a forza atomica (AFM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) suggeriscono che le proteine di fusione ELP-purificate in questo modo formano strutture simili a micelle-inverse (Figura 2), contribuendo così a preservare la struttura e la funzione dei domini di fusione ELP durante l'estrazione da solvente organico. Questo flusso di lavoro semplificato consente una purificazione ELP più rapida e affidabile per diverse applicazioni biomediche 7,8. In particolare, Aayush et al. hanno riportato che i costrutti ELP purificati con questo metodo mantenevano la funzione di legame del recettore del fattore di crescitaepidermico 18, sottolineando il fatto che questo metodo non solo produce materiale ELP puro, ma mantiene anche l'attività del dominio proteico di fusione.

Come ulteriore dimostrazione dell'utilità di questo metodo nell'isolare una fusione ELP-enzima, descriviamo un metodo dettagliato a base di solvente organico per purificare un costrutto ELP-Intein-Corismato mutasi 2 (ELP-I-Cm2) (Figura 3). Questo metodo può essere utile per la rapida purificazione di altri ELP per la somministrazione di farmaci e applicazioni nei nanomateriali.

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Protocollo

1. Preparazione dei materiali

  1. Ceppo batterico: Utilizzare cellule chimicamente competenti di Escherichia coli BL21(DE3) come ospite di espressione.
    NOTA: Sono stati selezionati per la loro elevata efficienza di trasformazione e l'idoneità alla produzione di proteine ricombinanti.
  2. Plasmide di espressione: Utilizzare il vettore pET21(+) che codifica la proteina di fusione ELP-I-Cm2 con resistenzaall'ampicillina 9. Acquista il vettore plasmide da addgene. Inserire il gene Cm2 usando il sito BsrG I all'estremità dell'inteina.
    NOTA: La sequenza di DNA plasmidico per questa proteina è fornita nel File Supplementare 1.
  3. Materiale di crescita: preparazione di substrati Terrific Broth (TB) per media da 1200 mL
    1. Prepara il substrato (Parte 1) aggiungendo 16 g di triptone, 32 g di estratto di lievito, 16 g di prolina, 6,8 mL di glicerolo a 1100 mL di acqua ultrapura. Mescola accuratamente per sciogliere tutti i componenti. Regola il volume finale a 1200 mL usando acqua ultrapura.
    2. Prepara il tampone di fosfato di potassio (Parte 2) mescolando 23,1 g diKH 2PO4 e 125,4 g di K2HPO 4, quindi porta il volume a 1 L con acqua ultrapura.
    3. Autoclave i componenti (Parti 1 e 2) separatamente. Dopo l'autoclav, assemblare il supporto dividendo la base TB in quattro aliquote da 300 mL. Aggiungere 33 mL di tampone fosfato a ciascuna aliquota in condizioni sterili.
  4. Additivi per l'espressione
    1. IPTG: Eseguire l'induzione usando IPTG a una concentrazione finale di 1,2 mM (ad esempio, aggiungere 396 μL di 1 M IPTG a 330 mL di coltura).
    2. Antibiotico: Aggiungere ampicillina a una concentrazione finale di 100 μg/mL per garantire la selezione del plasmide.
  5. Tampone di lisi (pH 8,5): Preparare il tampone di lisi con 10 mM Tris Base e 22 mM di acido etiledidiaminatetraacetico (EDTA). Regola il pH a 8,5 usando HCl o NaOH secondo necessità.
  6. Solventi organici per l'estrazione
    1. Impiegare una varietà di solventi organici (Tabella 1) per estrarre la proteina di fusione ELP-I-Cm2 dai corpi di inclusione. Testare questi solventi sia individualmente che in combinazioni binarie (1:1 vol: vol) per valutare l'efficienza e la purezza ELP.
      NOTA: Tutti i solventi utilizzati erano di grado HPLC, eccetto l'acetonitrile (grado Optima), l'etanolo (grado USP) e l'1-Butanolo (99% di purità).
      ATTENZIONE: Tutti i solventi elencati sopra sono volatili e infiammabili. Devono essere maneggiati all'interno di una cappa chimica utilizzando DPI appropriati (camice da laboratorio, guanti in nitrile e protezione per gli occhi). Molti tipi di plastica non sono compatibili con i solventi organici. La plastica al polipropilene è altamente raccomandata per esperimenti di estrazione-precipitazione con solventi organici; altrimenti, la plastica da utilizzare dovrebbe essere testata senza un campione prezioso per assicurarsi che sia adatta all'uso. Lo smaltimento dei rifiuti solventi dovrebbe seguire le procedure descritte nelle politiche istituzionali pertinenti sui rifiuti pericolosi.

