Purificazione efficiente dei polipeptidi simili all'elastina (ELP) da E. coli utilizzando un metodo di estrazione e precipitazione a base di solvente organico

Summary

Questo protocollo descrive un metodo rapido e riproducibile di estrazione e precipitazione a base di solventi organici per purificare polipeptidi simili all'elastina (ELP) da Escherichia coli, offrendo un'alternativa potenzialmente scalabile ai metodi convenzionali di purificazione ELP.

Abstract

I polipeptidi simili all'elastina (ELP) sono biopolimeri ingegnerizzati costruiti a partire da sequenze ripetitive di pentapeptidi che imitano motivi presenti nella tropoelastina dei mammiferi. Le loro caratteristiche uniche li rendono candidati ideali per una vasta gamma di applicazioni biomediche, che vanno dalla somministrazione di farmaci e geni all'ingegneria tissutale e all'imaging molecolare mirato. Gli approcci convenzionali di purificazione dall'espressione di Escherichia coli (E. coli) possono essere inefficaci per la ELP a causa della formazione di corpi di inclusione. Altri metodi, come il ciclo di transizione inverso (ITC), utilizzano le proprietà a bassa temperatura critica della soluzione (LCST) dell'ELP per separarla da contaminanti come i lipopolisaccaridi (LPS), ma tipicamente richiedono molteplici fasi di riscaldamento e raffreddamento che richiedono molto tempo e possono portare a recuperi bassi a seconda della sequenza, della concentrazione e del peso molecolare del costrutto ELP. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di estrazione-precipitazione a base di solventi organici che sfrutta l'idrofobia intrinseca dell'ELP per consentire una purificazione rapida, robusta e ampiamente applicabile direttamente dai pellet di cellule di E. coli . Questo metodo utilizza solventi organici polari per aiutare nella disgregazione cellulare e solubilizzare selettivamente l'ELP in un unico passaggio. Una successiva fase di precipitazione rimuove efficacemente solventi organici residui, impurità a basso peso molecolare ed endotossine, producendo ELP altamente puro con livelli di LPS inferiori a 1 EU/mL in meno di 3 ore. I dati della microscopia a forza atomica suggeriscono che le proteine di fusione ELP-purificate in questo modo possono auto-assemblarsi in strutture inverse simili a micelle, mantenendo la funzione delle proteine di fusione. Questo metodo di purificazione rapida offre ai ricercatori un modo semplice e potenzialmente scalabile per purificare l'ELP, creando nuove possibilità per l'utilizzo dell'ELP e delle loro proteine di fusione come mattoni flessibili per applicazioni materiali e biomediche.

Introduction

I polipeptidi simili all'elastina (ELP) sono biopolimeri composti da motivi ripetuti (VPGXG)ⁿ 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Il residuo ospite X nell'unità pentapeptidica può essere qualsiasi amminoacido diverso dalla prolina. Le variazioni in X possono essere utilizzate per regolare l'idrofobicità, il comportamento della transizione termica e le c....

Protocol

1. Preparazione dei materiali

1. Ceppo batterico: Utilizzare cellule chimicamente competenti di Escherichia coli BL21(DE3) come ospite di espressione.
   NOTA: Sono stati selezionati per la loro elevata efficienza di trasformazione e l'idoneità alla produzione di proteine ricombinanti.
2. Plasmide di espressione: Utilizzare il vettore pET21(+) che codifica la proteina di fusione ELP-I-Cm2 con resistenza^{all'ampicillina 9}. Acquista il vettore plasmide da addgene. Inserire il gene Cm2 usando il sito BsrG I all'estremità dell'inteina.
   NOTA: La sequenza di DNA plasmidico ....

Results

Dopo aver affrontato le fasi finali del protocollo, il passo successivo è la visualizzazione dell'esito estrazione-precipitazione tramite analisi SDS-PAGE e colorazione blu di Coomassie. Quando c'è una fase di lisi prima dell'estrazione organica, dovrebbe essere evidente una banda ELP prominente. Nel caso di ELP-I-Cm2, questa banda appare a 100 kDa (Figura 3A).

Lo screening di diverse combinazioni di solventi organici ha dimostrat.......

Discussion

L'ITC è stato precedentemente utilizzato per la purificazione non cromatografica^{dell'ELP 19}; tuttavia, può essere un metodo che richiede tempo e richiede bassa produttività. Nei metodi sopra descritti, descriviamo un approccio per la purificazione rapida di una proteina di fusione ELP-I-Cm2, dimostrando come il metodo di estrazione-precipitazione a base di solventi organici possa essere utilizzato efficacemente per la purificazione di una vasta gamma di fusioni EL.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanolo	Bio-Rad	161-0710	Componente SDS-PAGE
30% Acrilammide/Bis-acrilammide	TCI	A3218	Componente SDS-PAGE
Acetone	Fisher Scientific	A949	Solvente organico
Acetonitrile	Fisher Scientific	A996	Solvente organico
Ampicilina	Bio-Oro Biotecnologia	A-301-25	Antibiotico
APS (Persolfato di Ammonio)	Bio-Rad	1610700	Componente SDS-PAGE
Butanolo	Fisher Scientific	L13171	Solvente organico
EDTA	Bioreagenti Fisher	BP118-500	Componente del buffer di lisi
Etanolo	Decon Labs	UN1170	Solvente organico
Acetato di etil	Fisher Scientific	E195	Solvente organico
Glicerolo	Prodotti di Ricerca Internazionale	G22020-0.5	Componente Media di Terrific Broth (TB)
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Componente del buffer di lisi
Tinta istantanea Coomasie	Abcam	ab119211	Componente SDS-PAGE
IPTG	Bio-Oro Biotecnologia	12481C25	Componente di espressione proteica
Isopropanolo	Fisher Scientific	A451-1	Solvente organico
K2HPO4 (Monobasico di fosfato di potassio)	Scienza dei Wards	470302-246	Parte 2 Componente Buffer
KH2PO4 (Dibasico fosfato di potassio)	Scienza dei Wards	470302-254	Parte 2 Componente Buffer
L-Proline	Prodotti di Ricerca Internazionale	P5200-500.0	Componente Media di Terrific Broth (TB)
Lisozima	Bio-Oro Biotecnologia	L-040-1	Componente del buffer di lisi
Metanolo	Fisher Scientific	A452	Solvente organico
Buffer di campione nativo	Bio-Rad	161-0738	Componente SDS-PAGE
Scala delle proteine	Bio-Oro Biotecnologia	P008-500	Componente SDS-PAGE
Tampone a gel risolutivo	Bio-Rad	1610798	Componente SDS-PAGE
Sodim Dodecil Solfato (SDS)	Thermo Scientific	J18220-36	Componente SDS-PAGE
Idrossido di sodio	Fisher Scientific	S318-500	Componente del buffer di lisi
Buffer a gel impilante	Bio-Rad	1610799	Componente SDS-PAGE
TEMED	Bio-Rad	1610801	Componente SDS-PAGE
Tris Base	Bioreagenti Fisher	BP-152	Componente del buffer di lisi
Triptone	Prodotti di Ricerca Internazionale	T60065-1000.0	Componente Media di Terrific Broth (TB)
Estratto di lievito	Prodotti di Ricerca Internazionale	Y20025-1000.0	Componente Media di Terrific Broth (TB)