2. Lisi e preparazione cellulare (Figura 4A)

  1. Sospensione: Pesa 1 g di pellet cellulare e risospendilo in 4 mL di tampone per la lisi appena preparato. Vortice delicatamente finché il pellet non è completamente disperso e mescolato con il tampon.
  2. Lisi enzimatica: Aggiungi ~5 mg di lisozima per aiutare nella digestione della parete cellulare. Lascia incubare la sospensione a 4 °C per 1 ora. Questo facilita una digestione enzimatica parziale per favorire la lisi cellulare.
  3. Sonicazione: Dopo l'incubazione, sonicare il campione per completare la lisi cellulare e tagliare il DNA genomico. Utilizzare brevi raffiche di sonicazione microtip (dispositivo da 350 W, livello di potenza 3) con intervalli per evitare surriscaldamenti (ad esempio, 5 s accesi/10 secondi spenti, ripetuti se necessario). Sonicare i campioni sul ghiaccio e applicare l'energia ultrasonica fino a ottenere un lisato uniforme privo di particelle visibili, tipicamente per circa 5-8 minuti.
    NOTA: Dopo il completamento della sonicazione, conservare un'aliquota di 100 μL del campione (o del lisato) per l'analisi dell'espressione ELP e monitorare il progresso della purificazione prima e dopo le fasi di estrazione e precipitazione.
  4. Centrifugazione e analisi dell'espressione.
    1. Chiarire il lisato centrifugando a 10.000 g per 10 minuti a 20 °C, poi separare con cura il soprandanzante (frazione solubile) dal pellet (frazione insolubile/inclusione-corpo).
    2. Valutare l'espressione ELP in entrambe le frazioni tramite SDS-PAGE: prelevare un'aliquota (ad esempio 10-20 μL) del sovrantante e risospendere una massa di pellet equivalente nel tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) allo stesso volume; Mescola ciascuno con 4x tampone Laemmli fino a un ultimo 1x, riscalda a 95 °C per 5 minuti e carica quantità uguali per permettere un confronto diretto.
    3. Se l'ELP bersaglio è prevalentemente solubile, procedere con l'estrazione con solvente organico utilizzando il soprandanante chiarifiato. Se è prevalentemente insolubile (corpi di inclusione), si scarta il sovrantato e si continua con il flusso di lavoro del corpo di inclusione (lavaggio/solubilizzazione ed estrazione) lavorando il pellet con estrazione con solvente organico.
  5. Lavaggio e asciugatura dei pellet (solo per ELP nei corpi di inclusione): invertire i tubi della centrifuga per consentire il drenaggio assistito dalla gravità di eventuali residui di lisi buffer. Una volta che il liquido visibile è stato drenato (~1-2 minuti), lascia asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente per 5-10 minuti, assicurandoti che sia libero dall'eccesso di umidità prima di procedere con l'estrazione organica.

3. Estrazione organica (Figura 4B)

NOTA: Ogni ELP ha la propria condizione di solvente preferita per ottenere estrazioni ad alta purezza (ad esempio, prestazioni AC nella Figura 1). Pertanto, dovrebbe essere testato uno screening iniziale di 28 solventi organici e le loro combinazioni, e gli isolati analizzati da PAGE per identificare le condizioni ottimali di efficienza di solubilizzazione per il concetto di interesse.

  1. Screening con solventi. Seleziona i singoli solventi mostrati nel passo 1.6 e le loro miscele di solventi binari 1:1 (v/v). Valuta miscele aggiuntive (ad esempio, 1:2, 2:1, 4:1) per aumentare l'efficacia del processo.
    NOTA: Attualmente non esistono linee guida per selezionare razionalmente i solventi o le combinazioni più efficaci, quindi è necessaria una campagna di screening per selezionare tra solventi che in precedenza hanno avuto successo nella solubilizzazione degli aggregati proteici idrofobici. La selezione finale dell'estrattore di solvente organico da utilizzare per la purificazione dovrebbe basarsi sull'analisi SDS-PAGE degli isolati ottenuti da questo schermo.
  2. Procedura di estrazione
    1. Aggiunta di solvente: Aggiungere 4 mL di solvente organico o miscela di solvente al pellet/soprandanante essiccato all'aria ottenuto dopo la lisi. Per combinazioni miste, assicurarsi rapporti volumetrici precisi (ad esempio, 2 mL di ciascuna per una combinazione 1:1).
    2. Vortex: Vortice vigorosamente la sospensione per 1 minuto per garantire una miscelazione e penetrazione approfondite del solvente nel pellet.
    3. Incubazione (tempo di ritenzione): Lasciare che la sospensione incubi a 20 °C per 5 minuti, garantendo un tempo di interazione sufficiente affinché le proteine extracellulari si aggregano e sedimentino mentre gli ELP si solubilizzano nella fase organica.
    4. Centrifugazione: Centrifugare la miscela a 13.000 × g per 10 minuti a 20 °C per separare le proteine solubili dai residui insolubili.
    5. Raccolta del soprandatante: Raccogli con cura il soprannatante senza disturbare la pallina. Il sovrantantante contiene l'ELP solubilizzato, mentre il pellet contiene proteine della cellula ospite, acidi nucleici e lipidi.
    6. Misurazione del volume: Registra con precisione il volume del surnatante recuperato. Bisogna prestare attenzione a garantire che il surnatante sia privo di particelle di pellet. Questa misurazione è fondamentale per la fase di precipitazione a valle.

4. Precipitazione delle proteine

  1. Aggiunta di antisolventi: Aggiungere acetone o acetonitrile al soprandante organico a 2,33 volte il volume misurato del soprandante.
  2. Incubazione: Incubare la miscela a 20 °C per 5-7 minuti.
  3. Centrifugazione: centrifuga a 10.000 g per 10 minuti a 20 °C.
  4. Manipolazione dei pellet: Dopo la centrifugazione, scartare con cura il soprantantante e asciugare all'aria il campione lasciando il tubo aperto sotto un flusso di azoto delicato per 10-15 minuti, oppure incubare posizionando tubi centrifughe senza tappi capovolti su salviette senza pelucchi in una cappa per 1 ora a 20 °C (non applicare calore).

5. Manipolazione e risospensione dei pellet proteici

  1. Risospensione: Dopo la precipitazione e l'asciugatura all'aria, risospendere la pellet proteica in 50 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Pipetta delicatamente su e giù per assicurarti che il pellet sia completamente sciolto.
  2. Conservazione: conservare la proteina risospesa a -20 °C per un uso a breve e medio termine. Evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo per mantenere l'integrità funzionale delle proteine.

6. Validazione tramite SDS-PAGE

  1. Preparazione del campione: Mescola la proteina purificata con un buffer di caricamento SDS-PAGE 4× in un rapporto 3:1 e vortice brevemente per garantire l'omogeneità.
  2. Condizioni di elettroforesi: Carica su un gel SDS-PAGE al 15% per ELP-I-Cm2 e fai funzionare a 100-120 V fino a quando il colorante di tracciamento raggiunge il fondo.
    NOTA: La percentuale di reticolazione nel gel dovrebbe basarsi sulla dimensione del costrutto ELP di interesse
  3. Colorazione e visualizzazione: tingere il gel usando la tintura Instant Blue Coomassie o un'altra tinta adatta per 2 ore a 20 °C. Trattieni risciacquando con acqua deionizzata finché non si ottiene uno sfondo pulito. Testare la proteina isolata negli saghi di attività per verificare che la ritenzione dell'attività è avvenuta dopo il flusso di lavoro di estrazione e purificazione da precipitazione con solvente organico.

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Risultati

Dopo aver affrontato le fasi finali del protocollo, il passo successivo è la visualizzazione dell'esito estrazione-precipitazione tramite analisi SDS-PAGE e colorazione blu di Coomassie. Quando c'è una fase di lisi prima dell'estrazione organica, dovrebbe essere evidente una banda ELP prominente. Nel caso di ELP-I-Cm2, questa banda appare a 100 kDa (Figura 3A).

Lo screening di diverse combinazioni di solventi organici ha dimostrato efficienze di estrazione variabi...

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Discussione

L'ITC è stato precedentemente utilizzato per la purificazione non cromatograficadell'ELP 19; tuttavia, può essere un metodo che richiede tempo e richiede bassa produttività. Nei metodi sopra descritti, descriviamo un approccio per la purificazione rapida di una proteina di fusione ELP-I-Cm2, dimostrando come il metodo di estrazione-precipitazione a base di solventi organici possa essere utilizzato efficacemente per la purificazione di una vasta gamma di fusioni EL...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'Istituto per la Ricerca sul Cancro della Purdue University e il programma NIH CCSG (CA23168) per il supporto a questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-MercaptoetanoloBio-Rad161-0710Componente SDS-PAGE
30% Acrilammide/Bis-acrilammideTCIA3218Componente SDS-PAGE
AcetoneFisher ScientificA949Solvente organico
AcetonitrileFisher ScientificA996Solvente organico
AmpicilinaBio-Oro BiotecnologiaA-301-25Antibiotico
APS (Persolfato di Ammonio)Bio-Rad1610700Componente SDS-PAGE
ButanoloFisher ScientificL13171Solvente organico
EDTABioreagenti FisherBP118-500Componente del buffer di lisi
EtanoloDecon LabsUN1170Solvente organico
Acetato di etilFisher ScientificE195Solvente organico
GliceroloProdotti di Ricerca InternazionaleG22020-0.5Componente Media di Terrific Broth (TB)
Acido cloridricoFisher ScientificA144SI-212Componente del buffer di lisi
Tinta istantanea CoomasieAbcamab119211Componente SDS-PAGE
IPTGBio-Oro Biotecnologia12481C25Componente di espressione proteica
IsopropanoloFisher ScientificA451-1Solvente organico
K2HPO4 (Monobasico di fosfato di potassio)Scienza dei Wards470302-246Parte 2 Componente Buffer
KH2PO4 (Dibasico fosfato di potassio)Scienza dei Wards470302-254Parte 2 Componente Buffer
L-ProlineProdotti di Ricerca InternazionaleP5200-500.0Componente Media di Terrific Broth (TB)
LisozimaBio-Oro BiotecnologiaL-040-1Componente del buffer di lisi
MetanoloFisher ScientificA452Solvente organico
Buffer di campione nativoBio-Rad161-0738Componente SDS-PAGE
Scala delle proteineBio-Oro BiotecnologiaP008-500Componente SDS-PAGE
Tampone a gel risolutivoBio-Rad1610798Componente SDS-PAGE
Sodim Dodecil Solfato (SDS)Thermo ScientificJ18220-36Componente SDS-PAGE
Idrossido di sodioFisher ScientificS318-500Componente del buffer di lisi
Buffer a gel impilanteBio-Rad1610799Componente SDS-PAGE
TEMEDBio-Rad1610801Componente SDS-PAGE
Tris BaseBioreagenti FisherBP-152Componente del buffer di lisi
TriptoneProdotti di Ricerca InternazionaleT60065-1000.0Componente Media di Terrific Broth (TB)
Estratto di lievitoProdotti di Ricerca InternazionaleY20025-1000.0Componente Media di Terrific Broth (TB)

Riferimenti

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